CN105418737B - 一种短瓣花环肽a的固相合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法，包括如下步骤：1)合成直链八肽：(1‑1)提供Fmoc‑AA1‑树脂，采用去保护剂脱除Fmoc保护基；(1‑2)在活化剂的存在下，将Fmoc‑AAn‑OH单体氨基酸分别进行酰氯化处理，得到Fmoc‑AAn‑Cl单体氨基酸酰氯；(1‑3)碱性条件下，分别将各Fmoc‑AAn‑Cl单体氨基酸酰氯和树脂上的氨基酸依次进行缩合，得到直链八肽树脂；(1‑4)在切割剂的存在下，使直链八肽树脂上的多肽和树脂分离，得到所述直链八肽；2)采用缩合试剂将所得直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A。本发明提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法的应用。
Description
技术领域
本发明涉及短瓣花环肽A的制备方法，具体涉及一种短瓣花环肽A的固相合成方法和应用。
背景技术
短瓣花环肽A(Brachystemin A)具有显著地抑制肾系膜细胞株分泌IL-6,MCP-1和IV型胶原蛋白的作用，因而在抗糖尿病性肾病和慢性肾病药物或保健食品中具有潜在的应用价值，但是由于其在自然界中的含量有限，并且分离提纯具有较大的难度，无法开展相关的药效学评估。
程永现等人在《植物学报》(2001,43(7):760-765)上首次报道了该天然产物的波谱数据，并将其结构确定为cyclo-(Pro1-Phe2-Leu3-Ala4-Thr5-Pro6-Ala7-Gly8)，其后程永现等人通过X-射线单晶衍射技术，将其结构修正为cyclo-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)(J.Nat.Prod.,2011,74,1392.)，并对该化合物的制备方法、结构谱图及生物活性进行了报道和保护(J.Nat.Prod.,2011,74,1392以及中国专利：201110004661.8)。
在现有的技术中该环八肽是从干燥粉碎的短瓣花地上部分中分离得到的，然而从12公斤干燥粉碎的短瓣花地上部分中仅能2.05g的该化合物，并且需要复杂的纯化工艺，大量的有机溶剂，耗费较长的时间，因此效率较低，不能放大生产，无法满足研究及应用的需求。目前没有其它关于短瓣花环肽A的制备技术。
因此，有必要提供一种短瓣花环肽A的合成方法和应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法和应用。
本发明提供的短瓣花环肽A的固相合成方法使用了氨基酸的活化试剂，能够将氨基酸中的羧基原位快速的转化成高反应活性的酰氯，减少了副反应的发生，提高了反应效率。
第一方面，本发明提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法，所述短瓣花环肽A的结构为环-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，包括如下步骤：
(1)合成直链八肽：
(1-1)提供Fmoc-AA1-树脂，采用去保护剂脱除Fmoc保护基，得到氨基酸树脂，其中，Fmoc为芴基甲氧羰基，AA1为直链八肽C端的第一个氨基酸；
(1-2)在活化剂的存在下，将Fmoc-AAn-OH单体氨基酸分别进行酰氯化处理，得到Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯，其中，AAn为直链八肽C端的第n个氨基酸，n为2～8的自然数，所述活化试剂为光气、双光气和三光气中的至少一种；
(1-3)碱性条件下，按照n取值分别为2到8的顺序，分别将各Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯和树脂上的氨基酸依次进行缩合，每缩合一次后，先采用去保护剂处理缩合所得氨基酸树脂，脱除Fmoc保护基后再进入下一次缩合反应，待全部缩合完成后，得到直链八肽树脂，其中，第一次缩合采用步骤(1-1)的氨基酸树脂；
(1-4)在切割剂的存在下，使直链八肽树脂上的多肽和树脂分离，得到所述直链八肽；
2)采用缩合试剂将所得直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A。
如本文所述的，“Fmoc-AAn-OH”表示氨基酸单体的N端氨基由Fmoc封端保护。
如本文所用，“去保护剂”是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂为Fmoc。
本文所述的光气、双光气、三光气分别为碳酰氯、氯甲酸三氯甲酯、双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)。
优选地，所述步骤(1-1)中，所述直链八肽C端的第一个氨基酸为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)或亮氨酸(Leu)。
优选地，所述步骤(1-1)中，所述直链八肽C端的第一个氨基酸为Gly。
所述的直链八肽中，Pro中的氨基为仲氨基，反应活性较其它氨基酸中的伯氨基低，Phe中的手性碳容易在碱性条件下发生消旋，Thr中游离的羟基可能会参与环化反应，影响产品产率和纯度；本发明优选采用Ala、Gly或Leu作为多肽合成的第一个氨基酸；本发明进一步优选采用Gly作为多肽合成的第一个氨基酸，无手性碳，在环化步骤中不存在消旋的问题，空间位阻较小，能够提高反应效率。
优选地，所述步骤(1-1)中，所述直链八肽C端的第3，4及5位氨基酸为Pro。
Pro通过产生beta-折叠，增加直链八肽发生分子内反应生成环肽的概率，降低发生分子间反应产生二聚体及三聚体等副产物的风险。
优选地，所述步骤(1-1)中，所述树脂为具有羟基的树脂。
本文可以采用的Fmoc-AA1-树脂，可以按行业内常规方法合成，也可直接购买。
本文所述的“Fmoc-AA1-树脂”表示固相载体(树脂)上的羟基与直链八肽C端的第一个氨基酸的C端羧基缩合得到的具有1个氨基酸的固相载体，其中，该氨基酸的N端由Fmoc保护。
进一步优选地，所述步骤(1-1)中，所述树脂为Wang-树脂、TCP树脂、2-Cl-Trt树脂，Rink树脂或HMAP树脂等。
优选地，所述步骤(1-1)中，所述树脂为Wang-树脂，取代值为0.1～1.0mmol/g。
优选地，所述步骤(1-1)中，所述Fmoc-AA1-树脂先采用二氯甲烷进行溶胀，然后再进行脱Fmoc保护处理，但不限于使用二氯甲烷。
优选地，所述步骤(1-1)中，所述去保护剂是哌啶和二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液，其中，哌啶的体积分数为20％，但不限于此。
优选地，所述步骤(1-2)中，所述采用活化剂制备各种Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯的步骤包括：
将Fmoc-AAn-OH单体氨基酸和活化剂溶于惰性溶剂中，0～30℃下加入第一有机碱反应3～10分钟，得到Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯；
其中，以双光气、三光气换算成光气后的摩尔数计算，所述活化剂中总光气的摩尔数为所述Fmoc-AAn-OH单体氨基酸的摩尔数的0.99～2.01倍。
在此优选条件下，所述步骤(1-2)中，所得Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯溶解在反应产物中，所述反应产物除含有Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯外，还含有第一有机碱的盐酸盐沉淀。
进一步优选地，所述步骤(1-2)中，所述活化剂为三光气，所述三光气的摩尔数为所述Fmoc-AAn-OH单体氨基酸的摩尔数的0.33～0.67倍。
进一步优选地，所述步骤(1-2)中，所述惰性溶剂为四氢呋喃(THF)、1,4-二氧六环(二噁烷)、二甘醇二甲醚和1,3-二氯丙烷中的至少一种。
进一步优选地，所述步骤(1-2)中，所述第一有机碱的加入量为Fmoc-AAn-OH单体氨基酸摩尔量的3.5～6倍。
进一步优选地，所述步骤(1-2)中，所述第一有机碱为三甲基吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、二甲基吡啶或2-甲基喹啉。
进一步优选地，所述步骤(1-2)中，将Fmoc-AAn-OH单体氨基酸和活化剂溶于惰性溶剂中，在冰浴或0～4℃下加入第一有机碱反应1～30分钟。
更进一步优选地，所述步骤(1-2)中，将Fmoc-AAn-OH单体氨基酸和活化剂溶于惰性溶剂中，在冰浴或0～4℃下加入第一有机碱反应3～10分钟。
在冰浴或0～4℃的条件下进行氨基酸酰氯化反应，再进入下一步的缩合反应，有利于抑制Pro、Thr、Ala、Leu和Phe的消旋反应。
优选地，所述步骤(1-3)中，每次缩合反应中，各Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯和树脂上的氨基酸进行缩合的步骤包括：
将待缩合的Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯、第二有机碱和氨基酸树脂溶于第二有机溶剂中，惰性气体鼓泡条件下反应0.5～2小时，完成一次缩合反应；
其中，所述Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯的摩尔数为氨基酸树脂取代值总摩尔数的2～8倍；所述第二有机碱为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉和三乙胺中的至少一种。
如本发明所述的，“氨基酸树脂取代值总摩尔数”的计算方法为：比如，某氨基酸树脂的取代值为0.36mmol/g，某反应称取2g该氨基酸树脂，则氨基酸树脂取代值总摩尔数＝0.36mmol/g*2g＝0.72mmol。
如本发明所述的，“氨基酸树脂总取代值”与“氨基酸树脂取代值总摩尔数”可以互换。
优选地，所述步骤(1-3)中，所述待缩合的Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯为步骤(1-2)所得的含Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯的反应产物。
本发明采用的第二有机碱的碱性大于第一有机碱的碱性，第二有机碱能使得酰氯化反应中第一有机碱生成的盐酸盐沉淀溶解，这样，前一步酰氯化反应后无需进行纯化分离，而是直接进行下一步的缩合反应，简化了反应步骤。
进一步优选地，所述步骤(1-3)中，所述第二有机碱的用量为所述Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯摩尔量的6～8倍。
进一步优选地，所述步骤(1-3)中，所述第二有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的至少一种。
进一步优选地，所述步骤(1-3)中，所述惰性气体为氮气和氩气中的至少一种。
进一步优选地，所述步骤(1-3)中，所述缩合反应的反应温度为室温。
由于Pro的氨基为肿胺，反应活性较低，且易发生消旋，常用的多肽酰胺键缩合试剂缩合的效率较低；本发明采用的光气、双光气和三光气中的至少一种作为氨基酸的活化试剂，能够将氨基酸中的羧基原位快速的转化成高反应活性的氨基酸酰氯；所得氨基酸酰氯在碱性条件下，很容易和树脂上脱Fmoc的氨基酸进行缩合反应。
优选地，所述步骤(1-4)中，所述切割剂为TFA/TES/H2O混合溶液，其中，TFA的体积分数为95％，TES的体积分数为2.5％，但不限于此。
优选地，所述步骤(4)中，所述缩合试剂为DMTMM+BF4 -、DMTMM+Cl-，DCC、DIC、HATU、HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、PyBOP、PyAOP、FDP和FDPP中的任意一种或两种。
优选地，所述步骤(4)中，所述缩合试剂为DIEA与DMTMM+BF4 -的混合溶液，DIEA与DMTMM+BF4 -的摩尔比为1.1～2.0:1。
本发明提供的短瓣花环肽A的固相合成方法，先合成直链八肽树脂，再将直链八肽从树脂上切割下来，切割下来的直链八肽C端的第一个氨基酸后作为后续环化反应中的羧基端，由于环化反应中需要在碱性条件下长时间搅拌，环化时羧基端的手性中心容易发生消旋。因此，本发明优选采用Ala、Gly或Leu作为直链八肽C端的第一个氨基酸，可以降低或避免消旋反应的发生。
第二方面，本发明还提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法，所述短瓣花环肽A的结构为环-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，包括如下步骤：S01)合成直链八肽；S01)将所述直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A，其中，所述直链八肽C端的第一个氨基酸为Ala、Gly或Leu。
优选地，所述步骤(S01)中，缩合反应为活泼酯法，采用的酰胺键缩合试剂为DMTMM+BF4 -、DMTMM+Cl-，DCC、DIC、HATU、HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、PyBOP、PyAOP、FDP和FDPP中的任意一种或两种。
优选地，所述步骤(S01)中，缩合反应中采用活化剂将单体氨基酸中的羧基原位转化成单体氨基酸酰氯，然后在碱性条件下，所述单体氨基酸酰氯与树脂上的氨基酸缩合；其中，所述活化剂为光气、双光气和三光气中的至少一种。
优选地，所述步骤(S01)如本发明第一方面所述的步骤(1)所述。
本发明提供的短瓣花环肽A的固相合成方法实现了环八肽Brachystemin A的首次全合成；该方法通过选择了合适的环化位点，先合成直链八肽，然后将直链八肽进行环化，产率较高；在直链八肽的合成中，通过使用BTC作为氨基酸的活化试剂，能够将氨基酸中的羧基原位快速的转化成高反应活性的酰氯，副反应少，在固相合成中具有很高的效率。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面或第二方面所述的短瓣花环肽A的固相合成方法在制备短瓣花环肽A药物中的应用。
本发明提供的短瓣花环肽A的固相合成方法和应用具有如下有益效果：
1)本发明提供的短瓣花环肽A的固相合成方法实现了环八肽Brachystemin A的首次全合成；
2)本发明提供的短瓣花环肽A的固相合成方法，BTC作为氨基酸的活化试剂，能够将氨基酸中的羧基原位快速的转化成高反应活性的酰氯，副反应少，在固相合成中具有很高的效率；
3)本发明提供的短瓣花环肽A的固相合成方法简单易行，可以进行大规模生产，且生产成本低。
附图说明
图1为本发明提供的一种短瓣花环肽A的固相合成方法的流程图；
图2为本发明实施例1制备的直链八肽的1H-NMR图；
图3为本发明实施例1制备的直链八肽的HRMS图；
图4为本发明实施例1制备的Brachystemin A的1H-NMR图；
图5为本发明实施例1制备的Brachystemin A的13C-NMR图；
图6为本发明实施例1制备的Brachystemin A的HRMS图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
各英文缩写释义如下：
DMTMM+BF4-：4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐
DMTMM+Cl-：4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯盐
DCC：N,N'-二环己基碳酰亚胺
DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺
HATU：O-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
BOP：苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
PyAOP：(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
FDP：pentafluorophenyl diphenyl phosphate
FDPP：五氟苯基二苯基磷酸酯
MeOH：甲醇
实施例1
图1为本发明提供的一种短瓣花环肽A的固相合成方法的流程图，图1中Fmoc-AA-小球中，小球表示wang树脂，结合图1，本发明提供了实施例1如下：包括如下步骤：
所述短瓣花环肽A的结构为环-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，其特征在于，包括如下步骤：
1)合成直链八肽，所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-1)溶胀：在一个10mL的固相反应器中加入Fmoc-Gly-Wang(0.36mmol/g，150mg,0.054mmol)树脂以及CH2Cl2(3ml)，溶胀树脂30min，其中，Fmoc为芴基甲氧羰基，Gly为直链八肽C端的第一个氨基酸；
脱保护：抽除CH2Cl2，用20％哌啶/DMF溶液(3ml)脱除Fmoc保护基，10min后，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次，再用无水DMF(3mL)洗涤树脂，得到脱除Fmoc的氨基酸树脂。
(1-2)在活化剂的存在下，将Fmoc-AA2-OH单体氨基酸分别进行酰氯化处理，得到Fmoc-AA2-Cl单体氨基酸酰氯：
同时将三光气(BTC)和Fmoc保护的单体氨基酸(Fmoc-AA2-OH)按0.67:1的摩尔比溶于无水THF(1ml)，在0℃下，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(collidine)(反应立即产生大量沉淀)，反应3min后，再加入DIEA/DMF溶液(10％,v/v,2ml)，沉淀消失，得到含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-AA2-Cl)的反应溶液；
其中，三甲基吡啶的加入量为Fmoc-AA2-OH摩尔量的6倍；DIEA的加入量为Fmoc-AA2-OH摩尔量的8倍；Fmoc-AA2-OH单体氨基酸的摩尔数和步骤(1-1)中氨基酸树脂的总取代值之比为2:1(总取代值的计算方式＝氨基酸树脂的取代值*氨基酸树脂的质量(后续实施例相同)；
(1-3)第一次缩合反应：将步骤(1-2)所得的含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-Ala-Cl)的反应溶液转移到步骤(1-1)所得的脱除Fmoc的氨基酸树脂中，N2鼓泡混匀，室温下，缩合反应0.5h，(用茚三酮试剂或四氯苯醌试剂检测至反应完全)，得到反应产物，所述反应产物中含有氨基酸树脂(具有二肽)，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次后，采用步骤(1-1)中所述的脱保护的方法处理氨基酸树脂，然后进入下一个缩合反应；
后续的缩合反应按照直链八肽从C端到N端的序列依次添加相应的氨基酸单体，步骤参照第一次缩合反应，7次缩合反应后制得含有直链八肽树脂的反应产物，其中，每次缩合反应中，单体氨基酸酰氯的摩尔数(此处的单体氨基酸酰氯的摩尔数等于步骤(1-2)所用的Fmoc-AA2-OH单体氨基酸的摩尔数，即，按步骤(1-2)完全反应计算，下同)和氨基酸树脂的总取代值之比为2:1；所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-4)分别用DMF(3mL)和MeOH(2mL)洗涤步骤(1-3)制备的直链八肽树脂，分别洗涤2次和4次，然后用N2吹干树脂。在0℃下加入TFA/TES/H2O(体积分数：95:2.5:2.5)混合溶液(1.0mL)，升至室温震摇反应4h，将树脂滤除，得粗产物；向粗产物中加入8倍体积的冷乙醚(0℃)，离心收集白色固体，减压干燥，得到直链八肽(39mg)。
图2为本发明实施例1制备的直链八肽的1H-NMR图(核磁共振氢谱，以D2O做溶剂)。
图3为本发明实施例1制备的直链八肽的HRMS图(高分辨质谱，溶剂为MeOH)。如图3所示，质谱结果为：HRMS(ESI)m/z:calcd for C37H57N8O10[M+H]+773.4198,found773.4196。
2)采用缩合试剂将所得直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A：
将步骤(1)制备的直链八肽(39mg)溶于DMF(10ml)中，加入DIEA(19μL,0.11mmol)及缩合试剂(0.1mmol)，得到的反应混合液在室温下搅拌反应72h，减压蒸除溶剂，向得到的白色固体中加入水，搅拌30min，离心收集白色固体，加入少量DMSO/H2O溶解固体产物，用制备型HPLC纯化，收集产物，冷冻干燥，得到产物Brachystemin A(27mg,产率为72％)，其中，缩合试剂为DMTMM+BF4 –。
图4为本发明实施例1制备的Brachystemin A的1H-NMR图(核磁共振氢谱，以C5D5N做溶剂)。如图4所示：1H NMR(500MHz,C5D5N)δ＝10.56(s,1H),8.94(t,J＝6.0Hz,1H),7.94(d,J＝9.5Hz,1H),7.70(d,J＝5.5Hz,1H),7.50(d,J＝7.5Hz,2H),7.32-7.28(m,2H),7.28-7.14(m,3H),5.38(t,J＝4.5Hz,1H),5.22-5.15(m,1H),5.05-4.95(m,3H),4.79(d,J＝8.5Hz,1H),4.62-4.54(m,2H),4.31-4.29(m,1H),3.98(t,J＝9.0Hz,1H),3.83(dd,J＝17.0,6.0Hz,1H),3.45-3.38(m,3H),3.30(t,J＝12.0Hz,1H),3.13(t,J＝8.0Hz,1H),2.31-2.27(m,2H),2.18-2.10(m,1H),2.08-1.96(m,3H),1.93-1.84(m,1H),1.84(d,J＝7.5Hz,3H),1.80-1.75(m,1H),1.56(d,J＝7.0Hz,3H),1.62-1.45(m,2H),1.39(d,J＝6.0Hz,3H),1.33-1.23(m,1H),0.96(d,J＝6.5Hz,3H),0.74(d,J＝6.0Hz,3H)ppm。
图5为本发明实施例1制备的Brachystemin A的13C-NMR图(核磁共振氢谱，以C5D5N做溶剂)。如图5所示：13C NMR(75MHz,C5D5N)δ＝177.2,173.8,173.6,172.3,172.1,171.8,169.7,169.5,138.8,130.0,128.9,127.2,66.5,64.6,64.0,59.6,55.7,53.5,50.1,48.7,47.5,47.1,44.1,43.9,36.5,29.1,28.2,26.3,25.1,24.6,23.8,21.9,21.1,18.8,16.8ppm。
图6为本发明实施例1制备的Brachystemin A的HRMS图(高分辨质谱，溶剂为MeOH)。如图6所示，质谱结果为：HRMS(ESI)m/z:calcd for C37H54N8O9Na[M+Na]+777.3912,found 777.3906。
图4中1H-NMR和图5的13C-NMR表明，本发明中氨基酸在缩合过程没有发生消旋反应；图4中1H-NMR、图5的13C-NMR以及图6中的HRMS表明，本发明中所制备的环八肽与从自然界中分离得到的短瓣花环肽A的化学结构完全一致。
实施例2
本实施例提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法，所述短瓣花环肽A的结构为环-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，包括如下步骤：
1)合成直链八肽，所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-1)溶胀：在一个10mL的固相反应器中加入Fmoc-Gly-Wang(0.1mmol/g，0.108mmol)树脂以及CH2Cl2(3ml)，溶胀树脂30min，其中，Fmoc为芴基甲氧羰基，Gly为直链八肽C端的第一个氨基酸；
脱保护：抽除CH2Cl2，用20％哌啶/DMF溶液(3ml)脱除Fmoc保护基，10min后，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次，再用无水DMF(3mL)洗涤树脂，得到脱除Fmoc的氨基酸树脂。
(1-2)在活化剂的存在下，将Fmoc-AA2-OH单体氨基酸分别进行酰氯化处理，得到Fmoc-AA2-Cl单体氨基酸酰氯：
同时将三光气和Fmoc保护的单体氨基酸(Fmoc-AA2-OH)按0.5:1的摩尔比溶于无水1,4-二氧六环(1ml)，在4℃下，向该溶液中缓慢滴加2-甲基喹啉，反应10min后，再加入三乙胺/DMF溶液(2ml)，得到含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-AA2-Cl)的反应溶液；
其中，三甲基吡啶的加入量为Fmoc-Ala-OH摩尔量的4倍；DIEA的加入量为Fmoc-Ala-OH摩尔量的6倍；Fmoc-AA2-OH单体氨基酸的摩尔数和步骤(1-1)中氨基酸树脂的总取代值之比为4:1；
(1-3)第一次缩合反应：将步骤(1-2)所得的含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-Ala-Cl)的反应溶液转移到步骤(1-1)所得的脱除Fmoc的氨基酸树脂中，N2鼓泡混匀，室温下，缩合反应1h，(用茚三酮试剂或四氯苯醌试剂检测至反应完全)，得到反应产物，所述反应产物中含有氨基酸树脂(具有二肽)，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次后，采用步骤(1-1)中所述的脱保护的方法处理氨基酸树脂，然后进入下一个缩合反应；
后续的缩合反应按照直链八肽从C端到N端的序列依次添加相应的氨基酸单体，步骤参照第一次缩合反应，7次缩合反应后制得含有直链八肽树脂的反应产物，其中，每次缩合反应中，单体氨基酸酰氯的摩尔数和氨基酸树脂的总取代值之比为4:1；所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-4)分别种用DMF(3mL)和MeOH(2mL)洗涤步骤(1-3)制备的直链八肽树脂，分别洗涤2次和4次，然后用N2吹干树脂。在0℃下加入TFA/TES/H2O(体积分数：95:2.5:2.5)混合溶液(1.0mL)，升至室温震摇反应4h，将树脂滤除，得粗产物；向粗产物中加入8倍体积的冷乙醚(0℃)，离心收集白色固体，减压干燥，得到直链八肽。
2)采用缩合试剂将所得直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A：
将步骤(1)制备的直链八肽溶于DMF(10ml)中，加入DIEA(19μL,0.11mmol)及缩合试剂(0.1mmol)，得到的反应混合液在室温下搅拌反应72h，减压蒸除溶剂，向得到的白色固体中加入水，搅拌30min，离心收集白色固体，加入少量DMSO/H2O溶解固体产物，用制备型HPLC纯化，收集产物，冷冻干燥，得到产物Brachystemin A(产率为53％)，其中，缩合试剂为EDCI/HOBt。
实施例3
本发明实施例提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法，所述短瓣花环肽A的结构为环-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，包括如下步骤：
1)合成直链八肽，所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-1)溶胀：在一个10mL的固相反应器中加入Fmoc-Gly-Wang(1mmol/g，0.216mmol)树脂以及CH2Cl2(3ml)，溶胀树脂30min，其中，Fmoc为芴基甲氧羰基，Gly为直链八肽C端的第一个氨基酸；
脱保护：抽除CH2Cl2，用20％哌啶/DMF溶液(3ml)脱除Fmoc保护基，10min后，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次，再用无水DMF(3mL)洗涤树脂，得到脱除Fmoc的氨基酸树脂。
(1-2)在活化剂的存在下，将Fmoc-AA2-OH单体氨基酸分别进行酰氯化处理，得到Fmoc-AA2-Cl单体氨基酸酰氯：
同时将三光气和Fmoc保护的单体氨基酸(Fmoc-AA2-OH)按0.33:1的摩尔比溶于无水二甘醇二甲醚(1ml)，在30℃下，向该溶液中缓慢滴加二甲基吡啶，反应30min后，再加入N-甲基吗啉/DMF溶液(2ml)，得到含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-AA2-Cl)的反应溶液；
其中，三甲基吡啶的加入量为Fmoc-AA2-OH摩尔量的3.5倍；DIEA的加入量为Fmoc-AA2-OH摩尔量的4倍；Fmoc-AA2-OH单体氨基酸的摩尔数和步骤(1-1)中氨基酸树脂的总取代值之比为8:1；
(1-3)第一次缩合反应：将步骤(1-2)所得的含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-Ala-Cl)的反应溶液转移到步骤(1-1)所得的脱除Fmoc的氨基酸树脂中，N2鼓泡混匀，室温下，缩合反应2h，(用茚三酮试剂或四氯苯醌试剂检测至反应完全)，得到反应产物，所述反应产物中含有氨基酸树脂(具有二肽)，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次后，采用步骤(1-1)中所述的脱保护的方法处理氨基酸树脂，然后进入下一个缩合反应；
后续的缩合反应按照直链八肽从C端到N端的序列依次添加相应的氨基酸单体，步骤参照第一次缩合反应，7次缩合反应后制得含有直链八肽树脂的反应产物，其中，每次缩合反应中，单体氨基酸酰氯的摩尔数和氨基酸树脂的总取代值之比为8:1；所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-4)分别种用DMF(3mL)和MeOH(2mL)洗涤步骤(1-3)制备的直链八肽树脂，分别洗涤2次和4次，然后用N2吹干树脂。在0℃下加入TFA/TES/H2O(体积分数：95:2.5:2.5)混合溶液(1.0mL)，升至室温震摇反应4h，将树脂滤除，得粗产物；向粗产物中加入8倍体积的冷乙醚(0℃)，离心收集白色固体，减压干燥，得到直链八肽。
2)采用缩合试剂将所得直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A：
将步骤(1)制备的直链八肽溶于DMF(10ml)中，加入DIEA(19μL,0.11mmol)及缩合试剂(0.1mmol)，得到的反应混合液在室温下搅拌反应72h，减压蒸除溶剂，向得到的白色固体中加入水，搅拌30min，离心收集白色固体，加入少量DMSO/H2O溶解固体产物，用制备型HPLC纯化，收集产物，冷冻干燥，得到产物Brachystemin A(产率为53％)，其中，缩合试剂为HBTU。
实施例4
本发明实施例提供了一种短瓣花环肽A的固相合成方法，所述短瓣花环肽A的结构为环-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，包括如下步骤：
1)合成直链八肽，所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-1)溶胀：在一个10mL的固相反应器中加入Fmoc-Gly-Wang(0.5mmol/g，150mg,0.054mmol)树脂以及CH2Cl2(3ml)，溶胀树脂30min，其中，Fmoc为芴基甲氧羰基，Gly为直链八肽C端的第一个氨基酸；
脱保护：抽除CH2Cl2，用20％哌啶/DMF溶液(3ml)脱除Fmoc保护基，10min后，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次，再用无水DMF(3mL)洗涤树脂，得到脱除Fmoc的氨基酸树脂。
(1-2)在活化剂的存在下，将Fmoc-AA2-OH单体氨基酸分别进行酰氯化处理，得到Fmoc-AA2-Cl单体氨基酸酰氯：
同时将三光气(BTC)和Fmoc保护的单体氨基酸(Fmoc-AA2-OH)按0.67:1的摩尔比溶于无水THF(1ml)，在30℃下，向该溶液中缓慢滴加二甲基吡啶(反应立即产生大量沉淀)，反应3min后，再加入DIEA/DMF溶液(10％,v/v,2ml)，沉淀消失，得到含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-AA2-Cl)的反应溶液；
其中，三甲基吡啶的加入量为Fmoc-AA2-OH摩尔量的6倍；DIEA的加入量为Fmoc-AA2-OH摩尔量的8倍；
(1-3)第一次缩合反应：将步骤(1-2)所得的含有单体氨基酸酰氯(Fmoc-Ala-Cl)的反应溶液转移到步骤(1-1)所得的脱除Fmoc的氨基酸树脂中，N2鼓泡混匀，室温下，缩合反应0.5h，(用茚三酮试剂或四氯苯醌试剂检测至反应完全)，得到反应产物，所述反应产物中含有氨基酸树脂(具有二肽)，用DMF(3mL)洗涤树脂，重复洗涤4次后，采用步骤(1-1)中所述的脱保护的方法处理氨基酸树脂，然后进入下一个缩合反应；
后续的缩合反应按照直链八肽从C端到N端的序列依次添加相应的氨基酸单体，步骤参照第一次缩合反应，7次缩合反应后制得含有直链八肽树脂的反应产物，其中，每次缩合反应中，单体氨基酸酰氯的摩尔数和氨基酸树脂的总取代值之比为2:1；所述直链八肽从C端到N端的序列为：
Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8。
(1-4)分别种用DMF(3mL)和MeOH(2mL)洗涤步骤(1-3)制备的直链八肽树脂，分别洗涤2次和4次，然后用N2吹干树脂。在0℃下加入TFA/TES/H2O(体积分数：95:2.5:2.5)混合溶液(1.0mL)，升至室温震摇反应4h，将树脂滤除，得粗产物；向粗产物中加入8倍体积的冷乙醚(0℃)，离心收集白色固体，减压干燥，得到直链八肽。
2)采用缩合试剂将所得直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A：
采用实施例1的环化方法，不同的是缩合剂分别采用HATU和DMTMM+Cl-，所得短瓣花环肽A产率分别为68％和59％。
此外，本发明还对实施例1的步骤(2)采用了不同摩尔比的DMTMM+BF4 –和DIEA进行环化，各实施例步骤(2)的具体设置对比如下表：
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种短瓣花环肽A的固相合成方法，所述短瓣花环肽A的结构为环-(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，其特征在于，包括如下步骤：
1)合成直链八肽：
(1-1)提供Fmoc-AA1-树脂，采用去保护剂脱除Fmoc保护基，得到氨基酸树脂，其中，Fmoc为芴基甲氧羰基，AA1为直链八肽C端的第一个氨基酸，所述直链八肽C端的第一个氨基酸为丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸；
(1-2)在活化剂的存在下，将Fmoc-AAn-OH单体氨基酸分别进行酰氯化处理，得到Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯，其中，AAn为直链八肽C端的第n个氨基酸，n为2～8的自然数，所述活化试剂为三光气；
(1-3)碱性条件下，按照n取值分别为2到8的顺序，分别将各Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯和树脂上的氨基酸依次进行缩合，每缩合一次后，先采用去保护剂处理缩合所得氨基酸树脂，脱除Fmoc保护基后再进入下一次缩合反应，待全部缩合完成后，得到直链八肽树脂，其中，第一次缩合采用步骤(1-1)的氨基酸树脂；
(1-4)在切割剂的存在下，使直链八肽树脂上的多肽和树脂分离，得到所述直链八肽；
2)采用缩合试剂将所得直链八肽进行环化后得到所述短瓣花环肽A，其中所述直链八肽的C端的第一个氨基酸作为所述环化中的羧基端。
2.如权利要求1所述的短瓣花环肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步骤(1-1)中，所述Fmoc-AA1-树脂取代值为0.1～1.0mmol/g。
3.如权利要求1所述的短瓣花环肽A的固相合成方法，其特征在于，所述采用活化剂制备各种Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯的步骤包括：
将Fmoc-AAn-OH单体氨基酸和活化剂溶于惰性溶剂中，0～30℃下加入第一有机碱反应1～30分钟，得到Fmoc-AAn-Cl单体氨基酸酰氯；
其中，以三光气换算成光气后的摩尔数计算，所述活化剂中总光气的摩尔数为所述Fmoc-AAn-OH单体氨基酸的摩尔数的0.99～2.01倍。
4.如权利要求3所述的短瓣花环肽A的固相合成方法，其特征在于，所述惰性溶剂为四氢呋喃(THF)、二噁烷、二甘醇二甲醚和1,3-二氯丙烷中的至少一种。
5.如权利要求3所述的短瓣花环肽A的固相合成方法，其特征在于，所述第一有机碱为三甲基吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、二甲基吡啶或2-甲基喹啉。
6.如权利要求1所述的短瓣花环肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步骤(1-3)中，每次缩合反应中，各Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯和树脂上的氨基酸进行缩合的步骤包括：
将待缩合的Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯、第二有机碱和氨基酸树脂溶于第二有机溶剂中，惰性气体鼓泡条件下反应0.5～2小时，完成一次缩合反应；
其中，所述Fmoc-AAn-OH单体氨基酸酰氯的摩尔数为氨基酸树脂取代值总摩尔数的2～8倍；所述第二有机碱为N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉和三乙胺中的至少一种。
7.如权利要求6所述的短瓣花环肽A的固相合成方法，其特征在于，所述第二有机溶剂为DMF和NMP中的至少一种。
8.如权利要求1所述的短瓣花环肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述缩合试剂为DMTMM+BF4 -、DMTMM+Cl-，DCC、DIC、HATU、HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、PyBOP、PyAOP、FDP和FDPP中的任意一种或两种。
9.一种如权利要求1所述的短瓣花环肽A的固相合成方法在制备短瓣花环肽A药物中的应用。
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