CN113121673B - 一种固液结合法制备依降钙素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种固液结合法制备依降钙素的方法，其包括：应用Fomc/tBu方法，以Fmoc‑Pro‑CTC树脂为固相合成载体依Gln13‑Pro22片段序列缩合制备依降钙素肽树脂I然后裂解得到依降钙素片段I，以氨基树脂为固相合成载体依Arg23‑Pro31片段序列缩合制备依降钙素肽树脂II，将依降钙素片段I通过固相合成方式缩合至依降钙素肽树脂II上，并按照依降钙素氨基酸序列继续缩合得到依降钙素肽树脂，其中Leu3、Ser4、Leu11、Ser12以假脯氨酸二肽片段的形式进行缩合以引入序列、缩合困难氨基酸Val7以Val7‑Leu8‑Gly9三肽片段进行缩合以引入序列、缩合困难氨基酸Thr5以Thr5‑Asu6二肽片段进行缩合以引入序列。本发明解决了现有技术的生产周期长、生产效率低的问题，丰富了现有合成工艺，同时提高了合成产物纯度和纯化收率，降低了生产成本，利于大规模生产。

Description

一种固液结合法制备依降钙素的方法
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，特别涉及一种固液结合法制备依降钙素的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
依降钙素可用于治疗骨质疏松症引起的骨痛，能够抑制破骨细胞活性，减少骨的吸收，防止骨钙丢失具有改善骨强度、骨皮质厚度、骨钙质含量、骨密度等作用。依降钙素是鲑鱼降钙素的衍生物，二者的主要差别为鲑鱼降钙素是由N端Cys1的巯基与Cys6的巯基形成二硫键的长链环肽，而依降钙素由31个氨基酸残基组成、N端Ser1的氨基与Asu6侧链羧基形成酰胺环的长链环肽，相对而言依降钙素的结构更为复杂。
依降钙素的分子式为C148H244N42O47，分子量为3363.77，其结构为：
Figure BDA0003011674410000011
目前依降钙素通过化学合成法进行制备，专利EP0452514B1采用Boc策略进行依降钙素的合成，将依降钙素的序列分为两个片段：Ser1～Gly9和Lys10～Pro31，片段Ser1～Gly9是通过全液相合成的方式进行制备，与固相合成方法相比液相合成操作后处理步骤繁琐，需要反复的浓缩、中和、洗涤、萃取、沉淀、重复沉淀等步骤，反应收率低、反应周期长，且许多反应步骤须在低温条件下进行。将片段Ser1～Gly9缩合至Lys10～Pro31-MBHA树脂，需要使用酸性、腐蚀性更强的HF裂解肽树脂。并且采用Boc合成策略时每个氨基酸偶联完毕脱Boc的过程中均需使用TFA脱除每个氨基酸N端的Boc保护基，然后使用碱对TFA中和，再用溶剂对其洗涤；而采用Fmoc合成策略只需要使用20％的哌啶/DMF脱除每个氨基酸N端的Boc保护基，只通过溶剂洗涤一种方式即可。此外，由于采用Boc合成策略，因此所需的氨基酸为Boc保护氨基酸，随着固相多肽合成技术的不断发展进步现如今Boc合成策略基本被淘汰，当下的固相多肽合成基本完全采用Fmoc合成策略，保护氨基酸的生产厂家基本以生产Fmoc保护氨基酸为主，很少生产Boc保护氨基酸，因此Boc保护氨基酸均不是常规的保护氨基酸，需要定制、延长货期。专利US 5739272公开了两种合成方式：一种是将依降钙素的序列分为两个片段，片段1(Ser1～Gly9)和片段2(Lys10～Pro31)，片段1(Ser1～Gly9)通过固相合成的方式获取，裂解后再缩合至Lys10～Pro31-树脂，由于固相合成方法的假稀释效应，在片段缩合时羧基组分是大大过量的(通常为2至5倍摩尔当量)，因此通过片段合成的方法需要更大的投料量，而Asu价格十分昂贵，增加Asu的消耗量，增加生产成本；另一种是采用逐个氨基酸单独偶联的方式在树脂上进行合成。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种固液结合法制备依降钙素的方法。本发明采用液相合成与固相合成结合的方式得到线性依降钙素肽树脂，进行固相环化得到依降钙素肽树脂，裂解得到的粗肽经纯化、冻干，得到依降钙素纯品多肽，提高了合成产物纯度和纯化收率，降低了生产成本，利于大规模生产，解决了现有技术的生产周期长、生产效率低、保护氨基酸消耗量大的问题。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明提供了一种固液结合法制备依降钙素的方法，其包括：应用Fomc/tBu方法，以Fmoc-Pro-CTC树脂为固相合成载体依Gln13-Pro22片段序列缩合制备依降钙素肽树脂I然后裂解得到依降钙素片段I，以Fmoc-Pro-氨基树脂为固相合成载体依Arg23-Pro31片段序列缩合制备依降钙素肽树脂II，将依降钙素片段I通过固相合成方式缩合至依降钙素肽树脂II上，并按照依降钙素氨基酸序列继续缩合得到依降钙素肽树脂，其中，Leu3、Ser4、Leu11、Ser12以假脯氨酸二肽片段的形式进行缩合以引入序列，继续缩合的肽片段和氨基酸为Fmoc-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-Leu-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH、Fmoc-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH和Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH。
其中，所述依降钙素肽树脂的结构为NH2-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-Thr(tBu)-Asu(OAll)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-氨基树脂。
在本发明的实施方式中，针对缩合困难氨基酸Val7以Val7-Leu8-Gly9三肽片段进行缩合以引入序列、缩合困难氨基酸Thr5以Thr5-Asu6二肽片段进行缩合以引入序列降低氨基酸缩合难度。
在本发明的实施方式中，本发明采用固液结合的方法制备依降钙素，其中，肽片段Fmoc-Val-Leu-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH、和Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH采用液相合成法合成。
在本发明的一些实施方式中，二肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH的合成方法包括：(a)将Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Ser(tBu)-OSu；(b)将Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Asn(Trt)-OH在碱催化下生成Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH；
在本发明的一些实施方式中，二肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH的合成方法包括：(a)将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Thr(tBu)-OSu；(b)将Fmoc-Thr(tBu)-OSu和H-Asu(OAll)-OH在碱催化下生成Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH；
在本发明的一些实施方式中，三肽片段Fmoc-Val-Leu-Gly-OH的合成方法包括：(a)将Fmoc-Val-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Val-OSu；(b)将Fmoc-Val-OSu和H-Leu-OH在碱催化下生成Fmoc-Val-Leu-OH；(c)Fmoc-Val-Leu-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Val-Leu-OSu；(d)将Fmoc-Val-Leu-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Val-Leu-Gly-OH。
在本发明的一些实施方式中，碱选自Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、二乙胺、三乙胺中的一种或多种。
在本发明的实施方式中，Fmoc-Pro-CTC树脂的制备方法包括：将Fmoc-Pro-OH缩合至CTC树脂，并进行封闭反应得到；
其中，CTC树脂的替代度为0.5-1.5mmol/g；
在本发明的一些实施方式中，Fmoc-Pro-CTC树脂的制备方法包括：将Fmoc-Pro-OH、DIEA和CTC树脂按摩尔质量比为2-5：6：1混合后，在15-35℃条件下反应1～5h；封闭方法包括：将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在15-35℃条件下反应20～60min。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽树脂I以Fmoc-Pro-CTC树脂为固相合成载体，Fmoc-Pro-CTC树脂经溶胀、脱除Fmoc保护基和洗涤后依次从C端至N端缩合Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH得到依降钙素肽树脂I，其结构为Fmoc-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-CTC树脂。
在本发明的实施方式中，裂解依降钙素肽树脂I得到依降钙素片段1，其结构为Fmoc-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽树脂II以氨基树脂为固相合成载体，氨基树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，得到的依降钙素肽树脂II结构为Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-氨基树脂。
在本发明的实施方式中，Fmoc-Pro-氨基树脂的制备方法包括：将Fmoc-Pro-OH缩合至氨基树脂，并进行封闭反应得到；所述氨基树脂为Rink Amide AM树脂、Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Sieber树脂；所述氨基树脂的替代度为0.2-0.6mmol/g。
在本发明的实施方式中，依降钙素肽树脂I和II的制备，以及依降钙素片段I与依降钙素肽树脂II的缩合以及与引入Ser1-Ser12段的氨基酸或肽片段的缩合均在缩合体系中进行，所述缩合体系为A/D体系或B/C体系或A/B/C体系，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合体系为A/D体系或B/C体系，其中，A/D体系中A与D的摩尔比为2-5:2-5；B/C体系中B与C的摩尔比为2-5:2-5。
在本发明的一些实施方式中，缩合的氨基酸或肽片段在参与缩合前需进行活化，活化方法包括：将待缩合的氨基酸或肽片段加入到缩合体系中。
在本发明的一些实施方式中，进行缩合反应时，氨基酸或肽片段、A物质、D物质与树脂的摩尔比为2-5:2-5:2-5:1，或者氨基酸或肽片段、B物质、C物质与树脂的摩尔比为2-5:2-5:2-5:1。
在本发明的实施方式中，所述固液结合法制备依降钙素的方法还进一步包括：脱除线性依降钙素肽树脂上OAll保护基，进行环化，得到依降钙素肽树脂；裂解制得的依降钙素肽树脂，同时脱除侧链保护基制备依降钙素粗肽；并进一步纯化的步骤。
在本发明的一些实施方式中，脱除OAll保护基的方法包括以DMF为反应溶剂，添加0.3-0.5倍树脂摩尔量的Pd(Ph3P)4、10倍树脂摩尔量的二甲基巴比妥酸，反应4-8h。
在本发明的一些实施方式中，环化反应在A/D或B/C或A/B/C体系中进行，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC。进一步地，所述环化反应在A/D或A/B/C体系中进行。
在本发明的一些实施方式中，裂解依降钙素肽树脂的方法包括：加入裂解液，在15-35℃条件下反应2-5h后，抽滤，将滤液加至预冷的MTBE中进行沉淀、离心，再用MTBE将沉淀洗涤，真空干燥。
所述裂解液为TFA、苯甲硫醚、TIS和EDT的水溶液，其中，TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和水的体积比为80-90:2.5-5:2.5-5:2.5-5:2.5-5。
在本发明的实施方式中，采用反相高效液相色潽法对依降钙素粗肽进行两步纯化，其中，第一步纯化的流动相为：流动相A项为0.1％的TFA/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的TFA/ACN(v/v)溶液，第二步纯化为转盐纯化，其流动相为：流动相A相为0.1％的醋酸/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的醋酸/ACN(v/v)溶液。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
本发明利用Fmoc-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH二肽的假脯氨酸结构可以有效的破坏依降钙素肽树脂合成过程中形成二级结构，减轻肽链间聚集，提高肽链的溶剂化程度的特性，有效的避免了逐个氨基酸缩合合成依降钙素肽树脂过程中因二级结构的形成导致得N端氨基酸缩合困难，N端氨基酸缩合反应困难导致缺失肽副产物多、纯度低、纯化难度高且产率低的技术问题。
本发明针对缩合困难氨基酸Val7以Val7-Leu8-Gly9三肽片段进行缩合以引入序列、缩合困难氨基酸Thr5以Thr5-Asu6二肽片段进行缩合以引入序列降低氨基酸缩合难度。
本发明采用液相合成和固相合成结合的方法，大大提高了合成效率，有效缩短了依降钙素的生产周期，降低杂质的生成，提高产品收率，降低生产成本。
本发明采用固相成环的方式，利用固相假稀释效应，避免了液相成环反应需要将粗肽配置成极低的浓度(1-3mg/ml)，需要使用大量溶剂，导致后续分离纯化的难度增加，同时产生大量废液的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明中所使用的缩写的具体含义列于下表中：
Figure BDA0003011674410000071
Figure BDA0003011674410000081
实施例1
二肽和三肽片段的液相合成
(1)二肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH的制备
(a)Fmoc-Ser(tBu)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Ser(tBu)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4L THF，置于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至30℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Ser(tBu)-OSu。
(b)Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH的合成：将0.15mol H-Asn(Trt)-OH和0.15molNa2CO3溶于0.2L 50％THF/H2O(v/v)溶液，得混合溶液；将步骤(a)制得的0.1mol Fmoc-Ser(tBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在30℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH。
(2)二肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH的制备
(a)Fmoc-Thr(tBu)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Thr(tBu)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4L THF，置于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至30℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Thr(tBu)-OSu。
(b)Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH的合成：将0.1mol H-Asu(OAll)-OH和0.15molNa2CO3溶于0.2L 50％THF/H2O(v/v)溶液，得混合溶液；将步骤(a)制得的0.15mol Fmoc-Thr(tBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在30℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH。
(3)三肽片段Fmoc-Val-Leu-Gly-OH的制备
(a)Fmoc-Val-OSu的合成：将0.4mol Fmoc-Val-OH和0.48mol HOSu溶于0.8L THF，置于冰水浴；将0.48mol DCC溶于0.4L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至30℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Val-OSu。
(b)Fmoc-Val-Leu-OH的合成：将0.45mol H-Lys(Boc)-OH和0.45mol Na2CO3溶于0.6L 50％THF/H2O(v/v)溶液，得混合溶液；将步骤(a)制得的0.3mol Fmoc-Asp(OtBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在30℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-OH。
(c)Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-OSu的合成：将步骤(b)制得的0.2mol Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4L THF，置于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至30℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-OSu。
(d)Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH的合成：将0.15mol H-Ser(tBu)-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF/H2O(v/v)溶液，得混合溶液；将步骤(c)制得的0.1molFmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在30℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH。
实施例2
依降钙素片段I的制备
(1)CTC树脂的溶胀：取40.5g替代度为0.74mmol/g的CTC树脂，加入DCM将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
(2)Fmoc-Pro-CTC树脂的制备：(a)以DMF为溶剂，将Fmoc-Pro-OH、DIEA和树脂按照摩尔量比为3:6:1的比例进行混合，在30℃条件下反应2h，得到Fmoc-Pro-CTC树脂；(b)以DMF为溶剂，将MeOH、DIEA和树脂按照摩尔量比为10:6:1的比例进行混合，在30℃条件下反应30min，对树脂进行封闭。
(3)Fmoc保护基的脱除：在30℃条件下加入20％PIP-DMF溶液进行两次脱除Fmoc保护：第一次脱除Fmoc保护和第二次脱除Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7，抽干溶剂；第一次脱除Fmoc保护反应时间为5min，第二次脱除Fmoc保护反应时间为10min。
(4)氨基酸活化：分别将90mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH、90mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH、90mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH、90mmol Fmoc-Leu-OH、90mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH、90mmolFmoc-His(Trt)-OH、90mmol Fmoc-Leu-OH、90mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH、90mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH与90mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入100mmol DIC，在30℃条件下反应5min。
(5)氨基酸缩合反应：将活化后的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH依次与脱除Fmoc保护基的树脂缩合，在30℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到依降钙素肽树脂I：Fmoc-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-CTC树脂。
茚三酮显色方法为：取少量树脂置于试管中，甲醇洗涤两次；在试管中分别加入体积分数85％苯酚-乙醇溶液、吡啶和质量分数5％茚三酮-乙醇溶液各两滴，于110℃条件下加热3min后，用DMF洗涤两次，观察树脂颜色。
(6)依降钙素肽树脂I的裂解：在圆底烧瓶中按照裂解液(DCM:TFE＝80:20(v/v))的体积与依降钙素肽树脂I的质量比值为10:1的比例加入裂解液，在30℃条件下反应2h后进行抽滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压蒸馏至无液体，得到依降钙素片段I：Fmoc-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH。
实施例3
依降钙素肽树脂II的制备
(1)Rink Amide MBHA树脂的溶胀：取33.3g替代度为0.3mmol/g的Rink AmideMBHA树脂，加入DCM将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
(2)Fmoc保护基的脱除：向步骤(1)溶胀后的Fmoc氨基树脂中，加入20％PIP/DMF(v/v)溶液，在30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7，抽干溶剂；第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间10min。
(3)Fmoc-Pro-Rink Amide MBHA树脂的制备：(a)将30mmol Fmoc-Pro-OH与30mmolHOBT用适量的DMF溶解，加入33mmol DIC，在30℃条件下反应5min后，将活化后的氨基酸加至脱除Fmoc保护基的Rink Amide MBHA树脂中，在30℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h后，排空反应液，再用DMF洗涤树脂3次；(b)将60mmol DIEA、60mmol乙酸酐和DMF的混合溶液加至树脂中，在30℃条件下反应30min对树脂进行封闭反应，排空反应液，再用DMF洗涤树脂3次。
(4)氨基酸活化：分别将30mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH、30mmol Fmoc-Gly-OH、30mmolFmoc-Ala-OH、30mmol Fmoc-Gly-OH、30mmol Fmoc-Val-OH、30mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH、30mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH、30mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH与30mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入33mmol DIC，在30℃条件下反应5min。
(5)氨基酸缩合反应：将步骤(4)中活化后的氨基酸加至脱除Fmoc保护基的氨基树脂中，在30℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，得到依降钙素肽树脂II：Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-RinkAmide MBHA树脂。
茚三酮显色方法为：取少量树脂置于试管中，DMF洗涤两次，在试管中分别加入体积分数85％苯酚-乙醇溶液、吡啶和质量分数5％茚三酮-乙醇溶液各两滴，于110℃条件下加热反应3min后，用DMF洗涤两次，观察树脂颜色。
实施例4
依降钙素肽树脂的制备
(1)氨基酸、肽片段的活化：分别将30mmol依降钙素片段I、30mmol Fmoc-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、30mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH、30mmol Fmoc-Val-Leu-Gly-OH、30mmolFmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH、30mmol Fmoc-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH和30mmolFmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH与30mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入33mmol DIC，在30℃条件下反应5min。
(2)氨基酸、肽片段的缩合反应：(a)将步骤(1)中活化后的氨基酸、肽片段加至脱除Fmoc保护基的实施例3制得的肽树脂II中，在30℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到线性依降钙素肽树脂：NH2-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-Thr(tBu)-Asu(OAll)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Rink Amide MBHA树脂。(b)将线性依降钙素肽树脂裂解后得到的线性依降钙素粗肽的HPLC纯度为63.8％。
(3)脱除OAll保护基：以DMF/为反应溶剂，添加0.3倍树脂摩尔量的Pd(Ph3P)4、10倍树脂摩尔量的二甲基巴比妥酸，30℃反应过夜，排空反应液，先用0.5％DIEA/DMF溶液洗涤肽树脂2次，再用DMF洗涤肽树脂6次。
(4)环化：以DMF为反应溶剂，添加30mmol HATU、30mmol HOBT和60mmol DIEA，30℃反应24h后，排空反应液，再用DMF洗涤肽树脂4次，得到环化后的依降钙素肽树脂。
(5)依降钙素肽树脂收缩：用溶剂MeOH洗涤肽树脂5次，时间为5min/次，排空溶剂，将依降钙素肽树脂置于真空干燥箱内30℃下干燥12h，得到干燥后的依降钙素肽树脂。
实施例5
依降钙素肽树脂的裂解
(1)将实施例1制得的依降钙素全保护肽树脂树脂置于圆底烧瓶中，加入10倍体积的裂解试剂在30℃条件下反应3h后，抽滤，得滤液；裂解液为TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5(v/v/v/v/v)。
(2)加入10倍树脂裂解试剂，在15～35℃条件下反应2～5h后，抽滤，将滤液加至10倍体积预冷的MTBE中进行沉淀、离心，再用MTBE将沉淀洗涤，真空干燥，得依降钙素粗肽，HPLC纯度为57％。
实施例6
依降钙素粗肽的纯化
采用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化，所述第一步纯化：流动相A相为0.1％的TFA/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的TFA/ACN(v/v)溶液，第二步转盐纯化：流动相A相为0.1％的醋酸/H2O(v/v)溶液，流动相B相为0.1％的醋酸/ACN(v/v)溶液。
经纯化、冻干得依降钙素产品，经检测产品HPLC纯度为98.5％，总收率35.4％。
对比例1
逐个氨基酸缩合的方法合成依降钙素肽树脂
以Rink Amide MBHA树脂为载体，按照依降钙素的序列从C端至N端依次逐个偶联相应的Fmoc-保护氨基酸进行依降钙素肽树脂的合成，实验过程中发现从Val7之后的N端氨基酸的缩合反应均困难，均需使用HBTU+DIEA的缩合体系进行复投，并且需要封闭。得到的依降钙素粗肽的HPLC纯度仅为32％。
对比例2
在对比例1的基础上对N端Leu3、Ser4采用假脯氨酸Fmoc-Leu3-Ser4[psi(Me,Me)Pro]-OH进行缩合反应。得到的依降钙素粗肽的HPLC纯度为42％。
上述本发明的实施例中，改变氨基树脂种类为Rink Amide AM树脂、Rink Amide树脂、或Sieber树脂；改变原料的投料比例为：全保护氨基酸、缩合体系与树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；改变反应溶剂、改变反应温度15～35℃、反应时间；改变缩合体系为A/D体系或B/C体系或A/B/C体系，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC等，均可实现依降钙素肽树脂的合成。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种固液结合法制备依降钙素的方法，其包括：应用Fomc/tBu方法，以Fmoc-Pro-CTC树脂为固相合成载体依Gln13-Pro22片段序列缩合制备依降钙素肽树脂I然后裂解得到依降钙素片段I，以Fmoc-Pro-氨基树脂为固相合成载体依Arg23-Pro31片段序列缩合制备依降钙素肽树脂II，将依降钙素片段I通过固相合成方式缩合至依降钙素肽树脂II上，并按照依降钙素氨基酸序列继续缩合得到依降钙素肽树脂，其中，Leu3、Ser4、Leu11、Ser12以假脯氨酸二肽片段的形式进行缩合以引入序列，所述继续缩合的肽片段和氨基酸为Fmoc-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-Leu-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH、Fmoc-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-OH和Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH；脱除线性依降钙素肽树脂上OAll保护基，进行环化，得到依降钙素肽树脂；裂解制得的依降钙素肽树脂，同时脱除侧链保护基制备依降钙素粗肽；并进一步纯化；
其中，所述依降钙素肽树脂的结构为NH2-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-Thr(tBu)-Asu(OAll)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser[psi(Me,Me)Pro]-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-氨基树脂；
依降钙素肽树脂I以Fmoc-Pro-CTC树脂为固相合成载体，Fmoc-Pro-CTC树脂经溶胀、脱除Fmoc保护基和洗涤后依次从C端至N端缩合Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH得到依降钙素肽树脂I，其结构为Fmoc-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-CTC树脂；
依降钙素片段I的其结构为Fmoc-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-OH；
依降钙素肽树脂II以氨基树脂为固相合成载体，氨基树脂经溶胀、脱去Fmoc保护基和洗涤后，依次从C端至N端缩合Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，得到的依降钙素肽树脂II结构为Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-氨基树脂；
其中，肽片段Fmoc-Val-Leu-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH、和Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH采用液相合成法合成，
其中，二肽片段Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH的合成方法包括：（a）将Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Ser(tBu)-OSu；（b）将Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Asn(Trt)-OH在碱催化下生成Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH；
二肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH的合成方法包括：（a）将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Thr(tBu)-OSu；（b）将Fmoc-Thr(tBu)-OSu和H-Asu(OAll)-OH在碱催化下生成Fmoc-Thr(tBu)-Asu(OAll)-OH；
三肽片段Fmoc-Val-Leu-Gly-OH的合成方法包括：（a）将Fmoc-Val-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Val-OSu；（b）将Fmoc-Val-OSu和H-Leu-OH在碱催化下生成Fmoc-Val-Leu-OH；（c）Fmoc-Val-Leu-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Val-Leu-OSu；（d）将Fmoc-Val-Leu-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Val-Leu-Gly-OH。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Fmoc-Pro-CTC树脂的制备方法包括：将Fmoc-Pro-OH缩合至CTC树脂，并进行封闭反应得到。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，CTC树脂的替代度为0.5-1.5 mmol/g。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备方法包括：将Fmoc-Pro-OH、DIEA和CTC树脂按摩尔质量比为2-5：6：1混合后，在15-35 ℃条件下反应1~5 h；封闭方法包括：将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在15-35 ℃条件下反应20~60 min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Fmoc-Pro-氨基树脂的制备方法包括：将Fmoc-Pro-OH缩合至氨基树脂，并进行封闭反应得到；所述氨基树脂为Rink Amide AM树脂、Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Sieber树脂；所述氨基树脂的替代度为0.2~0.6mmol/g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，缩合反应在缩合体系中进行，所述缩合体系为A/D体系或B/C体系或A/B/C体系，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，A/D体系中A与D的摩尔比为2-5:2-5；B/C体系中B与C的摩尔比为2-5:2-5。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，缩合的氨基酸或肽片段在参与缩合前需进行活化，活化方法包括：将待缩合的氨基酸或肽片段加入到缩合体系中。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氨基酸或肽片段缩合到树脂时，氨基酸或肽片段、A物质、D物质与树脂的摩尔比为2-5:2-5:2-5:1，或者氨基酸或肽片段、B物质、C物质与树脂的摩尔比为2-5:2-5:2-5:1。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，脱除OAll保护基的方法包括以DMF为反应溶剂，添加0.3-0.5倍树脂摩尔量的Pd(Ph3P)4、10倍树脂摩尔量的二甲基巴比妥酸，反应4-8h。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，环化反应在A/D体系或B/C体系或A/B/C体系中进行，其中，A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，裂解依降钙素肽树脂的方法包括：加入裂解液，在15-35 ℃条件下反应2-5 h后，抽滤，将滤液加至预冷的MTBE中进行沉淀、离心，再用MTBE将沉淀洗涤，真空干燥。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，裂解液为TFA、苯甲硫醚、TIS和EDT的水溶液，其中，TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和水的体积比为80-90:2.5-5:2.5-5:2.5-5:2.5-5。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用反相高效液相色谱法对依降钙素粗肽进行两步纯化，其中，第一步纯化的流动相为：流动相A项为0.1%的TFA/H2O（v/v）溶液，流动相B相为0.1%的TFA/ACN（v/v）溶液，第二步纯化为转盐纯化，其流动相为：流动相A相为0.1%的醋酸/H2O（v/v）溶液，流动相B相为0.1%的醋酸/ACN（v/v）溶液。
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