CN103239493A - 一种降血糖药物组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种降血糖药物组合物及制备方法,将人参活性组分和刺五加活性组分按比例混合后,加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合。本发明所述的降血糖药物组合物在预防糖尿病、肥胖症及其并发症药物中应用。本发明药物组合物不仅可用于蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制剂和胰岛素增敏剂、治疗各种糖尿病、肥胖症及其它由此引发的并发症。
Description
技术领域
本发明属于中医制药技术领域,本发明提供一种降血糖药物组合物及制备方法。经多次体外蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制实验表明,该组合物具有明显的抑制PTP1B活性,可在制备糖尿病、肥胖症及并发症药物应用。
技术背景
目前临床上常将糖尿病分为胰岛素依赖型(IDDM,Ⅰ型糖尿病)和非胰岛素依赖型(NIDDM,Ⅱ型糖尿病)两类,其中Ⅱ型糖尿病在糖尿病中占90%。WHO预计,由于人口老龄化、肥胖、不健康的饮食以及缺乏运动的生活方式,到2025年,糖尿病患者的数目将由1995年的1.35亿上升为3亿。
Ⅱ型糖尿病的特征是胰岛素敏感组织如骨骼肌、肝、脂肪组织对胰岛素作用的抵抗。虽然其具体机制尚不清楚,但胰岛素信号在其传导通路中的减弱甚至阻断必定是直接关系。PTPases在胰岛素信号通路中多个环节起作用,如将自身磷酸活化的IR去磷酸化,从而降低受体激酶活性;或将IRS-1、IRS-2、Shc等胰岛素受体的底物中蛋白酪氨酸残基至去磷酸化,从而负调控胰岛素作用受体后通路。特定PTPases和胰岛素通路中的酪氨酸激酶间的酶活性不平衡可能是引起Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗的原因。因此,通过寻找选择性作用于该通路中PTPases的抑制剂抑制其活性,加强和延长胰岛素信号,成为越来越受重视的治疗Ⅱ型糖尿病的新途径。
PTP1B选择性抑制剂的研究取得了一定的进展,但大多研究局限于肽类和类肽化合物,例比如根据PTP1B去磷酸化的底物序列设计的抑制剂EEDE(F2PMP)M 、Glu-F2PMP-F2PMP,虽然这些肽类化合物具有较强高的选择性和较强的抑制活性,但它们的不易穿透细胞膜和其肽类磷酸结构使很难成为药物候选化合物。最近,在非肽类PTP1B抑制剂的报道中2-羧甲氧基苯甲酸类化合物对PTP1B有很强的抑制作用,更重要的事,其中(2S)-2-[4′-(2-苄基-苯并呋喃)-3-联苯-4-氧]-3-苯基-丙酸化合物不仅对PTP1B有很强的选择抑制性,还对降低ob/ob小鼠血浆中的葡萄糖和胰岛素水平有显著作用。这是第一例从药理学上直接证明PTP1B抑制剂具有抗糖尿病活性的证据[Malamas, M. S. et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 1293-1310]。
本发明涉及的人参(Panax ginseng)属于五加科,主要生长在东亚,特别是寒冷地区,是亚洲常见药材,用于愈后恢复、增强体力、调节荷尔蒙、降低血糖和控制血压、控制肝指数和肝功能保健等。
本发明涉及的刺五加(Radix Acanthopanacis Senticosl)五加科五加属,主要生长在山坡林中及路旁灌丛中;药圃常有栽培。分布于华中、华东、华南和西南。主要用于抗肿瘤、抗疲劳、降低全血粘度、防止动脉粥样硬化形成等作用。
经检索未见用人参和刺五加活性成分制备降血糖药物的文献报道。
发明内容
本发明提供的一种血糖药物组合物,以人参和刺五加醇提活性成分,其目的是用于治疗糖尿病、肥胖症及并发症疾病。
本发明的另一个目的是提供如上限定的药物组合物在生产用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制剂和胰岛素增敏剂、治疗各种糖尿病、肥胖症及其它由此引发的并发症。
本发明公开的一种血糖药物组合物,主要由以下药物按重量份数比制成的:
人参醇提物40~60、刺五加醇提物60~40。
本发明所述的药物组合物的制备方法,包括以下步骤:
将人参加1~2倍量的50%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得人参醇提物;将人参醇提物经过150μm反相色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集的分离组分利用反相薄层层析检测,成份相同的分离组分合并、浓缩后得到F1至F10十个分离组分。从F1-F10组分中筛选出抑制PTP1B活性最强的F2(IC50=12.5μg/L)组份再经HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 3:7)的分离组分、浓缩后得到人参活性组分。
将刺五加加1~2倍的75%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得刺五加醇提物;将刺五加醇提物溶于1.0-0.6L水中,成混悬液后用3.0-2.0L正己烷萃取,收集水层萃取液、减压浓缩成浸膏。水层浸膏再利用HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 4:6)的分离组分、浓缩后得到刺五加活性组分;
将人参活性组分和刺五加活性组分按比例混合后,加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合。
本发明所述的降血糖药物组合物在预防糖尿病、肥胖症及其并发症药物中应用。
药理学研究表明,本发明的药物组合物的两种基本活性成分具有明显地协同抑制PTP1B活性和降血糖作用。因此,本发明的药物组合物的抑制PTP1B活性及降血糖作用显著优于单独的人参和刺五加的降血糖作用。
本发明药物组合物不仅可用于蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制剂和胰岛素增敏剂、治疗各种糖尿病、肥胖症及其它由此引发的并发症。
另外,也可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液活者低浓度(如1-100 mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体加入助溶剂制成口服给药的溶液剂和悬浮剂。
本发明的积极效果在于:药物组合物的两种基本活性成分能够协同抑制PTP1B活性和降血糖作用,并且抑制PTP1B活性及降血糖作用显著优于单独的人参和刺五加的降血糖作用。本发明药物组合物不仅可用于蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)的抑制剂和胰岛素增敏剂、治疗各种糖尿病、肥胖症及其它由此引发的并发症。
附图说明
图1:为本发明提取物分别对STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影响。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步举例说明,而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下,对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围。
实施例1:
称取人参干燥品300g,加入1~2倍量的50%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得人参醇提物;将人参醇提物经过150μm反相色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集的分离组分利用反相薄层层析检测,成份相同的分离组分合并、浓缩后得到F1至F10十个分离组分。从F1-F10组分中筛选出抑制PTP1B活性最强的F2(IC50=12.5μg/L)组分再经HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 3:7)的分离组分、浓缩后得到人参活性组分。
称取刺五加300g,加入1~2倍的75%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得刺五加醇提物;将刺五加醇提物溶于1.0-0.6L水中,成混悬液后用3.0-2.0L正己烷萃取,收集水层萃取液、减压浓缩成浸膏。水层浸膏再利用HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 4:6)的分离组分、浓缩后得到刺五加活性组分。
实施例2
称取人参干燥品400g,加入1~2倍量的50%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得人参醇提物;将人参醇提物经过150μm反相色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集的分离组分利用反相薄层层析检测,成份相同的分离组分合并、浓缩后得到F1至F10十个分离组分。从F1-F10组分中筛选出抑制PTP1B活性最强的F2(IC50=12.5μg/L)再经HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 3:7)的分离组分、浓缩后得到人参活性组分。
称取刺五加600g,加入1~2倍的75%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得刺五加醇提物;将刺五加醇提物溶于1.0-0.6L水中,成混悬液后用3.0-2.0L正己烷萃取,收集水层萃取液、减压浓缩成浸膏。水层浸膏再利用HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 4:6)的分离组分、浓缩后得到刺五加活性组分。;
实施例3
可以按照药剂学的常规方法,将实施例1或2制得的干粉,按人参醇提物40~60、刺五加醇提物60~40的比例,加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合,制备成各种适用于经胃肠道途径给药的各种常规剂型。如,按照常规方法将如上制得的干粉无菌装入胶囊,既得到胶囊剂型的本发明药物组成物。可能按照制药工业中已知的方法将本发明的药物组合物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂以及溶液剂和悬浮剂。其中优先适用于胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适用于口服给药剂型时,可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素等作为载体或赋形剂。
以下试验例表明本发明药物的药理活性:
试验例1
本发明药物组合物抑制PTP1B活性试验
实验方法:用于筛选的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B是从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白。采用紫外底物 pNPP,观察不同浓度对重组酶的活性抑制,以初步评价化合物的药用效果。PTP1B水解底物pNPP的磷脂得到的产物在410nm处有很强的光吸收。因此可以直接检测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。阳性对照正钒酸钠的IC50为2.0 uM。实验结果如下:
组分 IC50 (μg/ml) |
F1 > 60 |
F2 12.5 |
F3 > 60 |
F4 > 60 |
F5 > 60 |
F6 > 60 |
F7 > 60 |
F8 > 60 |
F9 > 60 |
F10 > 60 |
本发明药物组合物 10.6 |
实验结果显示,当本发明药物组合物的浓度分别为10.6μg/ml时,对PTP1B有50%抑制作用(IC50)。
试验例2
本发明药物组合物分别对STZ致高血糖大鼠降血糖实验
以昆明大鼠40只(雄性),随机分组成空白组、模型组(Diabetic control)、实验组、消渴丸对照组(XKW)。除空白组外,各组禁食不禁水1 d,以STZ(在4 ℃冰浴中用0.05 mol/ml柠檬酸pH4.5溶液配制,立即使用)腹腔注射60 mg/kg,造糖尿病模型。注射后72 h断尾取血测定血糖(测前禁食6 h),血糖值高于11.1 mmol/L用于实验。
实验组分别以药物组合物灌胃(100、200、300 mg/kg);XKW组以消渴丸灌胃(250 mg/kg);空白组、模型组灌胃等体积生理盐水。给药30 d,每天称重、给药一次。末次给药后,断尾取血测定血糖(测前禁食6 h)。实验结果如下:
实验开始前血糖值(mmol/L) 试验结束后血糖值(mmol/L) |
空白组 7.0 8.4 |
模型组 25.6 24.4 |
本发明药物组合物(100mg/kg) 23.1 19.9 |
本发明药物组合物(200mg/kg) 24.7 17.1 |
本发明药物组合物(300mg/kg) 23.9 15.6 |
消渴丸对照组 25.1 14.8 |
实验结果显示,本发明药物组合物的低、中、高剂量组与模型组比较,有显著的降糖效果,其中药物组合物200mg/kg组的降糖效果与消渴丸对照组相当。因此,通过以上数据得到本发明药物组合物有效降血糖剂量为200mg/kg。
试验例3:
本发明药物组合物别对STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影响
实验组分别以本发明药物组合物灌胃(200 mg/kg);模型组灌胃等体积生理盐水。给药30 d,每天称重、给药一次。以上各组在给药30 d内,每天腹腔注射长效人胰岛素1 IU/kg。30 d后,各组大鼠四天内每天分别腹腔注射速效人胰岛素0.05、0.5、1.0、2.5 IU/kg,测定给速效人胰岛素前后的血糖,计算比值。实验结果如下:图1。
实验结果显示,药物组合物在200 mg/kg剂量下,对链脲佐菌素致高血糖大鼠胰岛素敏感性均有改善。
试验例4:
本发明药物组合物分别对STZ致高血糖大鼠体重变化实验
以昆明大鼠45只(雄性),随机分组成空白组、实验组和消渴丸组。实验组分别以本发明药物组合物灌胃(100、200、300 mg/kg); 对照组以消渴丸灌胃(250 mg/kg);空白组灌胃等体积生理盐水。给药30 d,每天称重、给药一次。
实验结果如下:
实验开始前体重(g) 试验结束后体重(g) |
空白组 147 203 |
本发明药物组合物(100 mg/kg) 142 161 |
本发明药物组合物(200 mg/kg) 143 148 |
本发明药物组合物(300 mg/kg) 136 149 |
消渴丸组 148 166 |
实验结果显示,本发明药物组合物200、300mg/kg剂量下与空白组、消渴丸组比较,均有显著的降低体重效果。
试验例5
本发明药物组合物对STZ致高血糖大鼠降血糖作用及其单一成分提取物降糖效果的比较实验
以昆明大鼠60只(雄性),随机分组成空白组、模型组(Diabetic control)、药物组合物组、人参提活性组、刺五加活性组和消渴丸对照组(XKW)。除空白组外,各组禁食不禁水1 d,以STZ(在4 ℃冰浴中用0.05 mol/ml柠檬酸pH4.5溶液配制,立即使用)腹腔注射60 mg/kg,造糖尿病模型。注射后72 h断尾取血测定血糖(测前禁食6 h),血糖值高于11.1 mmol/L用于实验。
实验组分别以药物组合物(200 mg/kg)、人参活性组和刺五加活性组灌胃(200、300、350 mg/kg);XKW组以消渴丸灌胃(250 mg/kg);空白组、模型组灌胃等体积生理盐水。给药30 d,每天称重、给药一次。末次给药后,断尾取血测定血糖(测前禁食6 h)。
实验结果如下:
实验开始前血糖值(mmol/L) 试验结束后血糖值(mmol/L) |
空白组 7.8 8.6 |
模型组 24.6 24.9 |
本发明药物组合物(200 mg/kg) 24.1 15.2 |
人参活性组(200 mg/kg) 25.6 21.3 |
人参活性组(300 mg/kg) 24.3 18.3 |
人参活性组(350 mg/kg) 26.7 17.8 |
刺五加活性组(200 mg/kg) 26.2 19.8 |
刺五加活性组(300 mg/kg) 25.0 19.5 |
刺五加活性组(350 mg/kg) 24.3 18.2 |
消渴丸对照组 26.5 14.2 |
实验结果显示,本发明药物组合物(200 mg/kg)的降糖效果均强于其单一成分不同剂量活性组(200、300、350 mg/kg)。这一结果充分证明人参和刺五加两者具有显著的协同降血糖作用。
实验结果的评价与解释:胰岛素敏感性降低和胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病发病机制的主要因数,而PTP1B的高度表达可引起机体对胰岛素敏感性降低和瘦数抵抗,从而引起2型糖尿病和肥胖症。试验数据显示本发明提取物有显著抑制PTP1B活性(试验例1)。并通过STZ致高血糖大鼠降血糖实验(试验例2),充分肯定了其对DM模型动物的降血糖作用,也提示各组药物均有缓解糖尿病临床多饮、多尿症状的作用特点,进一步通过STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性表明(试验例3),本发明提取物均能改善机体对胰岛素敏感性,提高胰岛素的生物利用度。通过大鼠体重变化试验数据得知,本发明提取物对抑制体重增加有显著效果(试验例4)。并且实验例5表明人参和刺五加两者具有显著的协同降血糖作用。综合上述相关试验数据,表明本发明药物组合物对治疗2型糖尿病、肥胖症及并发症有潜在的实际意义。
Claims (3)
1.一种降血糖药物组合物,主要由以下药物按重量份数比制成的:
人参醇提物40~60、刺五加醇提物60~40。
2. 根据要求1的降血糖药物组合物的制备方法,包括以下步骤:
称取人参干燥品300g,加入1~2倍量的50%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得人参醇提物;将人参醇提物经过150μm反相色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集的分离组分利用反相薄层层析检测,成份相同的分离组分合并、浓缩后得到F1至F10十个分离组分;从F1-F10组分中筛选出抑制PTP1B活性最强的F2(IC50=12.5μg/L)组分经HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 3:7)的分离组分、浓缩后得到人参活性组分;
称取刺五加300g,加入1~2倍的75%乙醇浸泡1小时,利用超声波提取1至3小时,抽滤并收集滤液;滤液用旋转蒸发仪浓缩,收集浓缩液,放凉,加入2-3倍量水并搅拌,常温静置24小时,析出沉淀,过滤或离心取沉淀,沉淀物置于表面皿中加热,除去乙醇和水,直至无醇味,即得刺五加醇提物;将刺五加醇提物溶于1.0-0.6L水中,成混悬液后用3.0-2.0L正己烷萃取,收集水层萃取液、减压浓缩成浸膏;水层浸膏再利用HP-20大孔色谱,用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱,收集乙醇/水(V/V, 4:6)的分离组分、浓缩后得到刺五加活性组分;
将人参和刺五加活性物按比例混合后,加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合。
3. 权利要求1所述的降血糖药物组合物在预防糖尿病、肥胖症及其并发症药物中应用。
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