CN117777231A - 一种液相合成伊特卡肽的方法 - Google Patents
一种液相合成伊特卡肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117777231A CN117777231A CN202211143679.0A CN202211143679A CN117777231A CN 117777231 A CN117777231 A CN 117777231A CN 202211143679 A CN202211143679 A CN 202211143679A CN 117777231 A CN117777231 A CN 117777231A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- arg
- pbf
- ala
- compound
- cys
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 150
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 88
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 61
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 61
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 24
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims abstract description 17
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 152
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 103
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 62
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-Trimethylpyridine Chemical compound CC1=CC(C)=NC(C)=C1 BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 37
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 34
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 claims description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 30
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical group [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 22
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 20
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- HNICLNKVURBTKV-MUUNZHRXSA-N (2r)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-MUUNZHRXSA-N 0.000 claims description 19
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- TYRGLVWXHJRKMT-MRVPVSSYSA-N (2r)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 TYRGLVWXHJRKMT-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims description 16
- GVIXTVCDNCXXSH-CQSZACIVSA-N (2r)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-azaniumylpentanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C GVIXTVCDNCXXSH-CQSZACIVSA-N 0.000 claims description 14
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 14
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical group [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical group [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 12
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 11
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 11
- OFIYNISEFIEQBC-SNVBAGLBSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2r)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoate Chemical compound N([C@H](C)C(=O)ON1C(CCC1=O)=O)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 OFIYNISEFIEQBC-SNVBAGLBSA-N 0.000 claims description 10
- KLBPUVPNPAJWHZ-UUWRZZSWSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-tritylsulfanylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)SC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KLBPUVPNPAJWHZ-UUWRZZSWSA-N 0.000 claims description 10
- IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-acetamido-5-[[amino-(methylcarbamoylamino)methylidene]amino]-n-methylpentanamide Chemical compound CNC(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(C)=O)C(=O)NC IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 10
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical group C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims description 10
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 9
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 8
- ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N n-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide Chemical compound C1=CC2CC1C1C2C(=O)N(O)C1=O ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011736 potassium bicarbonate Chemical group 0.000 claims description 6
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011181 potassium carbonates Nutrition 0.000 claims description 6
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical group [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 4
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Chemical group O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229960004126 codeine Drugs 0.000 claims description 3
- OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N codeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 3
- 239000007821 HATU Substances 0.000 claims description 2
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 claims description 2
- 241000289690 Xenarthra Species 0.000 claims description 2
- KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N [(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-acetyl-6-formyl-3-methoxy-10,13-dimethyl-1,2,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl] acetate Chemical compound C1C[C@@H]2[C@](CCC(OC)=C3)(C)C3=C(C=O)C[C@H]2[C@@H]2CC[C@](OC(C)=O)(C(C)=O)[C@]21C KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N 0.000 claims description 2
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005185 salting out Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 41
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 40
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 27
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 27
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 25
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 22
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 17
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 15
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 11
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N N-chlorosuccinimide Chemical compound ClN1C(=O)CCC1=O JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 3
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 230000002092 calcimimetic effect Effects 0.000 description 2
- VDHAWDNDOKGFTD-MRXNPFEDSA-N cinacalcet Chemical compound N([C@H](C)C=1C2=CC=CC=C2C=CC=1)CCCC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 VDHAWDNDOKGFTD-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 2
- 229960003315 cinacalcet Drugs 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 2
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229920003180 amino resin Polymers 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- ALVPFGSHPUPROW-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl disulfide Natural products CCCSSCCC ALVPFGSHPUPROW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- ANIAZGVDEUQPRI-ZJQCGQFWSA-N etelcalcetide Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CSSC[C@H](N)C(O)=O)NC(C)=O ANIAZGVDEUQPRI-ZJQCGQFWSA-N 0.000 description 1
- 229950006502 etelcalcetide Drugs 0.000 description 1
- 108091022127 etelcalcetide hydrochloride Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N methane;palladium Chemical compound C.[Pd] UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000000819 phase cycle Methods 0.000 description 1
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种液相合成伊特卡肽的方法，包括通过液相法分别合成四肽片段化合物和三肽片段化合物；将所述四肽片段化合物和三肽片段化合物进行液相偶联，得到全保护七肽主链；将所述全保护七肽主链裂解，并用2,2’‑二硫二吡啶进行活化，得到七肽活化中间体；将所述七肽活化中间体与H‑Cys‑OH·HCl键合得到伊特卡肽粗肽，将所述伊特卡肽粗肽经过纯化、转盐，得到伊特卡肽。该方法采用液相合成法，合成成本低，适用于大规模生产，具有非常好的工业化应用前景；合成过程的中间体都能通过沉淀析出或重结晶得到，而无需使用层析柱或HPLC等纯化制备，具有合成操作方便、减少成本的优点；并且，该液相合成所用物料均为常规物料，取材方便、设备要求低。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种液相合成伊特卡肽的方法。
背景技术
伊特卡肽是由AMGEN INC开发的一种新颖的拟钙剂，主要用于慢性肾病成人患者做血液透析治疗的继发性甲状旁腺功能亢进的多肽药物，2017年2月07日在美国上市，商品名为Parsabiv，其用于继发性甲状旁腺机能亢进时在降低甲状旁腺素水平方面与西那卡塞一样好，并且因其可在血液透析后静脉给药，优于现有的标准拟钙剂治疗药西那卡塞。
伊特卡肽的主链由七个D-型氨基酸组成，侧链通过一个二硫键与L-半胱氨酸相连，其肽序如下：
目前，合成伊特卡肽的方法有两类，一类使用树脂的固相合成法，另一类是液相合成法，其中最为广泛的是使用树脂的固相合成法。
(1)固相合成法
该方法一般是固相连接至七肽，然后再选择不同的方法衔接二硫键，也有先构建二硫键的片段肽，再用固相法连接得到全保护肽，树脂选用方面都是Rink Amide、RinkAmide-AM等氨基树脂，如专利CN201810048053、CN201511029990、CN201810472468、CN201910496387、CN201811277081、CN201910886294、CN201910172421、US20170190739A1、EP3875466A1、WO2021109297A1。该类方法直接、简便，能够缩短合成周期，但是使用价格昂贵的树脂，并且投料倍数为2-5倍，大大增加了合成成本，另外，固相合成法在生产上，规模非常受限，难以满足市场需求(伊特卡肽原料药每年需求量超过100Kg)。
(2)液相合成法
专利CN201511030047，采用液相方法合成C末端酰胺化、N末端乙酰化的直链七肽，然后与NCS(化学式为C4H4ClNO2，中文名称为N-氯代丁二酰亚胺)氯化法制备的活性中间体L-Cys(SCl)构建二硫键，得到纯度为77.2％的粗肽，制备纯化后得到纯度98.2％产品。该方法合成成本低，并且得到粗肽的纯度较高，但是，其合成步骤很长，且总收率只有11％，另外，合成过程的中间体H-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2需要用层析柱纯化制备，限制了其合成规模。
专利CN202011034312，采用Cbz保护的氨基酸为原料，通过液相顺序合成全保护的N末端乙酰化的直链七肽，然后与Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu构建二硫键，裂解后的粗肽经过HPLC制备得到产品，总收率为22.9％。该合成策略步骤较短，后处理操作简单，但是合成过程中裸露巯基的7肽中间体需要HPLC纯化制备，全过程需要两次HPLC纯化制备，增加了合成成本，另外，该方法7次采用Pd/C(钯碳)加氢还原的方式脱保护，生产上增加了安全风险。
可以看出，目前现有技术中制备伊特卡肽的工艺路线均繁琐、复杂，且成本高，使生产规模受限。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明在于提供一种伊特卡肽的液相合成方法，以解决工艺路线长、合成成本高、生产规模受限的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种液相合成伊特卡肽的方法，包括以下步骤：
通过液相法分别合成四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；将所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH进行液相偶联，得到全保护七肽主链；将所述全保护七肽主链裂解，并用2,2’-二硫二吡啶进行活化，得到七肽活化中间体；将所述七肽活化中间体与H-Cys-OH·HCl键合得到伊特卡肽粗肽，将所述伊特卡肽粗肽经过纯化、转盐，得到伊特卡肽。
进一步的，具体包括以下步骤：步骤(1)合成一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2；步骤(2)以所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，合成第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；步骤(3)合成第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH；步骤(4)以所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH为原料，通过偶联合成所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；步骤(5)合成二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；步骤(6)以所述二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，合成化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；步骤(7)以所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，合成所述三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；步骤(8)以所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，通过液相偶联，得到所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；步骤(9)将所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2进行裂解处理、并用2,2’-二硫二吡啶进行活化处理，得到所述七肽活化中间体化合物Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；步骤(10)将所述七肽活化中间体化合物Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2与H-Cys-OH·HCl键合得到伊特卡肽粗肽；将所述伊特卡肽粗肽经过反相HPLC纯化、转盐，得到所述伊特卡肽。
进一步的，在步骤(1)中，所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：以化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、(Boc)2O和NH4HCO3为原料，在非质子性溶剂A中，在碱A的作用下反应，得到所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2；其中，所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和(Boc)2O的摩尔比为1:(1.0～2.0)；所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和NH4HCO3的摩尔比为1:(2.0～10.0)；所述非质子性溶剂A为二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、四氯化碳、甲苯、氯仿中的一种或多种；所述非质子性溶剂A优选为二氯甲烷；所述碱A为吡啶、三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、2,4,6-三甲基吡啶中的一种或多种；所述碱A优选为吡啶；所述反应温度为20℃～30℃，反应时间为5h～72h。
进一步的，在步骤(2)中，所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：对所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2进行脱保护处理，得到H-D-Arg(Pbf)-NH2；以化合物Z-D-Ala-OH和所述H-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在非质子性溶剂B中，在偶联剂的作用下进行偶联反应，得到所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；其中，所述化合物Z-D-Ala-OH和H-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:(0.8～1.1)；所述化合物Z-D-Ala-OH和偶联剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；所述非质子性溶剂B为二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿中的一种或多种；所述非质子性溶剂B优选为二氯甲烷；所述偶联剂为化合物A，或化合物A和有机碱的组合物，或化合物A和化合物B的组合物，或化合物A、化合物B和有机碱的组合物；其中，所述化合物A为EDC·HCl、DCC、DIC、HATU、HBTU、TATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，所述化合物B为HOAt、HOBt、Cl-HOBt、Oxyma、HOSu或HONb，所述有机碱为2,4,6-三甲基吡啶、DIPEA、吡啶、三乙胺或N-甲基吗啡；所述偶联剂优选为EDC·HCl/HOAt/2,4,6-三甲基吡啶，更优选地，所述偶联剂的组分摩尔比为EDC·HCl:HOAt:2,4,6-三甲基吡啶＝1:(1.0～2.0):(1.0～2.0)；所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为3h～12h。
进一步的，在步骤(3)中，所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：以化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和HOSu为原料，在非质子性溶剂B中，在缩合剂作用下进行活化反应，得到的中间体Fmoc-D-Arg(Pbf)-OSu溶液，在碱B的作用下与H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O进行偶联反应，得到所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH；其中，所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和HOSu的摩尔比为1:(1.0～1.2)；所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和缩合剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O的摩尔比为1:(1.0～1.2)；所述非质子性溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；所述非质子性溶剂B优选为N，N-二甲基甲酰胺；所述缩合剂为DCC、EDC·HCl、DIC中的一种或多种；所述缩合剂优选为DCC；所述碱B为碳酸氢钠或碳酸钠、碳酸氢钾或碳酸钾、三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、2,4,6-三甲基吡啶中的一种或多种；所述碱B优选为碳酸氢钠；所述活化反应的反应温度为20℃～30℃，反应时间为24h～72h；所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为2h～10h。
进一步的，在步骤(4)中，所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：以所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在溶剂中，在Pd/C下反应得到H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；其中，所述溶剂为甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈中的一种或多种；所述溶剂优选为甲醇；所述Pd/C为5％Pb(55％in water)或10％Pb(55％in water)，用量分别为原料质量的10％-50％、5％-25％；优选分别为10％、5％；所述反应温度为10℃～30℃，反应时间为5h～24h；以所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH、所述H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在非质子性溶剂B中，在偶联剂的作用下进行偶联反应得到化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；其中，所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH和所述第一全保护二肽片段Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:1.0；所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH和偶联剂的摩尔比为1:1.0～2.0；所述偶联反应的反应温度为20℃～30℃，反应时间为5h～30h；以所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在二乙胺/二氯甲烷溶液中脱除Fmoc保护基，得到所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；其中，所述二乙胺/二氯甲烷溶液的体积分数为10％-50％；所述反应温度为20℃～30℃，反应时间为1h～5h。
进一步的，在步骤(5)中，所述二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：以化合物Z-D-Ala-OH和HOSu为原料，在非质子性溶剂B中，在缩合剂作用下进行活化反应，得到的中间体产物Z-D-Ala-OSu，在碱B的作用下将所述中间体产物Z-D-Ala-OSu与H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O进行偶联反应，得到所述二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；其中，所述化合物Z-D-Ala-OH和HOSu的摩尔比为1:(1.0～1.5)；所述中间体产物Z-D-Ala-OH和缩合剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；所述中间体产物Z-D-Ala-OSu和H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O的摩尔比为1:(0.8～1.0)；所述非质子性溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；所述非质子性溶剂B优选为四氢呋喃；所述缩合剂为DCC、EDC·HCl、DIC中的一种或多种；所述缩合剂优选为DIC；所述碱B为碳酸氢钠或碳酸钠、碳酸氢钾或碳酸钾、三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、2,4,6-三甲基吡啶中的一种或多种；所述碱B优选为碳酸氢钠；所述活化反应、偶联反应的反应温度均为20℃～30℃，反应时间均为3h～10h。
进一步的，在步骤(6)中，所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：以所述二肽片段化合物化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，在溶剂中，在Pd/C下反应得到H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；其中，所述溶剂为甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈中的一种或多种；所述溶剂优选为甲醇；所述Pd/C为5％Pb(55％in water)或10％Pb(55％in water)，用量分别为原料质量的10％-50％、5％-25％，优选分别为10％、5％；所述反应温度为10℃～30℃，反应时间为5h-24h；以化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和HONB为原料，在非质子性溶剂B中，在缩合剂作用下进行活化反应，得到的中间体Fmoc-D-Cys(Trt)-ONB溶液，在有机碱的作用下与所述H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH进行偶联反应，得到化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；其中，所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和HONB的摩尔比为1:(1.0～1.5)；所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和缩合剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的摩尔比为1:(0.8～1.0)；所述非质子性溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种，所述非质子性溶剂B优选为N，N-二甲基甲酰胺；所述缩合剂为DCC、EDC·HCl、DIC中的一种或多种，所述缩合剂优选为DCC；所述有机碱为三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶中的一种或多种，所述有机碱优选为DIPEA；所述活化反应的反应温度为0℃～20℃，反应时间为2h～10h；所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为5h～24h。
进一步的，在步骤(7)中，所述三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：以所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，在二乙胺/二氯甲烷溶液中脱除Fmoc保护基，得到化合物H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；其中，所述二乙胺/二氯甲烷溶液的体积分数为5％-20％；所述反应温度为10℃～30℃，反应时间为1h～5h；以所述化合物H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH、乙酸酐为原料，在非质子性溶剂B中，在有机碱的作用下进行反应，得到所述三肽片段Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；其中，所述化合物H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH和乙酸酐摩尔比为1:(0.9～1.1)；所述非质子性溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种，所述非质子性溶剂B优选为二氯甲烷；所述有机碱为三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶，所述有机碱优选为吡啶；所述反应温度为0℃～30℃，反应时间为1h～10h。
进一步的，在步骤(8)中，所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：以所述三肽片段化合物化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH、四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在非质子性溶剂B中，在偶联剂的作用下进行偶联反应得到所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；其中，所述三肽片段化合物化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH和四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:1；所述三肽片段化合物化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH和偶联剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为5h～24h；在步骤(9)中，所述七肽活化中间体化合物Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2的合成方法为：以所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2、2,2'-二硫二吡啶为原料，在三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合溶液中裂解/活化，得到所述七肽活化中间体化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；其中，所述三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合溶液的体积与所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的质量比例为5mL/g～15mL/g，优选比为10mL/g；所述三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合溶液中三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的体积比为97:2.5:0.5；所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和2,2'-二硫二吡啶的摩尔比为1:(3.0～10.0)；所述反应温度为0℃～30℃，反应时间为2h～6h。
相较于现有技术，本发明提供的技术方案至少具有以下优点：
本发明提供的一种液相合成伊特卡肽的方法，该方法采用液相合成法，与常用的固相合成法相比，合成成本低，并且能够大规模生产，因此，具有非常好的工业化应用前景；同时，合成过程的中间体都能通过沉淀析出或重结晶得到，而无需使用层析柱或HPLC等纯化制备，具有合成操作方便、减少成本的优点；并且，该液相合成所用物料均为常规物料，价格较为便宜，具有取材方便、设备要求低的优点。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
图1为本发明提供的一种液相合成伊特卡肽的方法的合成工艺流程图；
图2为本发明制得的伊特卡肽的产品液相图；
图3为本发明制得的伊特卡肽的产品质谱图。
具体实施方式
由背景技术可知，目前现有技术中制备伊特卡肽的工艺路线均繁琐、复杂，不能很好的生产规模。
目前，伊特卡肽的制备方法分为两大类：固相合成法和液相合成法。其中，固相合成法，如专利CN201810048053、CN201511029990、CN201810472468、CN201910496387、CN201811277081、CN201910886294、CN201910172421、US20170190739A1、EP3875466A1、WO2021109297A1，该类方法的缺点是：(1)需要使用到价格昂贵的树脂，并且投料倍数为2-5倍，大大增加了合成成本；(2)生产上，合成规模非常受限，难以满足市场需求(伊特卡肽原料药每年需求量超过100Kg)。
而液相合成法，如专利CN201511030047，该方法的缺点是：(1)合成步骤长，且总收率很低，只有11％；(2)合成过程的某中间体需要用层析柱纯化制备，限制了其合成规模。如专利CN202011034312，该方法的缺点是：(1)合成过程需要两次使用HPLC纯化制备，增加了合成成本；(2)合成过程7次采用Pd/C加氢还原的方式脱保护，生产上增加了安全风险。
因此，针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种伊特卡肽的液相合成方法，以解决现有方法工艺路线长、合成成本高、生产规模受限的问题。
该发明方案采用液相片段法合成主链肽，再通过构建二硫键得到粗肽。具体是，首先通过液相法合成四肽片段H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和三肽片段Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH，然后将两片段进行液相偶联，获得全保护七肽主链，然后裂解并用2,2’-二硫二吡啶(DPDS)对其进行活化，得到七肽活化中间体，最后与H-Cys-OH·HCl键合得到目标产品。粗肽经过反相HPLC纯化、转盐得到产品。该合成过程简便、高效，能够大规模生产。合成路线如图1所示。
需要理解的是，为了避免冗余，下文使用化学式来代替所述物质的全称。
本发明提供的一种液相合成伊特卡肽的方法，包括以下步骤：
步骤(1)合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2
将Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH溶解于二氯甲烷溶液中，加入(Boc)2O、吡啶、NH4HCO3，20-30℃下搅拌反应24小时，TLC检测反应完成，用稀盐酸中和反应，萃取，有机相用纯化水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用二氯甲烷/石油醚打浆，过滤，得到白色固体Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2。
步骤(2)合成Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
①将Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于30％二乙胺/二氯甲烷溶液中，20-30℃下搅拌2小时，TLC检测反应完成，将反应液加入石油醚中，析出白色沉淀，过滤，得到白色固体H-D-Arg(Pbf)-NH2。
②将Z-D-Ala-OH、HOAt以及上述得到的H-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于二氯甲烷中，加入2,4,6-三甲基吡啶，0℃下加入EDCI，然后在20-30℃下反应5h，TLC检测反应完成，加入纯化水淬灭反应，萃取，有机相用纯化水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用二氯甲烷/石油醚打浆，过滤，得到白色固体Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2。
步骤(3)合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH
①以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、HOSu、DCC在20-30℃下搅拌反应48小时，TLC检测反应完成，过滤出去不溶物，得到Fmoc-D-Arg(Pbf)-OSu溶液。
②将H-D-Arg(Pbf)-OH溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，并加入饱和碳酸氢钠水溶液，0℃下搅拌，将上述得到的Fmoc-D-Arg(Pbf)-OSu溶液滴加入其中，20-30℃下搅拌反应5小时，用稀释盐酸溶液将反应液调成中性，然后将中性反应液加入纯化水中，搅拌析出沉淀，过滤，得到白色固体，用二氯甲烷/石油醚打浆，过滤，得到白色固体。
Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH。
步骤(4)合成四肽片段H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
①将步骤(2)得到的Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于甲醇中，加入还原剂Pb/C，在氢气氛围中搅拌反应5小时，TLC检测反应完成，过滤除去不溶物，减压浓缩，得到固体H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2。
②将上述得到的H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于二氯甲烷中，加入步骤(3)得到的Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH、HOAt以及2,4,6-三甲基吡啶，20℃下加入EDCI，20-30℃下反应15小时，TLC检测反应完成，加入纯化水淬灭反应，萃取，有机相用纯化水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用二氯甲烷/石油醚打浆，过滤，得到白色固体Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2。
③将Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于20％二乙胺/二氯甲烷溶液中，20-30℃下搅拌2小时，TLC检测反应完成，将反应液加入石油醚中，析出白色沉淀，过滤，得到白色固体H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2。
步骤(5)合成Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH
①以四氢呋喃为溶剂，将Z-D-Ala-OH、HOSu、DIC在20-30℃下搅拌反应5小时，TLC检测反应完成，过滤出去不溶物，加入乙酸乙酯和纯化水，搅拌后萃取，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，纯化水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用乙酸乙酯/石油醚打浆，过滤，得到白色固体Z-D-Ala-OSu。
②将H-D-Arg(Pbf)-OH溶解于饱和碳酸氢钠水溶液中，将上述得到的Z-D-Ala-OSu溶解于四氢呋喃中，并滴加到H-D-Arg(Pbf)-OH的饱和碳酸氢钠水溶液中，20-30℃下搅拌反应5小时，减压旋蒸除去四氢呋喃，用稀释盐酸溶液将反应液调到酸性，加入乙酸乙酯萃取，有机相用稀盐酸洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用乙酸乙酯/石油醚打浆，过滤，得到白色固体Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH。
步骤(6)合成Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH
①将步骤(5)得到的Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH溶解于甲醇中，加入还原剂Pd/C，在氢气氛围中搅拌反应5小时，TLC检测反应完成，过滤除去不溶物，减压浓缩，得到固体H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH。
②将Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、HONB溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，0℃下加入DCC，在20-30℃下搅拌反应3小时，TLC检测反应完成，过滤出去不溶物，得到Fmoc-D-Cys(Trt)-ONB溶液。
③将上述步骤①得到的H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH用N，N-二甲基甲酰胺溶液溶解，加入DIPEA，0℃下搅拌，再将上述步骤②得到的Fmoc-D-Cys(Trt)-ONB溶液滴加入其中，20-30℃下反应15小时，TLC检测反应完成，加入纯化水和二氯甲烷，萃取，有机相用纯化水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用异丙醇重结晶，得到白色固体Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH。
步骤(7)合成三肽片段Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH
①将Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH溶解于10％二乙胺/二氯甲烷溶液中，20℃下搅拌2小时，TLC检测反应完成，将反应液加入石油醚中，析出白色沉淀，过滤，得到白色固体H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH。
②将上述得到的H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH溶于二氯甲烷，加入乙酸酐、吡啶，20℃下搅拌反应2小时，TLC检测反应完成，加入稀盐酸水溶液，萃取，有机相纯化水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用二氯甲烷/石油醚打浆，过滤，得到白色固体Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH。
步骤(8)合成全保护七肽
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
将四肽片段H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2、三肽片段
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH、HOAt溶解于二氯甲烷中，0℃下加入2,4,6-三甲基吡啶、EDCI，然后升温至20℃，反应15小时，TLC检测反应完成，加入纯化水淬灭反应，萃取，有机相用纯化水洗涤，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用二氯甲烷/石油醚打浆，过滤，得到白色固体
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2。
步骤(9)合成七肽中间体Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2
将2,2'-二硫二吡啶溶解于三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合溶液中，0℃下加入步骤(8)得到全保护七肽，20℃下搅拌反应3小时，将反应液加入异丙醚中，搅拌析出沉淀，过滤，得到白色固体，即为七肽中间体。
步骤(10)合成制备伊特卡肽Ac-D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2
将步骤(9)得到的七肽中间体溶解于水中，将H-Cys-OHHCl溶解于水中，并滴加到七肽中间体的水溶液中，20-30℃下搅拌反应1小时，反应液加入异丙醇中，搅拌析出沉淀，过滤，得到白色固体，即为伊特卡肽粗品，经过HPLC纯化、转盐、冻干，得到目标产品伊特卡肽。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例
步骤(1)合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2
称取32.4g(50mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和14.2g(65mmol)Boc酸酐于容器中，加入300mL二氯甲烷搅拌溶解，再加入4.0g(50mmol)吡啶、19.8g(250mmol)碳酸氢铵，20-30℃下搅拌反应24小时，TLC检测反应完成，用300mL 1M稀盐酸中和反应，静置分层，萃取，有机相用300mL纯化水洗涤，300mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用50mL二氯甲烷溶解，加入300mL石油醚中，搅拌打浆1小时，过滤，鼓风干燥得到32.4gFmoc-D-Arg(Pbf)-NH2，收率为100.0％，纯度为98.4％。
步骤(2)合成Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
将32.4g(50mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2加入200mL体积分数为30％的二乙胺/二氯甲烷溶液中，20-30℃搅拌2小时，将反应液加入1500mL石油醚中，搅拌析出大量白色沉淀，过滤，石油醚洗涤3次，真空干燥，得到20.9g H-D-Arg(Pbf)-NH2，收率为98.2％，纯度为96.9％称取11.0g(49.1mmol)Z-D-Ala-OH、8.0g(58.9mmol)HOAt以及上述得到的H-D-Arg(Pbf)-NH2，加入500mL二氯甲烷溶解，加入7.8mL(58.9mmol)2,4,6-三甲基吡啶，在0℃下搅拌，然后加入11.3g(58.9mmol)EDCI，转移至20-30℃下反应5小时，TLC检测反应完成，加入500mL纯化水淬灭反应，静置分层，萃取，有机相用500mL纯化水洗涤，500mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用70mL二氯甲烷溶解，加入500mL石油醚中，搅拌打浆1小时，过滤，真空干燥，得到27.6g Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2，收率为89.1％，纯度为96.6％。
步骤(3)合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH
称取32.4g(50mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、6.9g(60mmol)HOSu、12.4g(60mmol)DCC溶解于300mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中，20-30℃搅拌反应48小时，TLC检测反应完成，过滤出去不溶物，得到Fmoc-D-Arg(Pbf)-OSu溶液。
称取22.2g(50mmol)H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O溶解于300mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入200mL饱和碳酸氢钠水溶液，0℃下将上述得到的Fmoc-D-Arg(Pbf)-OSu溶液滴加入其中，20-30℃下搅拌反应5小时，用2M稀释盐酸溶液将反应液调成中性，然后将中性反应液加入3000mL纯化水中，搅拌析出沉淀，过滤，得到白色固体，鼓风干燥，再用200mL二氯甲烷将固体溶解，加入1500mL石油醚中，搅拌析出固体，过滤得到47.7g Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH，收率为90.3％，纯度为95.0％。
步骤(4)合成四肽片段H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
将步骤(2)得到的27.6g(43.7mmol)Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于200mL甲醇中，加入还原剂10％(2.8g)Pb/C(10％钯碳，55％水)，在1个大气压氢气氛围中搅拌反应5小时，TLC检测反应完成，过滤除去不溶物，减压浓缩，得到固体H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2。
将上述得到的H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于300mL二氯甲烷中，加入步骤(3)得到的46.2g(43.7mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH、7.1g(52.4mmol)HOAt以及6.9mL(52.4mmol)2,4,6-三甲基吡啶，20℃下加入10.0g(52.4mmol)EDCI，20-30℃下反应15小时，TLC检测反应完成，加入300mL纯化水淬灭反应，静置分层，萃取，有机相用300mL纯化水洗涤，300mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用70mL二氯甲烷溶解，加入500mL石油醚中，搅拌打浆1小时，过滤，鼓风干燥，得到62.1g Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2，收率为92.5％，纯度为94.0％。
将62.1g(40.4mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2溶解于200mL20％二乙胺/二氯甲烷溶液中，20-30℃下搅拌2小时，TLC检测反应完成，将反应液加入1500mL石油醚中，搅拌析出大量白色沉淀，过滤，石油醚洗涤3次，真空干燥，得到52.8gH-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2，收率99.4％，纯度91.8％。
步骤(5)合成Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH
将11.2g(50mmol)Z-D-Ala-OH、6.9g(60mmol)HOSu、7.6g(60mmol)DIC溶解于150mL四氢呋喃中，在20-30℃下搅拌反应5小时，TLC检测反应完成，过滤出去不溶物，加入200mL乙酸乙酯和200mL纯化水，搅拌后静置分层，萃取，有机相用200mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，200mL纯化水洗涤，200mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用50mL乙酸乙酯溶解，加入200mL石油醚中，搅拌打浆1小时，过滤，真空干燥，得到15.0gZ-D-Ala-OSu，收率93.3％，纯度94.4％。
将20.8g(46.7mmol)H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O溶解于150mL饱和碳酸氢钠水溶液中，将上述得到的Z-D-Ala-OSu溶解于300mL四氢呋喃中，并滴加到H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O的饱和碳酸氢钠水溶液中，20-30℃下搅拌反应5小时，TLC检测反应完成，减压旋蒸除去四氢呋喃，用稀释盐酸溶液将反应液调到酸性，加入200mL乙酸乙酯萃取，有机相用200mL稀盐酸洗涤，200mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用50mL乙酸乙酯溶解，加入200mL石油醚中，搅拌打浆1小时，过滤，真空干燥，得到26.5gZ-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH，收率89.9％，纯度97.5％。
步骤(6)合成Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH
将26.5g(42.0mmol)Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH溶解于200mL甲醇中，加入还原剂10％(2.7g)Pd/C，在1个大气压氢气氛围中搅拌反应5小时，TLC检测反应完成，过滤除去不溶物，减压浓缩，得到固体H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH。
将24.6g(42.0mmol)Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、8.3g(46.2mmol)HONB溶解于250mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，0℃下加入9.5g(46.2mmol)DCC，在20-30℃下搅拌反应3小时，TLC检测反应完成，过滤出去不溶物，得到Fmoc-D-Cys(Trt)-ONB溶液。
将上述步骤中得到的H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH用100mLN，N-二甲基甲酰胺溶液溶解，加入DIPEA，0℃下搅拌，再将上述步骤(2)得到的Fmoc-D-Cys(Trt)-ONB溶液滴加入其中，20-30℃下反应15小时，TLC检测反应完成，加入350mL纯化水和350mL二氯甲烷，搅拌后静置分层，萃取，有机相用350mL纯化水洗涤，350mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用100mL异丙醇重结晶，得到38.2gFmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH，收率85.4％，纯度98.5％。
步骤(7)合成三肽片段Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH
将38.2g(35.9mmol)Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH溶解于200mL10％二乙胺/二氯甲烷溶液中，20℃下搅拌2小时，TLC检测反应完成，将反应液加入1500mL石油醚中，析出白色沉淀，过滤，石油醚洗涤3次，真空干燥，得到30.3g H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH，收率100.0％，纯度97.0％。
30.3g(35.9mmol)H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH溶于200mL二氯甲烷，加入4.4g(43.1mmol)乙酸酐、5.7g(71.8mmol)吡啶，20℃下搅拌反应2小时，TLC检测反应完成，加入200mL 1M稀盐酸溶液，静置分层，萃取，有机相用200mL纯化水洗涤，200mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用50mL二氯甲烷溶解，加入300mL石油醚中，析出白色沉淀，搅拌1h，过滤，真空干燥，得到30.5g Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH，收率96.1％，纯度91.5％。
步骤(8)合成全保护七肽
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
将45.3g(34.5mmol)四肽片段H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2、30.5g(34.5mmol)三肽片段Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH、5.6g(41.4mmol)HOAt溶解于350mL二氯甲烷中，0℃下加入5.5mL g(41.4mmol)2,4,6-三甲基吡啶、7.9g(41.4mmol)EDCI，然后升温至20℃，反应15小时，TLC检测反应完成，加入350mL纯化水淬灭反应，搅拌后静置分层，萃取，有机相用350mL纯化水洗涤，350mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用40mL二氯甲烷溶解，加入250mL石油醚中，析出沉淀，搅拌1h，过滤，鼓风干燥，得到68.8g。
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2，收率91.5％，纯度85％。
步骤(9)合成七肽中间体Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2
将34.8g(158.0mmol)2,2'-二硫二吡啶溶解于5000mL三氟乙酸/水/三异丙基硅烷(体积比为97:2.5:0.5)混合溶液中，0℃下加入实施例8得到的68.8g(31.6mmol)全保护七肽，20℃下搅拌反应3小时，将反应液加入25L异丙醚中，搅拌析出沉淀，过滤，洗涤3次，真空干燥，得到41.6g七肽中间体，收率126.8％，纯度79.1％。
步骤(10)制备伊特卡肽Ac-D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2
将步骤(9)得到41.6g(30.2mmol)的七肽中间体溶解于832mL纯化水中，将4.8g(30.2mmol)H-Cys-OHHCl溶解于168mL水中，并滴加到七肽中间体的水溶液中，20-30℃下搅拌反应1小时，反应液加入8000mL异丙醇中，搅拌析出沉淀，过滤，洗涤3次，得到35.6g粗肽，收率为112.7％，纯度为77.5％，即为伊特卡肽粗品，经过HPLC纯化、转盐、冻干，得到15.9g精肽，总收率为25.8％，纯度为99.3％(见图2)，质谱峰M＝1048.7(见图3)
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本申请的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本申请的精神和范围。任何本领域技术人员，在不脱离本申请的精神和范围内，均可作各自更动与修改，因此本申请的保护范围应当以权利要求限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过液相法分别合成四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
将所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH进行液相偶联，得到全保护七肽主链；
将所述全保护七肽主链裂解，并用2,2’-二硫二吡啶进行活化，得到七肽活化中间体；
将所述七肽活化中间体与H-Cys-OH·HCl键合得到伊特卡肽粗肽，将所述伊特卡肽粗肽经过纯化、转盐，得到伊特卡肽。
2.根据权利要求1所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤(1)合成一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2；
步骤(2)以所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，合成第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
步骤(3)合成第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH；
步骤(4)以所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH为原料，通过偶联合成所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
步骤(5)合成二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
步骤(6)以所述二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，合成化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
步骤(7)以所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，合成所述三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
步骤(8)以所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，通过液相偶联，得到所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
步骤(9)将所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2进行裂解处理、并用2,2’-二硫二吡啶进行活化处理，得到所述七肽活化中间体化合物Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
步骤(10)将所述七肽活化中间体化合物Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2与H-Cys-OH·HCl键合得到伊特卡肽粗肽；将所述伊特卡肽粗肽经过反相HPLC纯化、转盐，得到所述伊特卡肽。
3.根据权利要求2所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：以化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、(Boc)2O和NH4HCO3为原料，在非质子性溶剂A中，在碱A的作用下反应，得到所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2；
其中，所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和(Boc)2O的摩尔比为1:(1.0～2.0)；
所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和NH4HCO3的摩尔比为1:(2.0～10.0)；
所述非质子性溶剂A为二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、四氯化碳、甲苯、氯仿中的一种或多种；
所述碱A为吡啶、三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、2,4,6-三甲基吡啶中的一种或多种；
所述反应温度为20℃～30℃，反应时间为5h～72h。
4.根据权利要求2所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：对所述一肽修饰物化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-NH2进行脱保护处理，得到H-D-Arg(Pbf)-NH2；以化合物Z-D-Ala-OH和所述H-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在非质子性溶剂B中，在偶联剂的作用下进行偶联反应，得到所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
其中，所述化合物Z-D-Ala-OH和H-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:(0.8～1.1)；
所述化合物Z-D-Ala-OH和偶联剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；
所述非质子性溶剂B为二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿中的一种或多种；
所述偶联剂为化合物A，或化合物A和有机碱的组合物，或化合物A和化合物B的组合物，或化合物A、化合物B和有机碱的组合物；其中，所述化合物A为EDC·HCl、DCC、DIC、HATU、HBTU、TATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，所述化合物B为HOAt、HOBt、Cl-HOBt、Oxyma、HOSu或HONb，所述有机碱为2,4,6-三甲基吡啶、DIPEA、吡啶、三乙胺或N-甲基吗啡；
所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为3h～12h。
5.根据权利要求2或4所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：以化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和HOSu为原料，在非质子性溶剂B中，在缩合剂作用下进行活化反应，得到的中间体Fmoc-D-Arg(Pbf)-OSu溶液，在碱B的作用下与H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O进行偶联反应，得到所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH；
其中，所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和HOSu的摩尔比为1:(1.0～1.2)；
所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和缩合剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；
所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O的摩尔比为1:(1.0～1.2)；
所述缩合剂为DCC、EDC·HCl、DIC中的一种或多种；
所述碱B为碳酸氢钠或碳酸钠、碳酸氢钾或碳酸钾、三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、2,4,6-三甲基吡啶中的一种或多种；
所述活化反应的反应温度为20℃～30℃，反应时间为24h～72h；
所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为2h～10h。
6.根据权利要求2或4所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：
以所述第一全保护二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在溶剂中，在Pd/C下反应得到H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
其中，所述溶剂为甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈中的一种或多种；所述Pd/C为5％Pb或10％Pb，用量分别为原料质量的10％-50％、5％-25％；所述反应温度为10℃～30℃，反应时间为5h～24h；
以所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH、所述H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在非质子性溶剂B中，在偶联剂的作用下进行偶联反应得到化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
其中，所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH和所述第一全保护二肽片段Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:1.0；所述第二全保护二肽片段化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH和偶联剂的摩尔比为1:1.0～2.0；所述偶联反应的反应温度为20℃～30℃，反应时间为5h～30h；
以所述化合物Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在二乙胺/二氯甲烷溶液中脱除Fmoc保护基，得到所述四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
其中，所述二乙胺/二氯甲烷溶液的体积分数为10％-50％；所述反应温度为20℃～30℃，反应时间为1h～5h。
7.根据权利要求2或4所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：以化合物Z-D-Ala-OH和HOSu为原料，在非质子性溶剂B中，在缩合剂作用下进行活化反应，得到的中间体产物Z-D-Ala-OSu，在碱B的作用下将所述中间体产物Z-D-Ala-OSu与H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O进行偶联反应，得到所述二肽片段化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
其中，所述化合物Z-D-Ala-OH和HOSu的摩尔比为1:(1.0～1.5)；
所述中间体产物Z-D-Ala-OH和缩合剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；
所述中间体产物Z-D-Ala-OSu和H-D-Arg(Pbf)-OH·H2O的摩尔比为1:(0.8～1.0)；
所述活化反应、偶联反应的反应温度均为20℃～30℃，反应时间均为3h～10h。
8.根据权利要求2所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：
以所述二肽片段化合物化合物Z-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，在溶剂中，在Pd/C下反应得到H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
其中，所述溶剂为甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈中的一种或多种；所述Pd/C为5％Pb或10％Pb，用量分别为原料质量的10％-50％、5％-25％；所述反应温度为10℃～30℃，反应时间为5h-24h；
以化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和HONB为原料，在非质子性溶剂B中，在缩合剂作用下进行活化反应，得到的中间体Fmoc-D-Cys(Trt)-ONB溶液，在有机碱的作用下与所述H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH进行偶联反应，得到化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
其中，所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和HONB的摩尔比为1:(1.0～1.5)；所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和缩合剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的摩尔比为1:(0.8～1.0)；所述非质子性溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；所述缩合剂为DCC、EDC·HCl、DIC中的一种或多种；所述有机碱为三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶中的一种或多种；所述活化反应的反应温度为0℃～20℃，反应时间为2h～10h；所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为5h～24h。
9.根据权利要求2或8所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(7)中，所述三肽片段化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH的合成方法为：
以所述化合物Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH为原料，在二乙胺/二氯甲烷溶液中脱除Fmoc保护基，得到化合物H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
其中，所述二乙胺/二氯甲烷溶液的体积分数为5％-20％；所述反应温度为10℃～30℃，反应时间为1h～5h；
以所述化合物H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH、乙酸酐为原料，在非质子性溶剂B中，在有机碱的作用下进行反应，得到所述三肽片段Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH；
其中，所述化合物H-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH和乙酸酐摩尔比为1:(0.9～1.1)；所述非质子性溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙腈、四氯化碳、甲苯、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；所述有机碱为三乙胺、N-甲基吗啡、DIPEA、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶；所述反应温度为0℃～30℃，反应时间为1h～10h。
10.根据权利要求2所述的液相合成伊特卡肽的方法，其特征在于，在步骤(8)中，所述全保护七肽主链化合物
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成方法为：以所述三肽片段化合物化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH、四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2为原料，在非质子性溶剂B中，在偶联剂的作用下进行偶联反应得到所述全保护七肽主链化合物
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
其中，所述三肽片段化合物化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH和四肽片段化合物H-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:1；
所述三肽片段化合物化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH和偶联剂的摩尔比为1:(1.0～2.0)；
所述偶联反应的反应温度为0℃～30℃，反应时间为5h～24h；
在步骤(9)中，所述七肽活化中间体化合物
Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2的合成方法为：以所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2、2,2’-二硫二吡啶为原料，在三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合溶液中裂解/活化，得到所述七肽活化中间体化合物
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
其中，所述三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合溶液的体积与所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的质量比例为5mL/g～15mL/g；
所述三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合溶液中三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的体积比为97:2.5:0.5；
所述全保护七肽主链化合物Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2和2,2'-二硫二吡啶的摩尔比为1:(3.0～10.0)；
所述反应温度为0℃～30℃，反应时间为2h～6h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211143679.0A CN117777231A (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种液相合成伊特卡肽的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211143679.0A CN117777231A (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种液相合成伊特卡肽的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117777231A true CN117777231A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90389665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211143679.0A Pending CN117777231A (zh) | 2022-09-20 | 2022-09-20 | 一种液相合成伊特卡肽的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117777231A (zh) |
-
2022
- 2022-09-20 CN CN202211143679.0A patent/CN117777231A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111732651B (zh) | 一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法 | |
| CN105384809B (zh) | 一种片段法固液结合制备特立帕肽的方法 | |
| CN111732650B (zh) | 索马鲁肽的连续流固相反应制备 | |
| WO2017114238A1 (zh) | 一种合成Etelcalcetide的方法 | |
| EP3398957A1 (en) | Method for synthesizing etelcalcetide | |
| CN111378028A (zh) | 酰化glp-1化合物及其修饰基团的合成 | |
| CN112386707B (zh) | 一种肿瘤靶向多肽药物偶联物及其制备方法 | |
| CN109575109B (zh) | 片段缩合制备地加瑞克的方法 | |
| DK147733B (da) | Gastrin-analoge heptapeptidderivater til anvendelse som diagnostika | |
| CN111875668B (zh) | 一类含谷氨酰胺或天冬酰胺的环二肽的合成方法 | |
| CN111732649B (zh) | 连续流固相反应制备利拉鲁肽 | |
| US20230220000A1 (en) | Process for preparing a glp-1/glucagon dual agonist | |
| US9150615B2 (en) | Process for the preparation of leuprolide and its pharmaceutically acceptable salts | |
| KR101694190B1 (ko) | 지코노티드의 제조방법 | |
| US20190309014A1 (en) | Process for preparation of icatibant acetate | |
| CN109879935B (zh) | 一种多肽的液相合成方法 | |
| CN113667007A (zh) | 一种索马鲁肽侧链的液相制备方法 | |
| CN117777231A (zh) | 一种液相合成伊特卡肽的方法 | |
| WO2007110765A2 (en) | Processes for the preparation of octreotide | |
| CN113646324B (zh) | 用于wnt六肽的线性溶液相路径 | |
| KR101171095B1 (ko) | 루프로라이드의 제조방법 | |
| US20070111930A1 (en) | Process for preparing vapreotide | |
| CN111378009A (zh) | 一种奥曲肽的制备方法 | |
| KR20140056803A (ko) | 엑세나타이드의 제조방법 | |
| CN114585636B (zh) | 一种普卡那肽的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |