CN103304605B - 从胡芦巴中分离制备黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从胡芦巴中分离制备黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法。该发明采用高速逆流色谱（HSCCC）分离技术，对胡芦巴中牡荆素，异牡荆素等同分异构体，以及与其极性相近的土大黄苷、脱氧土大黄苷和丹叶大黄素等二苯乙烯苷类化合物类进行了分离制备，有效缩短了分离时间，克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点。该方法工艺简单，重现性好，分离效率高，所得单体含量均高于96.0%，符合一类植物新药和标准对照品要求，适用于医药、标准物质、保健食品和保健药物等的工业化生产。

Description

从胡芦巴中分离制备黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种天然药物的分离制备方法，具体涉及一种从胡芦巴中分离制备黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法。

背景技术

胡芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）是豆科蝶形花亚科胡芦巴属的一种一年生草本植物，其干燥成熟种子作为常用中药被收入《中华人民共和国药典》。研究表明，胡芦巴中含有大量的黄酮类活性物质，具有降血糖、降血脂和抗氧化等作用。二苯乙烯苷类化合物又称芪多酚，具有降血脂、抗衰老、抑制肿瘤等多种生理活性与药用价值。随着黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物相关药理活性的深入开展及其药用产品开发的兴起，使得对高纯度黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的需求也逐渐增大，因此，研究从胡芦巴植物中快速分离制备高纯度黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法具有重要的意义。各化合物结构式如下：

目前，有关从胡芦巴植物黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物分离的现有的研究报道大多采用传统柱色谱法和萃取法，如公开号为CN101195646A的中国专利应用乙醇提取，乙酸乙酯反复萃取，制得含量大于55%的二苯乙烯苷类化合物，公开号为CN102579557A的中国专利公开了利用聚酰胺柱色谱法和萃取法分离制备红芪总黄酮的方法，公告号为CN1060481的中国专利通过萃取法和硅胶柱层析法从中药何首乌乙酸乙酯萃取部位分离得二苯乙烯苷类化合物，纯度可达98%。但是，由于无法避免的树脂残留物、树脂原料安全性隐患等问题，国家药监局已经对应用于保健食品的利用吸附树脂分离纯化的生产工艺作出了相应的限制和规定，此外，上述方法存在样品组分死吸附严重，对结构相似，极性相近的化合物分离困难，化合物纯度低等不足。因此，的传统柱层析等方法在医药及保健食品工业中的实际生产应用方面具有一定的局限性。由于胡芦巴中各目标成分极性极为相近，现有专利报道的传统柱色谱法和萃取法难于对其进行高效分离，所需周期长，产品纯度低，样品损失较多，有机试剂消耗量大。

高速逆流色谱(high-speed couter-current chromatography，HSCCC)是一种不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，其克服了固相载体对样品的吸附而产生的损失、变性等缺点，并可以在短时间内实现高效制备性分离，因而在植物有效成分的分离与制备方面得到了广泛的应用，目前，国内外还未见文献报道胡芦巴中分离制备得到二苯乙烯类化合物，并且未见高速逆流色谱技术应用于胡芦巴植物中黄酮苷和二苯乙烯苷类单体化合物的分离制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种从胡芦巴中分离制备黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法。

本发明提供的制备黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法，包括如下步骤：

1）将胡芦巴提取物用去离子水溶解后先用石油醚萃取，取下层液再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液，再减压蒸干，得到待分离样品A；

2）将体积比为1：5～10：1～4：5～12的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声5～30分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪器的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为25～40℃，以600～950rpm的转速正转10～20min后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入上样溶液A进行高速逆流色谱分离，检测波长为320nm，依次得到流分I₀、I和II，再除去所述流分I₀中的溶剂后得到待分离样品B；

其中，流分I中含有脱氧土大黄苷；

流分II中含有丹叶大黄素；

所述上样溶液A为将步骤1）所得待分离样品A溶于所述流动相而得；

3）将溶剂体系a或b混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声5～30分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪器的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为25～40℃，以600～950rpm的转速正转10～20min后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入上样溶液B进行高速逆流色谱分离，检测波长为254nm，依次得到流分III、IV、V和VI；

其中，溶剂体系a由体积比为9-10：10的乙酸乙酯和水组成；

溶剂体系b由体积比为9-10：0-1：10的乙酸乙酯、醇和水组成；所述醇为甲醇或正丁醇，且所述醇的体积不为0；

所述流分III中含有荭草素；

所述流分IV中含有牡荆素；

所述流分V中含有土大黄苷；

所述流分VI中含有异牡荆素；

所述上样溶液B为将步骤2）所得待分离样品B溶于所述流动相而得。

上述方法的步骤1）减压蒸干步骤中，温度为50～80℃，具体为60℃或70℃或60-70℃或50-70℃，压力为0.05～0.08MPa，具体为0.07MPa。

所述胡芦巴提取物为用乙醇水溶液从胡芦巴的种子中提取，50℃～70℃下减压干燥得到。

所述乙醇水溶液的质量百分浓度为60-95%，具体为75%；

所述乙醇水溶液与胡芦巴种子的用量比为5-10mL：1g，具体为8mL：1g；

所述提取为加热回流提取或微波提取或超声提取；

所述加热回流提取中，温度为50-90℃；次数为1-3次，每次的提取时间均为1-2小时；

所述微波提取步骤中，功率为150-600W，具体为500W；次数为1-3次；提取时间为60-120s，具体为90s；

所述超声提取步骤中，超声功率为100-150W，具体为120W；温度为70-80℃；次数为1-3次，每次的提取时间均为1-2小时；

制备所述胡芦巴提取物中，所述提取步骤之前，还将胡芦巴的种子切割或粉碎后过40-60目筛。

所述步骤2）中，所述正己烷的体积份数具体可为1份；

所述乙酸乙酯的体积份数具体可为5份、6份、7份、8份、10份、5-8份、6-10份、5-7份、5-6份、6-8份、7-8份或7-10份；

所述甲醇的体积份数具体可为1份、2份、3份、4份、1-3份、2-4份、3-4份、2-3份或1-2份；

所述水的体积份数具体可为5份、8份、9份、10份、12份、5-10份、5-9份、8-12份、8-10份、10-12份、8-9份或9-12份；

所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比具体可为1：5：1：5、1：6：3：10、1：7：2：8、1：8：4：12、1：10：2：9、1：（5-8）：（1-4）：（5-12）或1：（6-10）：（1-5）：（5-12）；

所述待分离样品A与流动相的用量比为50～300mg：5～15mL；

所述固定相的流速为10-30ml/min，具体为30ml/min；

所述600～950rpm的转速具体可为700rpm、800rpm、900rpm、700-900rpm或800-900rpm；

分离管的温度具体可为30℃或35℃或30-35℃；

所述上样溶液的流速为1.0～2.5mL/min，具体为1.5mL/min或2mL/min或1.5-2mL/min；

所述流分I₀、I和II的出峰时间依次为50～150min、220～260min和305～340min。

所述步骤3）中，所述溶剂体系b具体可由体积比为（9-10）：（0.5-1）：10的乙酸乙酯、甲醇和水组成或由体积比为9：1：10的乙酸乙酯、正丁醇和水组成；

所述待分离样品B与流动相的用量比为50～300mg：5～15mL；

所述上样溶液的流速为1.0～2.5mL/min；

所述流分III、IV、V和VI的出峰时间依次为120～140min、150～175min、190～220min、240～260min；

上述方法中，所得流分I、II和V为二苯乙烯苷类化合物，III、IV和VI为黄酮类化合物。

胡芦巴种子中所含的黄酮苷类化合物结构相似，极性相近，并且与所含的部分二苯乙烯苷类化合物的极性相近，传统的柱色谱和制备液相色谱难于对两类化合物进行高效分离。而本发明提供的制备方法，与现有技术相比，具有以下优点：

1．本发明采用高速逆流色谱（HSCCC）分离技术，对胡芦巴中牡荆素，异牡荆素等同分异构体，以及与其极性相近的土大黄苷进行了分离制备，有效缩短了分离时间，克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点。

2．本发明采用（HSCCC）分离技术，该方法工艺简单，重现性好，分离效率高，所得单体含量均高于96.0%，符合一类植物新药和标准对照品要求，适用于医药、标准物质、保健食品和保健药物等的工业化生产。

附图说明

图1中A和B分别为待分离样品A和待分离样品B的高效液相色谱（HPLC）图；其中，Fraction I、Fraction II、Fraction III、Fraction IV、Fraction V和Fraction VI分别为流分“I”（脱氧土大黄苷）、流分“II”（丹叶大黄素）、流分“III”（荭草素）、流分“IV”（牡荆素）、流分“V”（土大黄苷）、流分“VI”（异牡荆素）的HPLC图。

图2为第一次高速逆流色谱（HSCCC）图；

图3为第二次HSCCC图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

下述实施例中均采用HPLC法对各流分进行纯度检测（峰面积归一法），其色谱条件为：Eclipse XDB C18柱(250mm×4.6mm，i.d.5μm)；

流动相：甲醇-水溶液；

梯度洗脱程序具体如下：

0分钟起至10分钟止，流动相为甲醇的质量百分含量为30-40%的甲醇水溶液；

11分钟起至25分钟止，流动相为甲醇的质量百分含量为40-50%的甲醇水溶液；

26分钟起至30分钟止，流动相为甲醇的质量百分含量为50-80%的甲醇水溶液；

31分钟起至35分钟止，流动相为甲醇的质量百分含量为80%的甲醇水溶液；

流速：1.0mL/min；

流分I、II和V的检测波长均为320nm；

流分III、IV和VI的检测波长为254nm。

实施例1、

1）待分离样品的制备：

取野生或栽培胡芦巴植物的成熟干燥的种子10g切割或粉碎后过40目筛，用100mL质量百分浓度为95%的乙醇水溶液进行提取，提取温度90℃条件下进行加热回流提取3次、每次2h，合并浓缩得到固含量为48%的胡芦巴提取物；

取该胡芦巴提取物先用去离子水溶解，用石油醚萃取10次后，收集下层液再用乙酸乙酯萃取10次，得到乙酸乙酯萃取液，60℃，0.07MPa的条件下减压蒸干，得到待分离样品A510mg，图1-A为待分离样品A的HPLC图；

2）高速逆流色谱分离制备：

应用高速逆流色谱（上海同田生化有限公司）分离制备胡芦巴中脱氧土大黄苷、丹叶大黄素、荭草素、牡荆素、土大黄苷和异牡荆素。

_a、配制溶剂系统为体积比为1：5：1：5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水于分液漏斗中，充分摇动后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声30min，以上相为固定相，下相为流动相；

b、向高速逆流色谱仪器的分离管中以流速为30mL/min泵入固定相，然后使主机以950rpm的转速正向转动20min后，保持分离管温度为40℃，以1.0mL/min的流速泵入流动相至分离管出口端有流动相溢出且色谱工作站基线平稳，转速为950rpm，流速1.0mL/min，检测波长320nm，按照如下公式计算固定相保留率：

固定相保留率计算公式：

保留率=(V_总-V_出)/(V_总-V_环)

V_总：主机分离管路总体积

V_出：系统平衡后流动相推出固定相的体积

V_环：进样环的体积

所得固定相保留率为60.0%。

c、取200mg所述待分离样品A，溶于20mL流动相中得到上样溶液A，由进样阀进样，根据出峰时间50-150min、220～260和305～340min，依次接收流分I₀、I和II（见图2），分别分离得到重结晶后的化合物I（脱氧土大黄苷）19.6mg，II（丹叶大黄素）24.1mg。

经HPLC分析，流分“I”、“II”均为单一色谱峰，纯度分别为98.6%，99.0%（参见图1中Fraction I～II）

挥干流分I₀中的有机溶剂，得待分离样品B136.6mg，图1-B为待分离样品B的HPLC图。

3）第二次高速逆流色谱分离制备

按照该实施例步骤2）的方法，仅将待分离样品A替换为步骤2）所得待分离样品B，相应的，上样溶液A替换为上样溶液B，将高速逆流色谱的溶剂系统替换为体积比为10:10的乙酸乙酯-水，检测波长替换为254nm，对待分离样品B进行第二次高速逆流色谱分离，测得固定相保留率为56.7%。

根据出峰时间120～140min、150～175min、190～220min和240～260min，依次接收流分“III”、“IV”、“V”、“VI”（见图3），分别分离得到重结晶后的化合物III（荭草素）16.2mg,IV（牡荆素）18.6mg,V（土大黄苷）25.8mg,VI（异牡荆素）22.3mg。

经HPLC检测，流分“III”、“IV”、“V”、“VI”的纯度分别为97.5%,96.8%,98.4%,98.7%（见图1中Fraction III～VI）。

对流分“I”～“VI”进行UV、¹H-NMR和¹³C-NMR分析，经结构解析并与文献数据比对，确定流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”、“VI”依次为脱氧土大黄苷，丹叶大黄素，荭草素，牡荆素，土大黄苷和异牡荆素。

具体数据如下：

脱氧土大黄苷(I),无色针状晶体，217,320.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.46(1H,s,5-OH),7.52(2H,d,J=8.8Hz,H-2′,6′),7.09(1H,d,J=16.4Hz,H-α),6.95(1H,d,J=16.4Hz,H-β),6.92(2H,d,J=8.8Hz,H-3,5′),6.76(1H,br.s,H-2),6.59(1H,br.s,H-6),6.36(1H,br.s,H-4),4.81(1H,d,J=7.6Hz,H-1′′),3.77(3H,s,OCH₃),3.75-3.16(6H,m,sugar-H).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:158.98(C-4′),158.90(C-3),158.38(C-5),139.19(C-1),129.57(C-1′),128.17(C-α),127.86(C-2′,6′),126.24(C-β),114.15(C-3′,5′),107.35(C-2),104.84(C-6),102.95(C-4),100.68(C-1′′),77.15(C-5′′),76.72(C-3′′),73.30(C-2′′),69.77(C-4′′),60.72(C-6′′),55.16(-OCH₃).

丹叶大黄素(II),无色针状晶体，217,320.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.22(2H,s,3,5-OH),8.99(1H,s,3′-OH),7.02(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.95(1H,dd,J=2.0,8.3Hz，H-6′),6.90(1H,d,J=16.4Hz,H-α),6.89(1H,d,J=8.4Hz,H-5′),6.80(1H,d,J=16.4Hz,H-β),6.40(2H,d,J=2.04Hz,H-2,6),6.14(1H,br.s,H-4),3.77(3H,s,-OCH₃).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:158.52(C-3,5),147.64(C-4′),146.58(C-3′),139.11(C-1),130.09(C-1′),127.92(C-β),126.51(C-α),118.47(C-2′),112.94(C-6′),112.14(C-5′),104.43(C-2,6),101.93(c-4),55.63(-OCH₃).

荭草素(III)，浅黄色粉，254,270,340.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:13.18(1H,s,5-OH),7.49(1H,dd,J=2.0,8.3Hz,H-6′),7.44(1H,d,J=2.1Hz,H-2′),6.82(1H,d,J=8.2Hz,H-5′),6.59(1H,s,H-3),6.22(1H,s,H-8),4.64(1H,d,J=9.8Hz,H-1′′),4.94-3.20(5H,m,glc-H-2″-6″).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:181.98(C-4),164.04(C-2),162.50(C-7),160.35(C-5),155.96(C-9),149.54(C-4′),145.76(C-3′,5′),121.99(C-1′),119.32(C-6′),115.61(C-5′),114.03(C-2′),104.48(C-8),104.01(C-10),102.37(C-3),98.09(C-6′),81.95(C-5′′),78.83(C-3′′),73.37(C-1′′),70.73(C-2′′),70.64(C-4′′),61.60(C-6′′).

牡荆素(IV)，浅黄色粉末，269,300,330.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:13.18(1H,s,5-OH),10.85(1H,s,7-OH),10.36(1H,s,4′-OH),8.03(1H,d,J=8.8Hz,H-2′,6′),6.89(1H,d,J=8.8Hz,H-3′,5′),6.79(1H,s,H-3),6.28(1H,s,H-6),4.69(1H,d,J=9.8Hz,H-1′′),5.02-3.22(5H,m,glc-H-2″-6″).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:182.08(C-4),163.91(C-2),162.52(C-7),161.15(C-4′),160.24(C-5),155.96(C-9),128.95(C-2′,6′),121.58(C-1′),115.77(C-3′,5′),104.58(C-8),104.02(C-10),102.44(C-3),98.11(C-6),81.83(C-5′′),78.62(C-3′′),73.36(C-1′′),70.79(C-2′′),70.49(C-4′′),61.25(C-6′′).

土大黄苷（V），无色针状晶体，217,320，¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.45(1H,s,5-OH),8.99(1H,s,3′-OH),7.03(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),7.00(1H,d,J=16.3Hz,H-α),6.97(1H,dd,J=2.0,8.3Hz，H-6′),6.90(1H,d,J=8.4Hz,H-5′),6.84(1H,d,J=16.3Hz,H-β),6.74(1H,br.s,H-2),6.58(1H,br.s,H-6),6.35(1H,br.s,H-4),4.81(1H,d,J=7.6Hz,H-1′′),3.78(3H,s,-OCH₃),3.75-3.15(6H,m,sugar-H).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:158.87(C-5),158.35(C-3),147.73(C-4′),146.57(C-3′),139.17(C-1),129.99(C-1′),128.56(C-β),126.09(c-α),118.59(C-6′),112.98(C-2′),112.10(C-5′),107.25(C-2),104.88(C-6),102.89(C-4),100.67(C-1′′),77.12(C-5′′),76.71(C-3′′),73.30(C-2′′),69.76(C-4′′),60.72(C-6′′),55.63(-OCH₃).

异牡荆素(VI)，浅黄色粉末，269,330.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:13.56(1H,s,5-OH),10.58(1H,s,7-OH),10.38(1H,s,4′-OH),7.94(2H,d,J=8.8Hz,H-2′,6′),6.93(1H,d,J=8.8Hz,H-3′,5′),6.79(1H,s,H-3),6.52(1H,s,H-8),4.59(1H,d,J=9.8Hz,H-1′′).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:181.94(C-4),163.48(C-2),163.24(C-7),161.15(C-5),160.24(C-4′),156.18(C-9),128.46(C-2′),121.07(C-1′),115.96(C-6′,5′),108.86(C-6),103.38(C-10),102.77(C-3),93.58(C-8),81.58(C-5′′),78.92(C-3′′),73.01(C-1′′),70.59(C-2′′),70.16(C-4′′),61.46(C-6′′).

实施例2

1）待分离样品的制备

取野生或栽培胡芦巴植物的成熟干燥的种子10g切割或粉碎后过60目筛，在80mL质量百分浓度为60%的乙醇水溶液，提取温度80℃、超声功率为120W的条件下超声提取2次、每次1h，合并浓缩得到固含量为45%的胡芦巴提取物；

取胡芦巴提取物先用去离子水溶解，再用石油醚萃取5次后，收集下层液再用乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯萃取液，50℃、0.08Pa的条件下减压蒸干，得到待分离样品A430mg；

2）高速逆流色谱分离制备：

应用高速逆流色谱（上海同田生化有限公司）分离制备胡芦巴中脱氧土大黄苷、丹叶大黄素、荭草素、牡荆素、土大黄苷和异牡荆素。

按照实施例1步骤2）的a、b和c，仅将步骤a中的溶剂系统替换为体积比为1：6：3：10的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，步骤b中的转速替换为800rpm，柱温替换为30℃，流速替换为2.0mL/min，计算得固定相保留率为51.0%，重结晶后得到脱氧土大黄苷(I)15.0mg，丹叶大黄素(II)19.2mg，待分离样品B(I₀)148.0mg。

经HPLC检测，脱氧土大黄苷、丹叶大黄素的纯度分别为97.7%，98.2%。

3）第二次高速逆流色谱分离制备

按照该实施例步骤2）的方法，仅将待分离样品A替换为步骤2）所得待分离样品B，相应的，上样溶液A替换为上样溶液B，将高速逆流色谱的溶剂系统替换为体积比为10：1：10的乙酸乙酯-甲醇-水，检测波长替换为254nm，对待分离样品B进行第二次高速逆流色谱分离，测得固定相保留率为53.3%。

根据出峰时间120～140min、150～175min、190～220min和240～260min，依次接收流分“III”、“IV”、“V”、“VI”，重结晶后分别得到荭草素14.6mg(III)，牡荆素16.2mg(IV)，土大黄苷19.3mg(V)，和异牡荆素17.4mg(VI).

经HPLC检测，其纯度分别为96.8%，96.2%，97.5%，97.2%。

结构确认数据同实施例1，此处不再赘述。

实施例3

1）待分离样品的制备

取野生或栽培胡芦巴植物的成熟干燥的种子10g切割或粉碎后过40目筛，在50mL质量百分浓度为75%的乙醇水溶液，提取温度70℃、微波功率为500W的条件下微波辅助提取1次、每次90s，合并浓缩得到固含量为51%的胡芦巴提取物；

取该胡芦巴提取物先用去离子水溶解，再用石油醚萃取2次，收集下层液后再用乙酸乙酯萃取2次，得到乙酸乙酯萃取液，70℃，0.07Pa的条件下减压蒸干，得到待分离样品A420mg；

2）高速逆流色谱分离制备：

应用高速逆流色谱（上海同田生化有限公司）分离制备胡芦巴中脱氧土大黄苷、丹叶大黄素、荭草素、牡荆素、土大黄苷和异牡荆素。

（1）脱氧土大黄苷、丹叶大黄素的高速逆流分离制备

按照实施例1步骤2）的a、b和c，仅将步骤a中的溶剂系统替换为体积比为1:7:2:8的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，转速替换为700rpm，柱温替换为35℃，流速替换为2.5ml/min，计算得固定相保留率为49.0%，重结晶后得到流分脱氧土大黄苷(I)14.2mg，丹叶大黄素(II)16.8mg，待分离样品B(I₀)126.0mg。

经HPLC检测，脱氧土大黄苷、丹叶大黄素的纯度分别为96.7%，97.8%。。

3）第二次高速逆流色谱分离制备

按照该实施例步骤2）的方法，仅将待分离样品A替换为步骤2）所得待分离样品B，相应的，上样溶液A替换为上样溶液B，将高速逆流色谱的溶剂系统替换为体积比为10：0.5：10的乙酸乙酯-甲醇-水，检测波长替换为254nm，对待分离样品B进行第二次高速逆流色谱分离，测得固定相保留率为46.0%。

根据出峰时间120～140min、150～175min、190～220min和240～260min，依次接收流分“III”、“IV”、“V”、“VI”，重结晶后得荭草素(III)11.8mg，牡荆素(IV)13.4mg，土大黄苷(V)16.4mg，异牡荆素(VI)14.1mg。

经HPLC检测，其纯度分别为96.4%，96.0%，96.2%，97.6%。

结构确认数据同实施例1，此处不再赘述。

实施例4

1）待分离样品的制备同实施例1步骤1）。

2）高速逆流色谱分离制备：

应用高速逆流色谱（上海同田生化有限公司）分离制备胡芦巴中脱氧土大黄苷、丹叶大黄素、荭草素、牡荆素、土大黄苷和异牡荆素。

按照实施例1步骤2）的a、b和c，仅将步骤a中的溶剂系统替换为体积比为1：8：4：12的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，步骤b中的转速替换为600rpm，柱温替换为25℃，流速替换为2.0mL/min，计算得固定相保留率为46.0%，重结晶后得到脱氧土大黄苷(I)9.6mg，丹叶大黄素(II)12.3mg，待分离样品B(I₀)166.0mg.

经HPLC检测，脱氧土大黄苷、丹叶大黄素的纯度分别为97.4%，97.0%。

3）第二次高速逆流色谱分离制备

按照该实施例步骤2）的方法，仅将待分离样品A替换为步骤2）所得待分离样品B，相应的，上样溶液A替换为上样溶液B，将高速逆流色谱的溶剂系统替换为体积比为9：1：10乙酸乙酯-甲醇-水，检测波长替换为254nm，对待分离样品B进行第二次高速逆流色谱分离，测得固定相保留率为40.0%。

根据出峰时间120～140min、150～175min、190～220min和240～260min，依次接收流分“III”、“IV”、“V”、“VI”，重结晶后分别得到荭草素(III)9.2mg，牡荆素(IV)8.6mg，土大黄苷(V)12.3mg，异牡荆素(VI)15.8mg.

经HPLC检测，其纯度分别为96.6%，97.2%，97.0%,98.4%。

结构确认数据同实施例1，此处不再赘述。

实施例5

1）待分离样品的制备同实施例1步骤1）。

2）高速逆流色谱分离制备：

应用高速逆流色谱（上海同田生化有限公司）分离制备胡芦巴中脱氧土大黄苷、丹叶大黄素、荭草素、牡荆素、土大黄苷和异牡荆素。

按照实施例1步骤2）的a、b和c，仅将步骤a中的溶剂系统替换为体积比为1：10：2：9的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，步骤b中的转速替换为900rpm，柱温替换为30℃，流速替换为1.5mL/min，计算得固定相保留率为56.0%，重结晶后得到脱氧土大黄苷(I)18.8mg、丹叶大黄素(II)21.9mg，待分离样品B(I₀)140.0mg.

经HPLC检测，脱氧土大黄苷、丹叶大黄素的纯度分别为97.4%，98.2%。

3）第二次高速逆流色谱分离制备

按照该实施例步骤2）的方法，仅将待分离样品A替换为步骤2）所得待分离样品B，相应的，上样溶液A替换为上样溶液B，将高速逆流色谱的溶剂系统替换为体积比为9：1：10的乙酸乙酯-正丁醇-水，检测波长替换为254nm，对待分离样品B进行第二次高速逆流色谱分离，测得固定相保留率为50.7%。

根据出峰时间120～140min、150～175min、190～220min和240～260min，依次接收流分“III”、“IV”、“V”、“VI”，重结晶后分别得到荭草素(III)15.2mg，牡荆素(IV)17.6mg，土大黄苷(V)22.3mg，异牡荆素(VI)21.4mg.

经HPLC检测，其纯度分别为97.2%，96.2%，97.8%,98.4%.

结构确认数据同实施例1，此处不再赘述。

Claims (10)

1.一种制备黄酮苷和二苯乙烯苷类化合物的方法，包括如下步骤：

1)将胡芦巴提取物用去离子水溶解后先用石油醚萃取，取下层液再用乙酸乙酯萃取，取上层液得到乙酸乙酯萃取液，再减压蒸干，得到待分离样品A；

2)将体积比为1：5～10：1～4：5～12的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声5～30分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪器的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为25～40℃，以600～950rpm的转速正转10～20min后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入上样溶液A进行高速逆流色谱分离，检测波长为320nm，依次得到流分I₀、I和II，再除去所述流分I₀中的流动相后得到待分离样品B；

其中，流分I中含有脱氧土大黄苷；

流分II中含有丹叶大黄素；

所述上样溶液A为将步骤1)所得待分离样品A溶于所述流动相而得；

3)将溶剂体系a或b混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声5～30分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪器的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为25～40℃，以600～950rpm的转速正转10～20min后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入上样溶液B进行高速逆流色谱分离，检测波长为254nm，依次得到流分III、IV、V和VI；

其中，溶剂体系a由体积比为9-10：10的乙酸乙酯和水组成；

溶剂体系b由体积比为9-10：0-1：10的乙酸乙酯、醇和水组成；所述醇为甲醇或正丁醇，且所述醇的体积不为0；

所述流分III中含有荭草素；

所述流分IV中含有牡荆素；

所述流分V中含有土大黄苷；

所述流分VI中含有异牡荆素；

所述上样溶液B为将步骤2)所得待分离样品B溶于所述流动相而得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)减压蒸干步骤中，温度为50～80℃，压力为0.05～0.08MPa。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述胡芦巴提取物为用乙醇水溶液从胡芦巴种子中提取得到的物质。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述乙醇水溶液的质量百分浓度为60-95％；或，

所述乙醇水溶液与胡芦巴种子的用量比为5-10mL：1g；或，

所述提取为加热回流提取或微波提取或超声提取。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述乙醇水溶液的质量百分浓度为75％；或，

所述乙醇水溶液与胡芦巴种子的用量比为8mL：1g。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述加热回流提取中，温度为50-90℃；次数为1-3次，每次的提取时间均为1-2小时；或，

所述微波提取步骤中，功率为150-600W；次数为1-3次；提取时间为60-120s；或，

所述超声提取步骤中，超声功率为100-150W；温度为70-80℃；次数为1-3次，每次的提取时间均为1-2小时；或，

制备所述胡芦巴提取物中，所述提取步骤之前，还包括如下步骤：将胡芦巴的种子切割或粉碎后过40-60目筛。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述微波提取步骤中，功率为500W；提取时间为90s；或，

所述超声提取步骤中，超声功率为120W。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述待分离样品A与流动相的用量比为50～300mg：5～15mL；或，

所述固定相的流速为10-30ml/min；或，

所述上样溶液的流速为1.0～2.5mL/min；或，

所述流分I₀、I和II的出峰时间依次为50～150min、220～260min和305～340min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述固定相的流速为30ml/min。

10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述待分离样品B与流动相的用量比为50～300mg：5～15mL；或，

所述上样溶液的流速为1.0～2.5mL/min；或，

所述流分III、IV、V和VI的出峰时间依次为120～140min、150～175min、190～220min、240～260min。