CN111378009A

CN111378009A - 一种奥曲肽的制备方法

Info

Publication number: CN111378009A
Application number: CN201811608770.9A
Authority: CN
Inventors: 王卫国; 王克全; 朱家培
Original assignee: Jiangsu Genscript Biotech Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Genscript Biotech Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明涉及一种奥曲肽的制备方法，采用4‑苄氧基苯甲醛树脂为固相载体，直接在固相上将N‑(9‑芴甲氧羰基)‑苏氨醇与树脂上的醛基形成稳定的缩醛，然后通过洗涤即可将副产物分离，极大的简化了工艺，提供了一条全固相奥曲肽制备工艺，解决了目前奥曲肽生产过程中成本高、副反应多以及工艺复杂等问题。

Description

一种奥曲肽的制备方法

技术领域：

本发明属多肽化学领域，特别涉及一种奥曲肽的制备方法。

背景技术：

奥曲肽(式1)为分子内含有一个二硫键的环八肽，是一种人工合成的人生长抑素的八肽衍生物，其作用与天然生长抑素相似。化学名为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D- 色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-L-半胱氨酰-L-苏氨醇环-(2→7)-二硫化物；英文名为Octreotide Acetate。瑞士山德士(Sandoz)公司于1982年合成，1988年美国FDA批准醋酸奥曲肽用于胃肠道分泌类肿瘤和垂体肿瘤及肢端肥大症的治疗；1998年美国FDA再次批准醋酸奥曲肽用于肢端肥大症的治疗。

公开的奥曲肽制备方法主要有两种：固相方法和液相方法。专利ZL 00134258.4采用液相方法合成，步骤繁琐，生产周期长。目前固相方法仍然是制备奥曲肽的主流方法，一类方法，如专利CN 201010165270.X，CN 200510029221.2及CN 201210352668.3采用氯树脂及氯树脂类似物，与苏氨醇连接后合成奥曲肽。这类方法的缺点是氯树脂与苏氨醇的连接效率很低，导致过量苏氨醇及树脂的浪费，同时会增加后续洗涤树脂所需的溶剂消耗量以及最终的成本。另一类固相合成方法采用酯还原的方法得到含有苏氨醇的奥曲肽，如专利ZL 21375216，CN 201310333598.1，该类方法由于使用到强还原剂硼氢化钠，会导致消旋及其他副反应的发生。还有一类方法是采用添加linker的方案解决苏氨醇与树脂连接效率低的问题，如专利CN 201610938844.X，CN 200510024502.9及CN 2004100108332。该类方法需要先将苏氨醇与linker在通过液相反应合成并纯化后才能用于奥曲肽的制备，增加了工艺周期且额外增加了一个原料的质控，导致工艺复杂化。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、高效的奥曲肽制备方法，解决目前奥曲肽制备成本高或副反应多或工艺复杂的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种奥曲肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将Fmoc-Thr-Ol及催化剂加入到醛基树脂中进行缩合反应，得到Fmoc-Thr树脂复合物；

(2)按照固相多肽合成的方法，根据奥曲肽的序列，将保护氨基酸按C端至N端的顺序逐个偶联到步骤(1)所得树脂上获得保护的奥曲肽-树脂复合物；

(3)向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂，将奥曲肽从树脂上裂解下来，得到还原型奥曲肽粗品，将还原型奥曲肽粗品配制成一定的浓度，加入氧化剂，反应后得到奥曲肽粗品。

(4)将奥曲肽粗品分离纯化，得到奥曲肽。

本发明还提供了一种奥曲肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将Fmoc-Thr-Ol及催化剂加入到4-苄氧基苯甲醛树脂中进行缩合反应，得到Fmoc-Thr树脂复合物；

(2)向步骤(1)得到的Fmoc-Thr树脂复合物中加入Fmoc脱保护试剂脱除Fmoc保护基，反应结束后过滤并洗涤，得到Thr-树脂，然后向Thr-树脂复合物中加入奥曲肽的C端第二个氨基酸和缩合试剂进行缩合反应，缩合反应结束后洗涤树脂，按照奥曲肽从C端到N 端的顺序，更换氨基酸，重复Fmoc脱保护反应和缩合反应，得到保护的奥曲肽-树脂复合物；

(3)向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂，脱除多肽侧链保护基并将奥曲肽从树脂上裂解下来，经沉淀后得到还原型奥曲肽粗品；将还原型奥曲肽粗品配制成一定的浓度，调节pH，加入氧化剂，反应后得到奥曲肽粗品。

(4)将奥曲肽粗品经反相高效液相色谱分离纯化，得到奥曲肽。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中的催化剂为对甲苯磺酸；在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中各物质间的比例为n(Fmoc-Thr-Ol)：n(对甲苯磺酸)：n(4-苄氧基苯甲醛树脂)为1～3：0.1～0.5：1。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中的反应时间为8～24小时。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中的Fmoc脱保护试剂是体积比为1：1～4的哌啶与二甲基甲酰胺。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中Fmoc脱保护反应的温度为20～60℃，反应时间为10～60min。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中氨基酸的保护基分别为：所有氨基酸的α氨基均为Fmoc保护基，苏氨酸侧链羟基保护基为叔丁基，半胱氨酸侧链保护基为三苯甲基，赖氨酸和D-色氨酸侧链保护基为叔丁氧羰基。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中缩合试剂为缩合试剂1，缩合试剂2以及缩合试剂3的一种或多种混合；其中，缩合试剂1为N,N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、卡特缩合剂、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的一种，缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑中的一种，缩合试剂3为二异丙基乙胺。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中各试剂的投料摩尔比为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：缩合试剂3：树脂＝3～6：3～6：3～6：6～12。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中各试剂的投料摩尔比为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：缩合试剂3：树脂＝3～6：3～6：3～6：6～12，且N,N-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基碳二亚胺不与N,N二异丙基乙胺组合使用。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(2)中缩合反应的温度为20～60℃，反应时间为 1～4小时。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中的切割试剂为三氟乙酸混合液。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中的切割试剂为三氟乙酸混合液，且混合液中三氟乙酸的体积比不小于80％。

在本发明的一些实施例中，所述三氟乙酸混合液除了三氟乙酸外还包括重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、碘化铵、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的一种或多种混合。，

在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂进行反应的温度为0～60℃，反应时间为1～4小时。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中的多肽浓度为0.1～1mg/ml，所述的pH范围为7～9。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中氧化剂为空气或双氧水，优选地，氧化剂为双氧水。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中双氧水与还原型奥曲肽粗品的比例为n(还原型奥曲肽粗品)：n(双氧水)＝1：5～10。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(4)的纯化条件为：制备柱填料为碳载硅胶，

在本发明的一些实施例中，所述步骤(4)中的流动相为质量比均为0.1％三氟乙酸的水、乙腈或甲醇溶液中的一种或多种混合。

在本发明的一些实施例中，所述步骤(4)中的制备柱为C₄/C₈/C₁₈类型反相色谱柱。

本发明还提供了一种C端为醇的多肽制备方法，包括采用醛基树脂进行固相多肽合成的方

本发明的有益效果是：采用4-苄氧基苯甲醛树脂为固相载体，直接在固相上将Fmoc- Thr-Ol与树脂上的醛基形成稳定的缩醛，然后通过洗涤即可将副产物分离，极大的简化了工艺，提供了一条全固相奥曲肽制备工艺，解决了目前奥曲肽生产过程中或成本高或副反应多或工艺复杂的问题。

具体实施方式

本发明中一些常用的缩写具有如下含义：

Fmoc:芴甲氧羰酰基

TFA：三氟醋酸

EDT：乙二硫醇

Phenol：苯酚

Thioanisole：苯甲硫醚

TES：三乙基硅烷

TIS：三异丙基硅烷

DTT：1,2二硫苏糖醇

Anisole：苯甲醚

NH₄I：碘化铵

MeOH：甲醇

DCM：二氯甲烷

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

PIP：哌啶

DMAP：二甲氨基吡啶

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

BOP：卡特缩合剂

HOBt:1-羟基苯并三氮唑

DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺

DCC：N,N-二环己基碳二亚胺

HOAt：N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑

HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯

PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

TsOH：对甲苯磺酸

Fmoc-Thr-Ol：N-(9-芴甲氧羰基)-苏氨醇

Fmoc-Cys(Trt)-OH：N-(9-芴甲氧羰基)-S-三苯甲基-半胱氨酸

如本文所用，“缩合反应”是两个或两个以上有机分子相互作用后以共价键结合成一个大分子，并常伴有失去小分子(如水、氯化氢、醇等)的反应。

本发明通过以下实例作进一步举例说明，这些实例不应解释为对本发明的限制。下述实施例中，所有氨基酸的α氨基均为Fmoc保护基，苏氨酸侧链羟基保护基为叔丁基，半胱氨酸侧链保护基为三苯甲基，赖氨酸和D-色氨酸侧链保护基为叔丁氧羰基。

实施例1：制备奥曲肽

(1)制备Fmoc-Thr-树脂复合物

向带有过滤装置的反应器中加入4-苄氧基苯甲醛树脂(1.0mmol/g)1g，注入10ml无水氯仿，静置1h，过滤。

取1mmol Fmoc-Thr-Ol和0.1mmol TsOH，溶于10ml无水氯仿中，加入到树脂中，回流反应8h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。

(2)制备保护的奥曲肽-树脂复合物

向反应器中加入10ml体积比为1：1的PIP/DMF溶液，20℃下反应10min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。

取3mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH，3mmol HBTU，3mmol HOBt及6mmol DIEA，溶于10mlDMF中，将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应1h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。

按照奥曲肽C端到N端的顺序，更换氨基酸，循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的奥曲肽-树脂复合物。

(3)制备奥曲肽粗品

向上述保护的奥曲肽-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，TFA:phenol:thioansole:碘化铵水溶液＝87.5％:5％:2.5％:5％，碘化铵水溶液的浓度为100mg/ml)，0℃下反应2h。过滤。将滤液加入到10倍体积的乙醚中沉淀，离心后得到还原型奥曲肽粗品。

将还原型奥曲肽粗品溶解为0.1mg/ml的浓度，加入氨水调节pH为7，空气气氛下反应至奥曲肽生成。

(4)制备奥曲肽

将奥曲肽粗品溶于体积比为5％的甲醇水溶液中，经高效液相色谱纯化得到奥曲肽精品，冷冻干燥后得0.25g，纯度为98.9％，产率22.9％。制备条件为：C₁₈制备柱，两种流动相分别为质量比均为0.1％TFA的水、甲醇溶液。

实施例2：制备奥曲肽

(1)制备Fmoc-Thr-树脂复合物

取3mmol Fmoc-Thr-Ol和0.5mmol TsOH，溶于10ml无水氯仿中，加入到树脂中，回流反应16h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。

(2)制备保护的奥曲肽-树脂复合物

向反应器中加入10ml体积比为1：4的PIP/DMF溶液，30℃下反应10min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。

取6mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH，6mmol DIC，6mmol HOBt，溶于10ml DMF中，将所得溶液加入到反应器中，30℃下反应2h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。

(3)制备奥曲肽粗品

向上述保护的奥曲肽-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，TFA:phenol:thioansole:EDT:碘化铵水溶液＝82.5％:5％:5％:2.5％:5％，碘化铵水溶液的浓度为 100mg/ml)，20℃下反应3h。过滤。将滤液加入到10倍体积的乙醚中沉淀，离心后得到还原型奥曲肽粗品。

将还原型奥曲肽粗品溶解为0.5mg/ml的浓度，加入氨水调节pH为8.5，空气气氛下反应至奥曲肽生成。

(4)制备奥曲肽

将奥曲肽粗品溶于体积比为5％的乙腈水溶液中，经高效液相色谱纯化得到奥曲肽精品，冷冻干燥后得0.35g，纯度为99.2％，产率34.3％。制备条件为：C₁₈制备柱，两种流动相分别为质量比均为0.1％TFA的水、乙腈溶液。

实施例3：制备奥曲肽

(1)制备Fmoc-Thr-树脂复合物

取2mmol Fmoc-Thr-Ol和0.2mmol TsOH，溶于10ml无水氯仿中，加入到树脂中，回流反应24h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。

(2)制备保护的奥曲肽-树脂复合物

向反应器中加入10ml体积比为1：2的PIP/DMF溶液，60℃下反应60min。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂六遍，过滤。

取4mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH，4mmol PyBOP，4mmol HOBt及8mmol DIEA，溶于10mlDMF中，将所得溶液加入到反应器中，60℃下反应4h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂六遍，过滤。

(3)制备奥曲肽粗品

向上述保护的奥曲肽-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，TFA:phenol:EDT:碘化铵水溶液＝87.5％:5％:2.5％:5％，碘化铵水溶液的浓度为100mg/ml)，60℃下反应4h。过滤。将滤液加入到10倍体积的乙醚中沉淀，离心后得到还原型奥曲肽粗品。

将还原型奥曲肽粗品溶解为1mg/ml的浓度，加入氨水调节pH为9，加入5eq的双氧水进行氧化反应至奥曲肽生成。

(4)制备奥曲肽

将奥曲肽粗品溶于体积比为5％的甲醇水溶液中，经高效液相色谱纯化得到奥曲肽精品，冷冻干燥后得0.31g，纯度为99.3％，产率30.4％。制备条件为：C₁₈制备柱，两种流动相分别为质量比均为0.1％TFA的水、甲醇溶液。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种奥曲肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(3)向保护的奥曲肽-树脂复合物中加入切割试剂，将奥曲肽从树脂上裂解下来，得到还原型奥曲肽粗品，将还原型奥曲肽粗品配制成一定的浓度，调节pH，加入氧化剂，反应后得到奥曲肽粗品。

(4)将奥曲肽粗品分离纯化，得到奥曲肽。

2.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的催化剂为对甲苯磺酸。

3.根据权利要求2所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的醛基树脂为4-苄氧基苯甲醛树脂。

4.根据权利要求3所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的各物质间的比例为n(Fmoc-Thr-Ol)：n(对甲苯磺酸)：n(4-苄氧基苯甲醛树脂)＝1～3：0.1～0.5：1。

5.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的Fmoc脱保护试剂是体积比为1：1～4的哌啶与二甲基甲酰胺，所述Fmoc脱保护反应的温度为20～60℃。

6.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的缩合试剂为缩合试剂1，缩合试剂2以及缩合试剂3的一种或多种混合；其中，缩合试剂1为N,N-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、卡特缩合剂、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的一种，缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑中的一种，缩合试剂3为N,N-二异丙基乙胺。

7.根据权利要求6所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于，所述各试剂的投料摩尔比为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：缩合试剂3：树脂＝3～6：3～6：3～6：6～12：1。

8.根据权利要求6或7所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于N,N-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基碳二亚胺不与N,N二异丙基乙胺组合使用。

9.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的切割试剂为三氟乙酸混合液，所述的混合液中三氟乙酸的体积比不小于80％。

10.根据权利要求9所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：所述三氟乙酸混合液除了三氟乙酸还包括重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、碘化铵、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的一种或多种混合。

11.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的还原型奥曲肽粗品浓度为0.1～1mg/ml，所述的pH范围为7～9。

12.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的氧化剂为空气或双氧水，优选地，氧化剂为双氧水。

13.根据权利要求12所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于其中双氧水与还原型奥曲肽粗品的比例为n(还原型奥曲肽粗品)：n(双氧水)＝1：5～10。

14.根据权利要求1所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的奥曲肽粗品经反相高效液相色谱分离纯化，得到奥曲肽精品。

15.根据权利要求14所述的奥曲肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的纯化条件为：制备柱填料为碳载硅胶，流动相为质量比为0.1％三氟乙酸的水、乙腈或甲醇溶液中的一种或多种混合。