CN111875668B - 一类含谷氨酰胺或天冬酰胺的环二肽的合成方法 - Google Patents

一类含谷氨酰胺或天冬酰胺的环二肽的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类环二肽的合成方法，这类环二肽序列含有L‑天冬酰胺或L‑谷氨酰胺。该方法是以2‑Chlorotrityl Chloride Resin为载体，固相合成直链二肽片段；再经甲酯化反应得到直链双甲酯保护二肽；然后水相碱性环合得到侧链羧基甲酯保护的环二肽Cyclo[Glu(OMe)‑AA]或Cyclo[Asp(OMe)‑AA]；最后经氨解得到含谷氨酰胺或天冬酰胺的环二肽。本发明方法合成工艺简单、操作安全，有效避免了环合过程中因氨基酸侧链保护基团空间位阻引起的环合不完全，副产物少、易于纯化，可批量合成含有Gln、Asn的环二肽。

Description

一类含谷氨酰胺或天冬酰胺的环二肽的合成方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一类环二肽的合成方法。
背景技术
环二肽(cyclic dipeptides)，又名2,5-二酮哌嗪(2,5-diketopiperazines)，是一类不以两性离子形式存在的自然界中最小的环肽，由两个氨基酸通过肽键环化形成。环二肽结构简易且构象稳定，同时在体内的稳定性比相应的线性二肽更好，而且一些环二肽具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤等活性，因此环二肽及其衍生物常被作为候选物，一直受到合成化学家和生物学家的追捧。
L-天冬酰胺是多种生物医药用途的非必须氨基酸，参与神经和脑组织细胞功能的代谢控制。L-谷氨酰胺对机体有多方面作用：如促进肌细胞内蛋白质的合成、可增强力量，提高耐力，可增强免疫系统的功能及参与合成谷胱甘肽，是胃肠道管腔细胞的基本能量来源等。不少研究已经证明，从直链的先导结构肽改为环肽后使原有的生物活性提高十几倍至几万倍。许多具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等活性的天然产物肽往往含有不同类型的主链环化结构。如从冬虫夏草培养液中分离的新天然环二肽Cyclo(Gln-Ile)对小鼠成纤维细胞L-929、皮肤黑素瘤细胞A-375，可产生强弱不同的细胞毒活性；Cyclo(Gly-Gln)是一种内源性环二肽，能穿透血脑屏障，对β-内啡肽或吗啡引起的心肺呼吸抑制有抑制作用；Cyclo(Pro-Asn)在抗炎方面具有良好的效果，对创面修复有积极的治疗作用。
环二肽的合成方法有固相树脂合成法和液相合成法。针对含有天冬酰胺或谷氨酰胺序列的环二肽，固相的合成方法包括以肟为Linker的载体树脂Oxime-Resin合成环二肽，形成羧酸肟酯，亲核活性高，但树脂昂贵，应用较少；以氨基为Linker的氨基树脂，是以谷氨酸和天冬氨酸为原料，侧链连接树脂，固相环合，同样树脂价格昂贵，不具有经济性；以Wang树脂合成环二肽则存在环合效率不高的问题。液相合成策略为采取最大保护策略，形成全保护二肽片段，液相氨酯交换环合。通常会因羧基活化不完全而造成原料剩余，须柱层析等纯化操作；且谷氨酰胺和天冬酰胺因侧链保护基团常选择三苯甲基，过大的空间位阻严重影响了环合效率，部分序列甚至无法环合。
发明内容
本发明的目的是提供一种合成工艺简单、环化效率高、应用性强、可批量化合成的含谷氨酰胺、天冬酰胺环二肽的方法。
本发明所述的含天冬酰胺、谷氨酰胺环二肽的结构式为：
Figure GDA0003546512730000021
其中，式Ⅰ为含谷氨酰胺环二肽，式Ⅱ为含天冬酰胺环二肽，R为除天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸外其他α-氨基酸的有机侧链；其合成路线和合成方法如下：
Figure GDA0003546512730000022
1、合成H-Glu-AA-OH的三氟乙酸盐、H-Asp-AA-OH的三氟乙酸盐
以2-Chlorotrityl Chloride Resin为载体，Fmoc-AA(X)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH或Fmoc-Asp(OtBu)-OH为原料，采用固相法合成含谷氨酸或含天冬氨酸的二肽树脂，裂解树脂同时脱侧链保护基，得到H-Glu-AA-OH的三氟乙酸盐或H-Asp-AA-OH的三氟乙酸盐；其中，AA为除天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸外其他α-氨基酸；X为AA的常见的侧链保护基团，在切割液的作用下可完全脱除。
2、合成H-Glu(OMe)-AA-OMe盐酸盐、H-Asp(OMe)-AA-OMe盐酸盐
以甲醇为溶剂，将H-Glu-AA-OH的三氟乙酸盐或H-Asp-AA-OH的三氟乙酸盐在二氯亚砜作用下反应，反应完后减压浓缩，用乙酸乙酯/水体系萃取，收集水相，得到H-Glu(OMe)-AA-OMe盐酸盐或H-Asp(OMe)-AA-OMe盐酸盐的水溶液。
3、合成Cyclo[Glu(OMe)-AA]、Cyclo[Asp(OMe)-AA]
将H-Glu(OMe)-AA-OMe盐酸盐或H-Asp(OMe)-AA-OMe盐酸盐的水溶液通过无机碱催化、水相环合，合成侧链羧基甲酯保护的环二肽Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]。根据氨基进攻酯键，优先形成稳定构象的原则，在水相中形成“头-尾相连”的酰胺键，形成稳定二酮哌嗪六元环。合成的产物或从水中析出、或溶于水溶液，析出与否取决于AA侧链基团的亲疏水性。其中，析出的固体产物过滤；溶于水溶液中的产物减压除去水分，加入甲醇或1,4-二氧六环溶解，过滤除去无机盐，滤液减压浓缩，得到油状物。
4、合成Cyclo(Gln-AA)、Cyclo(Asn-AA)
将Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]在氨的甲醇溶液或氨的1,4-二氧六环溶液中氨解，相应的得到Cyclo(Gln-AA)或Cyclo(Asn-AA)粗品，即式Ⅰ所示的含谷氨酰胺环二肽或式Ⅱ所示的含天冬酰胺环二肽粗品。将目标环肽粗品纯化：其中含亲水侧链残基的环肽，加水溶解，得到含目标肽的水溶液；含疏水侧链残基的环肽根据极性不同分别添加少许甲醇或乙腈后，加水稀释溶解。将含有目标环肽溶液经制备纯化(反相色谱或亲水色谱)、冷冻干燥，得到目标肽Cyclo(Gln-AA)或Cyclo(Asn-AA)纯品。
上述步骤2中，优选H-Glu-AA-OH的三氟乙酸盐或H-Asp-AA-OH的三氟乙酸盐与二氯亚砜的摩尔比为1:2.0～3.0；优选反应温度为-10～0℃，反应时间为6～8小时。
上述步骤3中，优选向H-Glu(OMe)-AA-OMe盐酸盐或H-Asp(OMe)-AA-OMe盐酸盐的水溶液中加入无机碱，调节pH＝7～8，进行水相环合；其中所述无机碱为碳酸氢钠。
上述步骤4中，优选Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]与氨的甲醇溶液或氨的1,4-二氧六环溶液的比例为1mmol:6～10mL，其中氨的甲醇溶液的浓度为7mol/L，氨的1,4-二氧六环溶液的浓度为0.4mol/L。
上述步骤4中，进一步优选在氨解反应4～6小时后，补加氨水继续反应3～4小时，以促进氨解反应的进行。其中所述Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]的质量与补加的氨水的体积比优选为1g:2.5～4mL。
本发明选用2-Chlorotrityl Chloride Resin为载体，固相合成二肽，液相甲酯化反应，水相环合后氨解得到目标环二肽。本发明合成的环二肽大多呈白色固体或无色固体，具有弱碱性，大多数可溶于水，易溶于甲醇，在空气中化学性质稳定。
本发明的有益效果如下：
1、以2-Chlorotrityl Chloride Resin为载体固相合成直链二肽三氟乙酸盐，合成操作简单，避免了液相合成原料残留，合成纯度高。
2、二肽三氟乙酸盐经甲酯化反应，得到的二肽双甲酯盐酸盐溶于水，经萃取洗涤即可得到高纯度前体产物水溶液。
3、水相环合，避免了有机溶剂使用，对环境友好；有效避免了侧链保护下，空间位阻过大环合效率低下的问题。溶剂的稀释效应，有效避免了分子间反应副产物的生成。
4、通过氨的甲醇溶液或氨的1,4-二氧六环溶液，促进反应物溶解并提供氨解环境，补加少量氨水，可提供游离氨浓度，增加反应物浓度，使氨解反应化学平衡向产物方向移动，环肽氨解效率高，均可完全氨解，易于纯化。
附图说明
图1是Cyclo[Glu(OMe)-Phe]的HPLC色谱图。
图2是Cyclo(Gln-Phe)的HPLC色谱图。
图3是Cyclo(Gln-Phe)的ESI-MS图谱。
图4是Cyclo(Gln-Tyr)的HPLC色谱图。
图5是Cyclo(Gln-Tyr)的ESI-MS图谱。
图6是Cyclo(Gln-Trp)的HPLC色谱图。
图7是Cyclo(Gln-Trp)的ESI-MS图谱。
图8是Cyclo[Asp(OMe)-Pro]的HPLC色谱图。
图9是Cyclo[Asp(OMe)-Pro]的ESI-MS图谱。
图10是Cyclo(Asn-Pro)的HPLC色谱图。
图11是Cyclo(Asn-Pro)的ESI-MS图谱。
图12是Cyclo[Asp(OMe)-Ile]的HPLC色谱图。
图13是Cyclo(Asn-Ile)的HPLC色谱图。
图14是Cyclo(Asn-Ile)的ESI-MS图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
合成谷氨酰胺-苯丙氨酸环二肽
1、合成H-Glu-Phe-OH的三氟乙酸盐
称取10g 2-Chlorotrityl Chloride Resin(取代度1.6mmol/g)在二氯甲烷中溶胀10分钟，然后加入6.82g(17.6mmol)Fmoc-Phe-OH、10.6mL(64mmol)N,N′-二异丙基乙胺，室温反应2小时，再加入无水甲醇封闭30分钟，抽滤，滤饼依次用50mL异丙醇、50mL N,N-二甲基甲酰胺洗涤，用60mL体积浓度为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基30分钟，再抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，检测树脂阳性黑色。将洗涤后的滤饼加入60mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入13.6g(32mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、6.5g(48mmol)1-羟基苯丙三唑、7.4mL(48mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺，在氮气保护下，常温搅拌反应2小时，检测树脂阴性无色透明。抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，用60mL体积浓度为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基30分钟，再抽滤，滤饼依次用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺分别洗涤两次，每次50mL，用甲醇洗涤三次，每次50mL，干燥得H-Glu(OtBu)-Phe-2-ChlorotritylChloride Resin。
向H-Glu(OtBu)-Phe-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入52.8mL三氟乙酸与3mL三异丙基硅烷、2.4mL苯甲硫醚、1.8mL水混合而成的切割液，常温反应2小时，反应液减压浓缩，得到油状物，加入二氯甲烷带干，加入石油醚冷冻析晶，得到6.2g H-Glu-Phe-OH的三氟乙酸盐。
2、合成H-Glu(OMe)-Phe-OMe盐酸盐
将6.2g(15.2mmol)H-Glu-Phe-OH的三氟乙酸盐加入100mL甲醇中，在-10～0℃下，滴加3.3mL(45.6mmol)二氯亚砜，滴加完后，保持-10～0℃反应1小时后自然升温至室温，继续反应6小时，减压浓缩得到油固混合物，加入80mL水，用乙酸乙酯萃取两次，每次60mL，收集水相，即得到H-Glu(OMe)-Phe-OMe盐酸盐的水溶液。
3、合成Cyclo[Glu(OMe)-Phe]
向收集的水相中加入碳酸氢钠，调节pH＝8，常温反应8小时，生成的产物从水中析出、过滤得白色固体，烘干得3.72g，HPLC色谱图见图1。由图1可见，烘干后的白色固体为Cycol[Glu(OMe)-Phe]。
4、合成Cyclo(Gln-Phe)
将3.72g(12.8mmol)Cycol[Glu(OMe)-Phe]溶于100mL 7mol/L氨的甲醇溶液中，在0～5℃下反应1小时后自然升温至室温，反应3小时后补加10mL氨水，继续反应3小时，HPLC检测反应完全。浓缩反应液，得到白色固体，烘干得3.4g粗品。将3.4g粗品溶于50mL水中，过滤后采用反相制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，流动相B为甲醇，色谱柱5cm×35cm，填料为反相聚合物，检测波长215nm，流速30mL/min。色谱柱先用5％B相平衡，平衡后上样，运行程序：5％～10％B相30min，10％～15％B相40min，15％B相恒流。合格品浓缩后冻干，得到谷氨酰胺-苯丙氨酸环二肽2.9g，即Cyclo(Gln-Phe)，其HPLC纯度大于99％，色谱图见图2，ESI-MS m/z：298(M+Na+，100)，质谱图见图3，收率65.9％。
实施例2
合成谷氨酰胺-酪氨酸环二肽
本实施例的步骤1中，加入8.1g(17.6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH，其他步骤与实施例1步骤1相同，固相合成得到6.5g H-Glu-Tyr-OH的三氟乙酸盐。
本实施例的步骤2中，将6.5g(15.3mmol)H-Glu-Tyr-OH的三氟乙酸盐加入100mL甲醇中，在-10～0℃下，滴加3.2mL(45.9mmol)二氯亚砜，其他步骤与实施例1的步骤2相同，经甲酯化反应，得到H-Glu(OMe)-Tyr-OMe盐酸盐的水溶液。
本实施例的步骤3中，向收集的水相中加入碳酸氢钠，调节pH＝8，常温反应6小时，产物从水中析出，过滤得白色固体Cyclo[Glu(OMe)-Tyr]，烘干得3.9g。
本实施例的步骤4中，将3.9g(12.7mmol)Cyclo[Glu(OMe)-Tyr]溶于100mL0.4mol/L氨的1,4-二氧六环溶液中，在0～5℃下反应1小时后自然升温至室温，反应5小时后，补加12mL氨水，继续反应4小时，HPLC检测反应完全。浓缩反应液，得到白色固体，烘干得3.5g粗品。将3.5g样品溶于70mL水中，过滤后采用反相制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，流动相B为甲醇，色谱柱5cm×35cm，填料为反相聚合物，检测波长215nm，流速30mL/min。色谱柱先用3％B相平衡，平衡后上样，运行程序：3％B相20min，3％～15％B相50min，15％B相恒流。合格品浓缩后冻干，得到谷氨酰胺-酪氨酸环二肽2.62g，即Cyclo(Gln-Tyr)，其HPLC纯度大于94％，色谱图见图4，ESI-MS m/z：314(M+Na+，100)，质谱图见图5，收率56.3％。
实施例3
合成谷氨酰胺-色氨酸环二肽
本实施例的步骤1中，加入7.5g(17.6mmol)Fmoc-Trp-OH，其他步骤与实施例1步骤1相同，固相合成得到6.9g H-Glu-Trp-OH的三氟乙酸盐。
本实施例的步骤2中，将6.9g(15.8mmol)H-Glu-Tyr-OH的三氟乙酸盐加入100mL甲醇中，在-10～0℃下，滴加2.3mL(31.7mmol)二氯亚砜，其他步骤与实施例1的步骤2相同，经甲酯化反应，得到H-Glu(OMe)-Trp-OMe盐酸盐的水溶液。
本实施例的步骤3中，向收集的水相中加入碳酸氢钠，调节pH＝8，常温反应8小时，减压除去水分，加入甲醇过滤除去无机盐，浓缩滤液得4.2g油状物Cyclo[Glu(OMe)-Trp]。
本实施例的步骤4中，将4.2g(12.8mmol)Cyclo[Glu(OMe)-Trp]溶于100mL 7mol/L氨的甲醇溶液中，在0～5℃下反应1小时后自然升温至室温，反应4小时，补加12mL氨水，继续反应4小时，HPLC检测反应完全。浓缩反应液，得3.8g油状物粗品。将3.8g样品溶于40mL水中，过滤后采用反相制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，流动相B为甲醇，色谱柱5cm×35cm，填料为反相聚合物，检测波长215nm，流速30mL/min。色谱柱先用5％B相平衡，平衡后上样，运行程序：5％～8％B相10min，8％～28％B相60min，28％B相恒流。合格品浓缩后冻干，得到谷氨酰胺-色氨酸环二肽3.2g，即Cyclo(Gln-Trp)，其HPLC纯度大于98％，色谱图见图6，ESI-MS m/z：337(M+Na+，100)质谱图见图7，收率64.3％。
实施例4
合成天冬酰胺-脯氨酸环二肽
本实施例的步骤1中，加入5.9g(17.6mmol)Fmoc-Pro-OH、13.2g(32mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH，其他步骤与实施例1步骤1相同，固相合成得到5.4g H-Asp-Pro-OH的三氟乙酸盐。
本实施例的步骤2中，将5.4g(15.6mmol)H-Asp-Phe-OH的三氟乙酸盐加入100mL甲醇中，在-10～0℃下，滴加2.7mL(39mmol)二氯亚砜，其他步骤与实施例1的步骤2相同，经甲酯化反应，得到H-Asp(OMe)-Pro-OMe盐酸盐的水溶液。
本实施例的步骤3中，向收集的水相中加入碳酸氢钠，调节pH＝8，常温反应6小时，减压除去水分，加入甲醇过滤除去无机盐，浓缩滤液得2.8g油状物Cyclo[Asp(OMe)-Pro]，其HPLC色谱图见图8，ESI-MS质谱图见图9。
本实施例的步骤4中，将2.8g(12.4mmol)Cyclo[Asp(OMe)-Pro]溶于100mL7mol/L氨的甲醇溶液中，在0～5℃下反应1小时后自然升温至室温，反应3小时，补加8.5mL氨水，继续反应3小时，HPLC检测反应完全。浓缩反应液，得2.6g油状物粗品。将2.6g样品溶于50mL水中，过滤后采用亲水制备色谱纯化：流动相A为H2O，流动相B为乙腈，色谱柱5cm×35cm，填料为6010Click xion型亲水填料，检测波长215nm，流速30mL/min。色谱柱先用95％B相平衡，平衡后上样，运行程序：95％～90％B相15min，90％～85％B相40min，85％B相恒流。合格品浓缩后冻干，得到天冬酰胺-脯氨酸环二肽2.2g，即Cyclo(Asn-Pro)，其HPLC纯度大于93％，色谱图见图10，ESI-MS m/z：234(M+Na+，100)，质谱图见图11，收率65％。
实施例5
合成天冬酰胺-异亮氨酸环二肽
本实施例的步骤1中，加入6.2g(17.6mmol)Fmoc-Ile-OH、13.2g(32mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH，其他步骤与实施例1步骤1相同，固相合成得到5.4g H-Asp-Ile-OH的三氟乙酸盐。
本实施例的步骤2中，将5.4g(15mmol)H-Asp-Ile-OH的三氟乙酸盐加入100mL甲醇中，在-10～0℃下，滴加3.2mL(45mmol)二氯亚砜，其他步骤与实施例1的步骤2相同，经甲酯化反应，得到H-Asp(OMe)-Ile-OMe盐酸盐的水溶液。
本实施例的步骤3中，向收集的水相中加入碳酸氢钠，调节pH＝8，常温反应6小时，减压除去水分，加入甲醇过滤除去无机盐，浓缩滤液得2.9g油状物Cyclo[Asp(OMe)-Ile]，其HPLC色谱图见图12。
本实施例的步骤4中，将2.9g(11.9mmol)Cyclo[Asp(OMe)-Ile]溶于96mL 7mol/L氨的甲醇溶液中，在0～5℃下反应1小时后自然升温至室温，反应5小时，补加8.7mL氨水，继续反应4小时，HPLC检测反应完全。浓缩反应液，得2.5g粗品。将2.5g样品溶于50mL水中，过滤后采用反相制备纯化：流动相A是质量分数为0.1％的醋酸水溶液，流动相B为甲醇，色谱柱5cm×35cm填料为反相聚合物，检测波长215nm，流速30mL/min。色谱柱先用3％B相平衡，平衡后上样，运行程序：3％～5％B相10min，5％～20％B相40min，20％B相恒流。合格品浓缩后冻干，得到天冬酰胺-异亮氨酸环二肽2g，即Cyclo(Asn-Ile)，其HPLC纯度大于94％，色谱图见图13，ESI-MS m/z：250(M+Na+，100)，质谱图见图14，收率55％。

Claims (6)

1.一类含谷氨酰胺或天冬酰胺的环二肽的合成方法，所述环二肽的结构式为：
Figure FDA0003546512720000011
其中，式Ⅰ为含谷氨酰胺环二肽，式Ⅱ为含天冬酰胺环二肽，R为除天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸外其他α-氨基酸的有机侧链；
其特征在于所述合成方法由下述步骤组成：
(1)以2-Chlorotrityl Chloride Resin为载体，Fmoc-AA(X)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH或Fmoc-Asp(OtBu)-OH为原料，采用固相法合成含谷氨酸或含天冬氨酸的二肽树脂，裂解树脂同时脱侧链保护基，得到H-Glu-AA-OH的三氟乙酸盐或H-Asp-AA-OH的三氟乙酸盐；其中，AA为除天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸外其他α-氨基酸，X为AA的常见的侧链保护基团；
(2)以甲醇为溶剂，将H-Glu-AA-OH的三氟乙酸盐或H-Asp-AA-OH的三氟乙酸盐与二氯亚砜反应，反应完后减压浓缩，用乙酸乙酯/水体系萃取，收集水相，得到H-Glu(OMe)-AA-OMe盐酸盐或H-Asp(OMe)-AA-OMe盐酸盐的水溶液；
(3)将H-Glu(OMe)-AA-OMe盐酸盐或H-Asp(OMe)-AA-OMe盐酸盐的水溶液通过无机碱催化水相环合，合成侧链羧基甲酯保护的环二肽Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]；
Figure FDA0003546512720000012
(4)将Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]在氨的甲醇溶液或氨的1,4-二氧六环溶液中氨解，相应的得到Cyclo(Gln-AA)或Cyclo(Asn-AA)，即式Ⅰ所示的含谷氨酰胺环二肽或式Ⅱ所示的含天冬酰胺环二肽。
2.根据权利要求1所述的含天冬酰胺或谷氨酰胺的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，所述H-Glu-AA-OH的三氟乙酸盐或H-Asp-AA-OH的三氟乙酸盐与二氯亚砜的摩尔比为1:2.0～3.0，反应温度为-10～0℃，反应时间为6～8小时。
3.根据权利要求1所述的含天冬酰胺或谷氨酰胺环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，向H-Glu(OMe)-AA-OMe盐酸盐或H-Asp(OMe)-AA-OMe盐酸盐的水溶液中加入无机碱，调节pH＝7～8，进行水相环合；其中所述无机碱为碳酸氢钠。
4.根据权利要求1所述的含天冬酰胺或谷氨酰胺的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，所述Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]与氨的甲醇溶液或氨的1,4-二氧六环溶液的比例为1mmol:6～10mL。
5.根据权利要求1或4所述的含天冬酰胺或谷氨酰胺的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，氨解反应4～6小时后，补加氨水继续反应3～4小时，以促进氨解反应的进行。
6.根据权利要求5所述的含天冬酰胺或谷氨酰胺的环二肽的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，所述Cyclo[Glu(OMe)-AA]或Cyclo[Asp(OMe)-AA]的质量与补加的氨水的体积比为1g:2.5～4mL。
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