CN102600221A

CN102600221A - 一种刺五加提取物的制备方法

Info

Publication number: CN102600221A
Application number: CN201210117073XA
Authority: CN
Inventors: 李贺然; 樊洁
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明公开了一种刺五加提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)以刺五加根为原料，放入过量的乙醇中浸泡至少12h，然后进行加热，回流提取1～3h；重复上述操作至少2次，合并提取液，得到刺五加醇提物；(2)取大孔树脂，湿法装柱，将上述刺五加醇提物上样，使其吸附达到饱和，水洗至Molishi反应呈阴性，然后进行乙醇梯度洗脱，收集各段洗脱液；即可得到刺五加提取物。本发明开发了一种刺五加提取物的制备方法，实验发现：当测试样品浓度在100μg/mL时，50％乙醇洗脱部位表现出最强的NO释放抑制活性，抑制率大于95％；当浓度在30μg/mL时，70％乙醇洗脱部位表现出最强的NO释放抑制活性，抑制率大于85％，均高于阳性对照，并且两部分无细胞毒性。

Description

一种刺五加提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种刺五加提取物的制备方法。

背景技术

刺五加为五加科植物Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms.的根、根茎和茎，茎叶、果实均可作药用。又名五加参、刺拐棒，主要分布在我国东北、华北地区，以及朝鲜、日本及俄罗斯等地，在祖国医学中作为药物广泛应用已有悠久的历史。具有益气健脾、补肾安神的功效，用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦。

刺五加根和根茎的主要成分之一总苷为酚苷和黄酮苷类化合物，它是其生物活性成分之一，而且紫丁香苷和刺五加苷E占总苷含量最高。总苷在根和根茎中的含量分别占干药材重量的0.6％～0.9％和0.6％～1.5％。从文献资料上知刺五加苷能改善衰老大鼠免疫功能，延缓免疫衰老；刺五加总皂苷具有改善家兔血液流变性、抑制血栓形成作用，而此作用是通过解聚红细胞聚集性、降低全血黏度完成的；刺五加总皂苷对犬急性心肌缺血有较好的保护作用，此外还有抗疲劳、抗肿瘤及抗炎等作用。

在传统医学著作中记载刺五加具有抗炎作用，国内也有学者研究了刺五加水提物的抗炎作用，指出刺五加水提物可能通过抑制活化巨噬细胞产生的炎症介质发挥其抗炎功效。

目前，市场上可买到的刺五加相关产品有刺五加浸膏、五加参茶、刺五加片、五加参冲剂、刺五加注射液等，这些产品都是刺五加原药的粗提物处理所得，成分复杂，其有效成分含量和质量控制都很模糊，因而难以进行深入的研究。因此，对剌五加的抗炎有效部位进行深入研究，进而开发出新的安全有效的药物，具有广阔的前景。

发明内容

本发明目的是提供一种刺五加提取物的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种刺五加提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)以刺五加根为原料，放入过量的乙醇中浸泡至少12h，然后进行加热，回流提取1～3h；重复上述操作至少2次，合并提取液，得到刺五加醇提物；

(2)取大孔树脂，湿法装柱，将上述刺五加醇提物上样，使其吸附达到饱和，水洗至Molishi反应呈阴性，然后进行乙醇梯度洗脱，收集各段洗脱液；即可得到刺五加提取物。

优选的技术方案，所述步骤(1)中的乙醇为体积浓度50～70％的乙醇。

上述技术方案中，所述步骤(2)中，依次以3倍柱体积10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％乙醇梯度洗脱，收集各段洗脱液；即可得到刺五加提取物。

优选的技术方案，所述刺五加提取物为50％洗脱部位100μg/mL和70％洗脱部位30μg/mL。

优选的技术方案，所述步骤(2)中的大孔树脂为HPD 100大孔树脂。

本发明同时请求保护上述刺五加提取物在制备抗炎药物中的应用。

过量的一氧化氮(NO)的释放是炎症的特征之一，有关研究认为急慢性炎症的发生均与NO有关系。本发明是围绕抗炎新药研究标准，以开发刺五加新药为目的对刺五加中总苷进行工艺纯化以及对所得有效部位和有效成分进行抗炎作用研究。

本发明采用大孔吸附树脂纯化刺五加总苷类有效成分，在此基础上，进一步研究刺五加有效部位及有效成分，以LPS和IFN-γ诱导的单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞炎症模型，通过一氧化氮释放抑制活性实验发现刺五加醇提物上大孔吸附树脂后10％到80％不同浓度乙醇洗脱部位均表现出很强的活性，并且呈剂量依赖性。从中筛选出了两个最好的活性部位：当测试样品浓度在100μg/mL时，50％乙醇洗脱部位表现出最强的NO释放抑制活性，抑制率大于95％；当浓度在30μg/mL时，70％乙醇洗脱部位表现出最强的NO释放抑制活性，抑制率大于85％，均高于阳性对照，并且两部分无细胞毒性。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明开发了一种刺五加提取物的制备方法，先用乙醇提取得到醇提物，再用大孔吸附树脂进行纯化，获得了刺五加提取物，实验发现：当测试样品浓度在100μg/mL时，50％乙醇洗脱部位表现出最强的NO释放抑制活性，抑制率大于95％；当浓度在30μg/mL时，70％乙醇洗脱部位表现出最强的NO释放抑制活性，抑制率大于85％，均高于阳性对照，并且两部分无细胞毒性。

2.本发明采用大孔吸附树脂纯化刺五加总苷类有效成分，具有快速、便捷的优点。

3.本发明的制备方法简单，易于实现，且成本较低，适于推广应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

一种刺五加提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)刺五加的提取

称取刺五加根1000g，放入10L的圆底烧瓶中用8000mL60％乙醇浸泡过夜，用电热套加热使微沸，回流提取2h；重复三次，合并提取液，浓缩至浸膏；

(2)大孔树脂对刺五加醇提物的纯化

取已处理的HPD 100大孔树脂，湿法装柱，将刺五加醇提物以1BV/h的上样速度上样，上样体积为18BV，使其吸附达到饱和，水洗至Molishi反应呈阴性，依次以3倍柱体积10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％乙醇梯度洗脱，收集各段洗脱液，每柱体积经适当稀释后，HPLC法测定其中紫丁香苷和刺五加苷E的量，并浓缩蒸干，称重；结果见下表：

洗脱部位的HPLC含量测定方法

(一)色谱条件：Cosmosil 5C 18-PAQ色谱柱(4.6mm×250mm)；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μl；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱0-8min，88％B；8-20min，88％B-82％B；20-25min，82％B；检测波长203nm，265nm。

(二)标准曲线的绘制：分别称取紫丁香苷、刺五加苷E 2.41mg、3.96mg，用少量乙腈超声溶解，加水定容至50mL；分别吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，2.0，4.0，8.0，10mL至10mL容量瓶中，定容至刻度。分别进样，测定。以紫丁香苷、刺五加苷E进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，作回归曲线。紫丁香苷回归方程为Y＝2E+06X+1247.8，R²＝0.9999，表明紫丁香苷在0.0048-0.4820μg与峰面积呈良好的线性关系；刺五加苷E回归方程为Y＝5E+06X+6984.9，R²＝0.9998，表明刺五加苷E在0.0079-0.7920μg与峰面积呈良好的线性关系。

(三)样品的处理和测定：定量称取各洗脱部位，用流动相超声溶解后，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取待测样品溶液和对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，用外标法计算紫丁香苷和剌五加苷E的浓度。

刺五加洗脱部位的NO释放抑制活性研究

RAW 264.7细胞，调整细胞浓度到8×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔培养板，设立空白对照组，模型对照组，阳性对照组及给药组，每个浓度设3个复孔，5％C02，37℃培养24小时，加入LPS(终浓度为100ng/mL)，IFN-γ(终浓度为0.33ng/mL)，样品DMSO溶液(溶解样品的DMSO相对于培养基的含量小于0.5％)，培养24小时。取上清液100μL，分别加入50μL Griess试剂A[1％的磺胺磷酸溶液(5％)]和Griess试剂B(0.1％的萘基乙烯基二胺)，遮光反应10分钟，用酶联免疫检测仪在570nm下测定吸光度，计算一氧化氮生成抑制率。细胞生存率用MTT法进行测定：剩余细胞再加入25μL MTT(1mg/mL)，培养4小时，弃上清液，加150μLDMS0，放置5分钟，570nm下读取数值。

计算公式如下：

注：细胞存活率低于75％时认为有细胞毒性。

由上述实验发现：当测试样品浓度在100μg/mL时，8个洗脱部位都表现出很强的NO生成抑制活性，特别是10％，30％，50％，60％，70％洗脱部位，抑制率都在90％以上(除了30％洗脱部位，抑制率均高于阳性对照)，但10％，60％洗脱部位有细胞毒性，70％洗脱部位有较强的细胞毒性(细胞存活率为28.69％)。当测试样品浓度在30μg/mL时，10％和30％洗脱部位NO生成抑制率相当，为27％，大于20％和40％洗脱部位NO生成抑制率，50％-80％四个部位随着乙醇浓度的增加，NO抑制率呈递增趋势，70％和80％抑制率都在85％以上(高于阳性对照)，其中80％洗脱部位有细胞毒性。当测试样品浓度在10μg/mL时，10％-40％洗脱部位基本无NO生成抑制活性，50％和60％部位有较弱的抑制活性，70％和80％洗脱部位抑制率达45％，在浓度范围内均无细胞毒性。当测试样品浓度在3μg/mL时，70％洗脱部位NO抑制活性最高，达25％，且无细胞毒性。综上可知，各洗脱部位中50％洗脱部位100μg/mL和70％洗脱部位30μg/mL具有最好的NO生成抑制活性。

Claims

1.一种刺五加提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种刺五加提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的乙醇为体积浓度50～70％的乙醇。

3.根据权利要求1所述的一种刺五加提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，依次以3倍柱体积10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％乙醇梯度洗脱，收集各段洗脱液；即可得到刺五加提取物。

4.根据权利要求3所述的一种刺五加提取物的制备方法，其特征在于：所述刺五加提取物为50％洗脱部位100μg/mL和70％洗脱部位30μg/mL。

5.根据权利要求1所述的一种刺五加提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的大孔树脂为HPD 100大孔树脂。

6.权利要求1所述的一种刺五加提取物在制备抗炎药物中的应用。