CN106370737A - 一种葫芦巴种子中牡荆素的提取及含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种葫芦巴种子中牡荆素的提取及含量测定方法，所述提取方法中，先使用石油醚对葫芦巴种子进行脱脂，之后浸泡和使用超声提取，极大地增加了提取速率，具有省时、节能、提取效率高的优点。所述含量测定方法采用高效液相色谱对牡荆素的含量进行测定，具有结果准确、操作方便的优点，并能够根据含量测定方法的结果进而优化所述提取方法。

Description

一种葫芦巴种子中牡荆素的提取及含量测定方法
技术领域
本发明属于中药提取工艺技术领域，具体涉及一种葫芦巴种子中牡荆素的提取及含量测定方法。
背景技术
心脑血管系统疾病是人类最为常见的一类疾病，已成为当今世界人口的第一大死因。据WHO预计，心脑血管疾病每年至少造成全球1200万人死亡，已成为人类健康的头号敌人。心血管疾病的高发生率与死亡率，引导了药物研发与生产的方向。
目前牡荆素主要用于治疗心血管疾病，牡荆素纯度一般要求>98％(HPLC)。已有成药注射用牡荆素用于临床医疗。牡荆素主要功能是活血化瘀，理气通脉。用于瘀血阻脉所致的胸痹，症见胸闷憋气，心前区刺痛、心悸健忘、眩晕耳鸣。冠心病心绞痛、高脂血症、心动脉供血不足等症候者。
目前，常采用从草本植株中提取的牡荆素的工艺相对复杂，且成分复杂，纯度很难达到98％(HPLC)，使得提取的牡荆素药效难以达到预期的效果。传统提取方法(如煎煮、回流、浸渍、渗漉等)在提取中药有效成分方面，存在着损失大、周期长、工序多、提取效率不高等缺点。
针对现有技术中的上述不足，申请号为CN201410156823.3的发明专利公开了一种从葫芦巴中提取牡荆素、葫芦巴碱的方法，该方法提取的牡荆素纯度高，但是，该方法存在有效成分损失大、周期长、工序多的缺点。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种葫芦巴种子中牡荆素的提取及含量测定方法。所述提取方法操作简单，具有省时、节能、提取效率高的优点；所述含量测定方法采用高效液相色谱对牡荆素的含量进行测定，具有结果准确、操作方便的优点，并能够根据含量测定方法的结果进而优化所述提取方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种葫芦巴种子中牡荆素的提取方法，包括以下步骤：
A、称取葫芦巴种子，研磨成粉末后使用石油醚进行脱脂处理，脱脂后得到预制药粉；
B、向所述预制药粉中加入体积分数为30-80％的乙醇溶液，浸泡18-30h，得到浸泡液，1g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为50-350mL；
C、对所述浸泡液进行超声提取，超声功率为40-200W；超声提取后过滤取滤液，即得含有牡荆素的乙醇溶液。
本发明中，采用超声提取，超声提取技术是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率，从而极大地增加了提取速率，具有省时、节能、提取效率高的优点。
步骤A中，使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂1-3次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为8-14mL，每次脱脂的时间为20-40min。
为提升脱脂效果，优选的技术方案是，步骤A中，使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂1-3次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为8-14mL，每次脱脂的时间为20-40min。
进一步地，步骤A中，使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂3次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为10mL，每次脱脂的时间为30min。
为保证提取有较高的得率，优选的技术方案是，步骤B中，使用体积分数为70％的乙醇溶液浸泡预制药粉24小时，1g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为100mL。
步骤C中，超声提取的次数为1-3次：每次超声提取的超声功率为40-200W，每次超声提取的时间为30-120min。
进一步地，步骤C中，超声提取的次数为2次：每次超声提取的超声功率为80W，每次超声提取的时间为60min。发明人发现，超声提取2次的提取效果好于提取1次和3次的效果，故超声提取2次作为最优选的方案。
本发明还提供了一种所述提取方法得到的牡荆素的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定牡荆素含量：所用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(16:84)，检测波长325-355nm。
其中，乙腈-0.1％磷酸水溶液(16:84)表示乙腈和体积分数为0.1％的磷酸水溶液的体积比为16:84。
使用高效液相色谱法测定牡荆素含量之前，还包括标准品检验步骤：采用多组牡荆素标准品，选择与样品测定时同样的色谱条件，得到峰面积和牡荆素进样量的关系和相对平均偏差。此步骤是为得出峰面积和牡荆素进样量的关系，并对实验装置和方法做验证。
优选地，高效液相色谱法中检测波长为340nm；流速为1mL/min；柱温为25℃；含有牡荆素的乙醇溶液的进样量为3μL。
在上述色谱条件下，牡荆素进样量为0.2342-0.5674μg时，牡荆素进样量与峰面积的线性关系良好。
得回归方程y＝33.895x－5.9469，r2＝0.9919；
其中，y为峰面积；x为牡荆素进样量。
需要说明的是，本发明中的牡荆素进样量，是指样品或牡荆素标准品中牡荆素的含量，而样品是指所述提取方法得到的含有牡荆素的乙醇溶液。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种葫芦巴种子中牡荆素的提取及含量测定方法，所述提取方法中，先使用石油醚对葫芦巴种子进行脱脂，之后浸泡和使用超声提取，极大地增加了提取速率，具有省时、节能、提取效率高的优点。所述含量测定方法采用高效液相色谱对牡荆素的含量进行测定，具有结果准确、操作方便的优点，并能够根据含量测定方法的结果进而优化所述提取方法。
附图说明
图1是实施例4中检测波长吸光度图；
图2是实施例4中峰面积和牡荆素进样量的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种葫芦巴种子中牡荆素的提取方法，包括以下步骤：
A、称取葫芦巴种子，研磨成粉末后使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂1次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为14mL，每次脱脂的时间为20min，脱脂后得到预制药粉；
B、向所述预制药粉中加入体积分数为80％的乙醇溶液，浸泡18h，得到浸泡液，1g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为350mL；
C、对所述浸泡液进行超声提取，超声提取的次数为1次：每次超声提取的超声功率为200W，每次超声提取的时间为30min；超声提取后过滤取滤液，即得含有牡荆素的乙醇溶液。
实施例2
一种葫芦巴种子中牡荆素的提取方法，包括以下步骤：
A、称取葫芦巴种子，研磨成粉末后使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂3次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为8mL，每次脱脂的时间为40min，脱脂后得到预制药粉；
B、向所述预制药粉中加入体积分数为30％的乙醇溶液，浸泡30h，得到浸泡液，1g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为50mL；
C、对所述浸泡液进行超声提取，超声提取的次数为3次：每次超声提取的超声功率为40W，每次超声提取的时间为120min；超声提取后过滤取滤液，即得含有牡荆素的乙醇溶液。
实施例3
一种葫芦巴种子中牡荆素的提取方法，包括以下步骤：
A、称取葫芦巴种子，研磨成粉末后使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂2次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为10mL，每次脱脂的时间为30min，脱脂后得到预制药粉；
B、向所述预制药粉中加入体积分数为70％的乙醇溶液，浸泡24h，得到浸泡液，1g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为100mL；
C、对所述浸泡液进行超声提取，超声提取的次数为2次：每次超声提取的超声功率为80W，每次超声提取的时间为60min；超声提取后过滤取滤液，即得含有牡荆素的乙醇溶液。
实施例4
本实施例为牡荆素的含量测定方法，包括以下步骤：
1、检测波长的选择
用同一种浓度(38μg/mL)的牡荆素标准溶液分别在325nm、330nm、335nm、340nm、345nm、350nm、355nm波长段处测量吸光度。由表1和图1可知牡荆素在340nm处吸光度最大，故选340nm为检测波长。
表1检测波长吸光度记录表
波长/nm 325 330 335 340 345 350 355
吸光度 0.2977 0.3120 0.3188 0.3963 0.3134 0.3009 0.2738
2、色谱条件
色谱柱为Phenomenex Luna C18100R柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(16:84)；检测波长为340nm；流速为1mL/min；柱温为25℃；含有牡荆素的乙醇溶液的进样量为3μL。
3、标准品检验
采用多组(2μL，4μL、6μL、8μL、10μL)牡荆素标准品(38.0μg/mL)，选择上述色谱条件，得到峰面积和牡荆素进样量的关系和相对平均偏差。得到结果如表2和图2所示。
表2峰面积和牡荆素进样量的关系表
进样量(μL) 2 4 6 8 10
峰面积 73.272 121.145 189.659 260.492 342.549
表2和图2表明在上述色谱条件下，牡荆素进样量为0.2342-0.5674μg时，牡荆素进样量与峰面积的线性关系良好。
得回归方程y＝33.895x－5.9469，r2＝0.9919；
其中，y为峰面积；x为牡荆素进样量。
4、牡荆素含量测定
根据上述色谱条件和回归方程，即可得到牡荆素含量。
实施例5
本实施例，是对本发明中所述提取方法中重点实验参数的优化选择。
采用实施例4中含量测定方法，使用相同重量的葫芦巴种子作为原料，以最终的峰面积为参考指标，对所述提取方法中重点实验参数的优化选择。
1、提取溶剂浓度对提取效果影响
准确称取预制药粉0.2000g，加入50mL不同体积百分数的乙醇溶液，浸泡24h。超声提取1h(80W)，取上清液注入样品瓶，HPLC法测量各样品的峰面积。结果如表3所示。
表3乙醇浓度对提取效果的影响
乙醇浓度 30％ 40％ 50％ 60％ 70％ 80％
峰面积 45.7 46.8 50.6 54.4 56.5 46.0
上表可看出，以乙醇为提取溶剂，体积分数在30％-80％范围内，提取液的峰面积随着乙醇体积分数的增大，峰面积先增大后减小。在70％时峰面积最大，即牡荆素含量最多，即提取效果最好。
2、乙醇用量对提取效果的影响
准确称取预制药粉0.2000g，加入不同量的70％的乙醇，浸泡24h。用超声仪(80W)超声提取1h，取上清液注入样品瓶，HPLC法测定各样品的峰面积。结果如表4所示。
表4乙醇用量对提取效果的影响
乙醇用量/mL 10 20 30 40 50 60 70
峰面积 88.4 120.9 101.3 105.3 87.7 77.1 65.1
上表可看出，随着乙醇用量的增加，峰面积先增大后减小。在20mL时峰面积最大，即在乙醇用量20mL时，提取出的牡荆素量最多，提取效果最好。此时，每g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为100mL。
3、超声提取的时间对提取效果的影响
准确称取预制药粉0.2000g，加入20mL 70％的乙醇，浸泡24h。用超声仪(80W)超声提取，从30min开始，15min为间隔，分别提取。取上清液注入样品瓶，HPLC法测定各样品的峰面积。结果如表5所示。
表5超声提取的时间对提取效果的影响
提取时间/min 30 45 60 75 90 105 120
峰面积 44.3 45.8 46.8 46.1 45.2 44.5 42.2
从上表可看出，随着超声提取时间的改变，峰面积虽有所改变，但并不显著。在超声提取60min时，峰面积最大提取效果最好。
4、超声提取次数对提取效果的影响
准确称取预制药粉0.2000g，加入20mL 70％的乙醇，浸泡24h，用超声仪(80W)超声提取1h，分别提取1、2、3次。取上清液注入样品瓶，HPLC法测定各样品的峰面积，结果如表6所示。
表6超声提取次数对提取效果的影响
提取次数/次 1 2 3
峰面积 160.4 183.6 167.3
从上表可看出，对供试品分别超声提取1、2、3次，峰面积最大的是提取2次，即超声提取2次时，能够在不破坏牡荆素的情况下提取出更多的牡荆素。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种葫芦巴种子中牡荆素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、称取葫芦巴种子，研磨成粉末后使用石油醚进行脱脂处理，脱脂后得到预制药粉；
B、向所述预制药粉中加入体积分数为30-80％的乙醇溶液，浸泡18-30h，得到浸泡液，1g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为50-350mL；
C、对所述浸泡液进行超声提取，超声功率为40-200W；超声提取后过滤取滤液，即得含有牡荆素的乙醇溶液。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤A中，使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂1-3次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为8-14mL，每次脱脂的时间为20-40min。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤A中，使用石油醚对葫芦巴种子粉末脱脂3次：每次脱脂操作中1g葫芦巴种子粉末对应石油醚的体积为10mL，每次脱脂的时间为30min。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤B中，使用体积分数为70％的乙醇溶液浸泡预制药粉24小时，1g预制药粉对应的乙醇溶液的体积为100mL。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤C中，超声提取的次数为1-3次，每次超声提取的时间为30-120min。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤C中，超声提取的次数为2次：每次超声提取的超声功率为80W，每次超声提取的时间为60min。
7.一种权利要求1-6任一所述提取方法得到的牡荆素的含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定牡荆素含量：所用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(16:84)，检测波长325-355nm。
8.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于，使用高效液相色谱法测定牡荆素含量之前，还包括标准品检验步骤：采用多组牡荆素标准品，选择与样品测定时同样的色谱条件，得到峰面积和牡荆素进样量的关系和相对平均偏差。
9.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于，高效液相色谱法中检测波长为340nm；流速为1mL/min；柱温为25℃；含有牡荆素的乙醇溶液的进样量为3μL。
10.根据权利要求9所述的含量测定方法，其特征在于，所述牡荆素进样量为0.2342-0.5674μg。
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