CN102153630A - 一种环八肽及其制备方法和在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
具有下述结构式的化合物1,是一类来自短瓣花中的环肽类成分,具有显著的抑制肾系膜细胞株分泌IL-6,MCP-1和IV型胶原蛋白的作用。以该化合物为有效成分的药物组合物,其制备方法及其在制备抗糖尿病性肾病和慢性肾病药物或食品中的应用。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域,涉及一种环八肽化合物,以其为有效成分的药物组合物,其制备方法及其在制备糖尿病性肾病或慢性肾病药物或食品中的应用。
背景技术
肾病防治不容忽视。现代激烈竞争的社会中,生活方式包括饮食方式的改变,致使世界范围内肥胖和糖尿病在增多。控制糖尿病的血糖相对容易,但仍无法阻滞其进一步发展,糖尿病不可避免的并发症病成为其致残和致死的重要原因。糖尿病肾病为糖尿病的并发症之一,临床多见。而糖尿病肾病又是肾衰形成的重要因素,在美国,约44%的终末其肾病源于糖尿病肾病。肾衰患者由于需要肾脏供体或透析,因此经济和社会负担较重。肾科虽小,却有大病。关于肾病的治疗,目前除了一些预防措施如血糖、血压控制外,并没有特效的治疗方法。一些血管紧张素II受体抑制剂、血管紧张素转化酶拮抗剂、免疫抑制剂等在肾病干预中能发挥作用,但其疗效和副作用都有待于进一步改善。虽然糖尿病可导致肾病,但肾病确切的发病机制还不很清楚,目前动物实验或临床上在研究的如肾素阻滞剂、糖基化终产物抑制剂、蛋白激酶 C抑制剂、抗氧化剂以及内皮素A受体拮抗剂等,其疗效还在进一步观察中,其中部分药物因强烈副作用而终止了其临床研究。传统观点认为,糖尿病肾病主要由糖代谢紊乱、脂质代谢紊乱、血流动力学异常以及遗传等非免疫性因素造成的肾脏病变。然而,一项对448例欧洲糖尿病肾病患者的肾组织病理检查发现,糖尿病肾病患者肾组织中炎症细胞数量明显增加。动物试验也发现SD大鼠注射STZ(Ⅰ型糖尿病模型)第2天肾脏巨噬细胞数量已明显增加,并且在肾组织中检测到高表达的IL-6、MCP-1、IL-1β和ICAM-1、VCAM-1等促炎症细胞因子。巨噬细胞浸润及炎症介质表达上调与肾脏细胞外基质的合成增加相关,表明在糖尿病肾病早期肾组织的炎症反应已明显加强。该研究结果提示炎症反应可能参与糖尿病肾病的发生机制。最近,Chow FY等证实,Ⅰ型糖尿病小鼠肾组织中浸润的巨噬细胞促进成纤维细胞增殖和肾脏纤维化,表明炎症细胞可能与糖尿病肾病晚期肾脏纤维化有关。我们最近的研究也证实Ⅰ型糖尿病动物早期肾小球和肾小管中巨噬细胞的数量以及MCP-1、TGF-β1的表达均有增加。并发现糖尿病时体内蓄积的代谢毒素—晚期氧化蛋白产物(AOPPs)能够进一步促进糖尿病动物肾组织中巨噬细胞浸润和MCP-1和TGF-β1表达上调。通过阻断实验表明AOPPs主要通过活化NADPH氧化酶,促进肾组织超氧阴离子生成,从而激活redox敏感的炎症反应,造成糖尿病动物肾脏病变和肾功能进一步恶化。因此肾病发展过程中伴随炎症,以炎症过程为靶点去寻找抗炎药物可能有助于肾病的治疗。细胞外基质如Ⅳ型胶原(Collagen IV)、层粘蛋白(LN)、III型前胶原(PIII)、透明质酸(HA)等不仅是肾脏系膜的主要组分,同时也是肾基底膜的重要成分。然而在胶原成分中,最重要的是IV 胶原蛋白。IV 型胶原是典型的基质胶原,可由活化的肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞、肾小管上皮细胞等合成和分泌。因此IV 型胶原的合成和分泌增多及降解减少是许多肾脏疾病发展、ECM 积聚、终至肾小球硬化和肾间质纤维化的主要原因或重要参与因素之一。抑制IV型胶原的合成或分泌将有助于肾病治疗。
综上,近年的研究进展表明糖尿病肾病和肾病的发生发展是与细胞因子如IL-6, MCP-1等以及细胞外基质如Ⅳ型胶原的过度分泌密切相关。观察药物对高糖诱导的肾系膜细胞的细胞因子和胶原蛋白的影响,已经成为目前研究糖尿病肾病药物的常用方法。
短瓣花(Brachystemma calycinum)系石竹科短瓣花属植物,主要用于风湿骨痛、肝肾疾病、尿白浊等。最近的研究表明全株提取物可以治疗骨病。由于风湿多与抗炎免疫相关,因此从中寻找到抗炎免疫活性物质是可能的。
现有技术中未见有本发明的化合物1的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供新的具有药用价值的化合物1;从短瓣花中提取、分离该类化合物的方法;以该类化合物为有效成分的药物组合物;该发明化合物在制备抗糖尿病性肾病或/和慢性肾病的药物中的应用。
本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的:
具有下述结构式的化合物1:
制备化合物1的方法,取干燥粉碎的短瓣花地上部分,用80%乙醇室温提取三次,每次20升,每次7天。提取物合并,减压浓缩至无醇味,加入适量水后用乙酸乙酯和正丁醇分别等体积萃取三次,得乙酸乙酯萃取部位。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析(200-300目硅胶,硅胶量为样品的15倍),氯仿-甲醇梯度洗脱:98:2,96:4,94:6,92:8,90:10,88:12,86:14,84:16,82:18;每个梯度洗脱体积为3 L;每份接收1000mL, 薄层层析,10%硫酸乙醇显色,根据斑点相同进行合并,得到七个组份,其中组份G经RP-18硅胶柱层析,以5-75%甲醇梯度洗脱,每增加10%为一个梯度,每梯度用2倍柱体积,每个梯度收集3份, 共得到六个组份 G1-G6,其中第七个柱体积洗脱时收集的组份经硅胶真空柱层析,以氯仿-异丙醇(7:1)洗脱,薄层层析检测合并相同组分,其中薄层板上只有经过6 N HCl 110 ℃ 加热水解1小时后,茚三酮试剂才显红色的斑点合并,得化合物1。
一种药物组合物,其中含治疗有效量的化合物1和药学上可接受的载体。
预防和治疗糖尿病性肾病的药物,其中含有治疗有效量的化合物1和药学上可接受的载体。
化合物1在制备抗糖尿病性肾病的药物中的应用。
化合物1在制备抗慢性肾病的药物中的应用。
化合物1在制备保健食品中的应用。
化合物1是从短瓣花中发现的一类具有显著抑制肾系膜细胞促炎症因子(如IL-6、MCP-1)和IV型胶原(Collagen IV)的环肽类化合物,目前尚未见其结构式报道,因此是新物质,其抑制肾系细胞多种促炎症因子和胶原的药理作用也未见过报道。在糖尿病肾病或慢性肾病中具有重要的药用价值。
本发明化合物可以单独直接应用或组合应用,也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用,可以使用不同的药用辅料,制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。对成人来说,给药量每天1-100 mg比较合适。
附图说明:
图1 化合物1抑制高糖诱导的肾系膜细胞促炎症因子测定实验:采用美国ADL公司ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6,MCP-1,Collagen IV表达。图1A为IL-6表达;图1B为MCP-1表达;图1C为Collagen IV表达。
具体实施方式:
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。
实施例1:
化合物1的制备及结构确证:
取干燥粉碎的短瓣花地上部分12公斤,用80%乙醇室温提取三次,每次20升,每次7天。提取物合并,减压浓缩至无醇味,加入适量水后用乙酸乙酯和正丁醇分别等体积萃取三次,得乙酸乙酯萃取部位(42克)。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析(200-300目硅胶,硅胶量为样品的15倍),氯仿-甲醇梯度洗脱:98:2,96:4,94:6,92:8,90:10,88:12,86:14,84:16,82:18;每个梯度洗脱体积为3 L;每份接收1000 mL, 薄层层析,10%硫酸乙醇显色,根据斑点相同进行合并,得到七个组份,其中组份G(8.5克)经RP-18硅胶柱层析,以5-75%甲醇梯度洗脱,每增加10%为一个梯度,每梯度用2倍柱体积,每个梯度收集3份, 共得到六个组份 G1-G6,其中第七个柱体积洗脱时收集的组份经硅胶真空柱层析,以氯仿-异丙醇(7:1)洗脱,薄层层析检测合并相同组分,其中薄层板上只有经过6 N HCl 110℃ 加热水解1小时后,茚三酮试剂才显红色的斑点合并,得化合物1(2.05克)。
化合物1的结构鉴定数据:
JASCO DIP-370型数字式旋光仪;Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪 (KBr压片);VG AUTO Spec-3000及Finnigan MAT 90质谱仪;Bruker DRX-500核磁共振仪,TMS作为内标,δ为ppm,J为Hz。硅胶为青岛海洋化工厂生产;RP-18为日本Daiso公司;Sephadex LH-20为通用公司产品。
化合物1结构式如下所示:
化合物1: 无色晶体; [α]24 D -33 (c 0.20, MeOH); IR (KBr) νmax: 3413, 3309, 3279,1681,1653, 1621 cm-1; 1H and 13C NMR 数据, 见表I; FABMS: m/z 755 [M + H]+ (100), 206 (9); HRESIMS m/z 755.4073 (calcd for [M + H]+ 755.4092)。
化合物1的结构经单晶X-ray衍射分析确证:
表I. 1H (500 MHz) and 13C NMR (125 MHz) Data of 1.
续表I:
续表I:
实施例2:
按实施例1的方法制得化合物1,按常规法加注射用水,精滤,灌封灭菌后可制成注射液。
实施例3:
按实施例1的方法制得化合物1,将其溶于无菌注射用水中,用无菌漏斗过滤,分装,低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。
实施例4:
按实施例1的方法制得化合物1,按常规法配以各种药用辅料可制成片剂:
化合物1组合药物剂型—片剂:
使用化合物1作为药物活性成分,使用几种赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分,按照一定比例配比制成每片含有化合物1药物成分1-100mg的片剂样品,表1给出普通片剂的配方比例。
将一定数量化合物1原料与赋形剂辅料制备成不同剂量片剂制剂:将几种赋形剂辅料与原料药均匀混合,加入1%羟甲基纤维素钠溶液适量制成软料,过筛制粒,湿粒烘干并过筛整粒,加入硬脂酸镁和滑石粉混合均匀后压片即得。
实施例5:
按实施例1的方法制得化合物1,按常规法配以各种药用辅料可制成胶囊剂:
含有化合物1作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备,使用化合物1作为药物活性成分、使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分,按照一定比例配比制成每粒胶囊中含有化合物1药物成分1-100mg的胶囊制剂,表2给出普通胶囊制剂的配方比例。
将一定数量的化合物1与赋形剂辅料制备成胶囊制剂的方法是:将几种赋形剂辅料与化合物1原料药混合均匀,加入1%羟甲基纤维素钠溶液适量,制成湿粒烘干过筛整粒,加入硬脂酸镁混合均匀,插入胶囊制得;或不使用制粒步骤,而直接将化合物1原料药与几种赋形剂辅料混合均匀,过筛后,直接装入胶囊。
实施例6:
本发明化合物1及其与药用辅料组成的药物组合物的抗糖尿病肾病或慢性肾病的药理作用。
化合物1抑制肾系膜细胞株炎症因子测定实验(见图1所示):
采用美国ADL公司ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6,MCP-1, Collagen IV表达。图1A为IL-6表达;图1B为MCP-1表达;图1C为Collagen IV表达。
实验原理:
采用双抗体夹心法测定标本中大鼠系膜细胞培养上清MCP-1 (IL-6、Collagen IV)水平。用纯化的抗-MCP-1(IL-6、Collagen Ⅳ)抗体包被微孔板,制成固相抗体,向包被单抗的微孔中依次加入大鼠MCP-1(IL-6、Collagen IV),再与HRP标记的MCP-1 (IL-6、Collagen IV)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MCP-1、IL-6、Collagen IV呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠MCP-1、IL-6、Collagen IV浓度。
样本处理:
1)细胞培养上清:无菌管收集,2,000 rpm/min,离心20 min。仔细收集上清。分装冻存于-80℃。
2)刮取底壁细胞,总蛋白裂解液裂解,12,000 rpm/min,4℃离心10 min,收集上清,Bradford法测量总蛋白含量。
检测:
操作按试剂盒说明进行:
1)标准品的稀释与加样:酶标包被板设标准品孔,倍比稀释(稀释后各孔加样量都为50 μl)加入标准品MCP-1(IL-6、Collagen IV)。
2)加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品和酶标试剂,其余各骤操作相同)、待测样品孔(样品稀释度为5倍)。轻轻晃动混匀。
3)温育:37℃,30 min。
4)洗涤:弃去板中液体,甩干,洗液洗5次,30秒/次。吸水纸拍干。
5)加酶:每孔加入50 μl酶标记液,空白孔除外。
6)温育:37℃,30 min。
7)洗涤:弃去板中液体,甩干,洗液洗5次,30秒/次。吸水纸拍干。
8)显色:每孔加入底物A、B液各50 μl/孔。37℃,15 min。避光。
9)终止:每孔加入终止液各50 μl/孔。
10)测定:以空白孔调零,酶标仪450nm读吸光度(OD值)。
11)实验重复3次。
结果计算:Curve Expert1.3拟合曲线分析计算样品浓度并以细胞总蛋白含量校正(MCP-1 & IL-6:pg/mg cell protein; Collagen IV:ng/mg cell protein)。结果如图所示。
以上结果说明化合物1在1和10 mM时对高糖诱导的肾系膜细胞株炎症因子IL-6, MCP-1, 胶原蛋白(Collagen IV)均有明显的抑制作用。由于这些细胞因子在糖尿病肾病中被检测到且呈现高表达,因此抑制它们的分泌无疑对糖尿病肾病或肾病的防治具有积极的价值。
Claims (7)
1.具有下述结构式的化合物1,
。
2.制备权利要求1 化合物1的方法,取干燥粉碎的短瓣花地上部分,用80%乙醇室温提取三次,每次20升,每次7天;提取物合并,减压浓缩至无醇味,加入适量水后用乙酸乙酯和正丁醇分别等体积萃取三次,得乙酸乙酯萃取部位,乙酸乙酯萃取物经200-300目硅胶柱层析,硅胶量为样品的15倍,再以氯仿∶甲醇98∶2,96∶4,94∶6,92∶8,90∶10,88∶12,86∶14,84∶16,82∶18的梯度洗脱,每个梯度洗脱体积为3L,每份接收1000mL, 薄层层析,10%硫酸乙醇显色,根据斑点相同进行合并,得到七个组份,其中组份G经RP-18硅胶柱层析,以5-75%甲醇梯度洗脱,每增加10%为一个梯度,每梯度用2倍柱体积,每个梯度收集3份, 共得到六个组份 G1-G6,其中第七个柱体积洗脱时收集的组份经硅胶真空柱层析,以氯仿-异丙醇7:1洗脱,薄层层析检测合并相同组分,其中薄层板上只有经过6 N HCl 110℃ 加热水解1小时后,茚三酮试剂显红色的斑点合并,得化合物1。
3.药物组合物,其中含有治疗有效量的权利要求1的化合物1和药学上可接受的载体。
4.预防和治疗糖尿病性肾病或肾病的药物,其中含有治疗有效量的权利要求1的化合物1和药学上可接受的载体。
5.权利要求1中化合物1在制备抗糖尿病肾病的药物中的应用。
6.权利要求1中化合物1在制备抗慢性肾病的药物中的应用。
7.权利要求1中化合物1在制备保健食品中的应用。
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