CN111944040B - 一种固相合成阿巴帕肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相树脂及其制备方法和用途。所述方法涉及的固相树脂结构如式I所示；RinkAmide Linker‑AAn‑AM树脂I其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸：Lys、Arg；n为2‑6的整数。所述固相树脂可用于阿巴帕肽的固相合成。该方法的亮点以及优势是使用了带有疏水性的Rink Amide Linker‑AAn‑AM树脂替代传统的固相偶联起始树脂，有效避免了在合成阿巴帕肽肽序过程中由于肽序的β折叠导致产生大量的缺失杂质。同时选用Fmoc‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑OH作为连续Arg‑Arg‑Arg的保护型氨基酸，有效避免了连续精氨酸困难序列偶联导致产生大量的缺失Arg的杂质。本发明工艺操作简单，粗品纯度高，产率高，具备良好的工业化生产前景。
Description
发明领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，尤其涉及阿巴帕肽的固相合成方法。
背景技术
甲状旁腺激素(PTH)是甲状旁腺主细胞分析的碱性单链多肽类激素，它的主要功能是调节脊椎动物体内钙和磷的代谢。甲状旁腺激素的C端肽链与PTH-II受体结合可促进骨细胞凋亡、N端肽链与PTH-I受体结合可促进骨骼重建。
Radius Health公司研制的阿巴帕肽(Abaloparatide)是甲状旁腺激素受体(PTH-I受体)的选择性激活剂，具有良好的成骨活性，已于2017年4月被FDA批准上市，用于治疗处于骨折风险或对其它治疗药物无效的绝经后妇女的骨质疏松症，可有效降低新发椎体和非椎体骨折率。
阿巴帕肽是由34个氨基酸残基组成的多肽，化学结构如下：
Ala1-Val2-Ser3-Glu4-His5-Gln6-Leu7-Leu8-His9-Asp10-Lys11-Gly12-Lys13-Ser14-Ile15-Gln16-Asp17-Leu18-Arg19-Arg20-Arg21-Glu22-Leu23-Leu24-Glu25-Lys26-Leu27-Leu28-Aib29-Lys30-Leu31-His32-Thr33-Ala34-NH2
现有专利情况
专利US6921750和专利CN1254347公开了采用MBHA树脂作为起始树脂固相多肽合成阿巴帕肽，氨基酸均选用Boc保护基团，氨基酸缩合前使用TFA切除Boc保护基，后处理步骤工艺繁琐。同时，需要用剧毒的HF作为裂解试剂，裂解过程中需要通过氮气除去HF，对规模化生产设备要求以及人员防护设备较高，不适合规模化生产。
专利CN106146648A公开了阿巴帕肽的制备方法，首先采用固相合成3个肽树脂片段，三个片段分别为[1-15]、[16-23]、[24-34]，三个片段肽均为长肽链，粗品纯度较低，需要通过纯化制备后用于片段肽连接。片段肽反应过程中需要加大投料量确保反应完全，因此需要合成过量的片段肽树脂，片段肽树脂合成需要大量昂贵的2-CTC树脂，偶联缩合过程中也需要加大氨基酸的投料量，消耗大量原料导致生产成本增加，同时片段合成过程步骤较多，生产连贯性较差，不适合规模化生产。
专利CN108047329A公开了阿巴帕肽的制备方法，采用液相合成四个片段肽，包括如下：Fmoc-Thr(tBu)-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Ala-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH，以氨基树脂作为起始树脂，按照阿巴帕肽肽序从C端至N端依次缩合带有Fmoc保护基的全保护氨基酸以及合成的二肽片段、四肽片段，该方法液相合成短肽较多，虽然避免使用了昂贵的CTC树脂作为原料，但是制备过程非常繁琐，合成产量不高，对于大批量生产可操作性差，不适合规模化生产。
现有的阿巴帕肽固相合成方法存在如下共有技术难点为：现有固相合成法，通过逐一偶联方式或采用片段合成法得到阿巴帕肽，由于肽序中有连续相同的氨基酸残基合成过程中容易发生β折叠导致某些氨基酸的偶联及去保护非常困难，容易产生大量缺失杂质以及化学性质相近的杂质而造成粗品纯度较低，液相纯化难度增加，产品总收率不高。同时阿巴帕肽序列在中含有3个连续的Arg残基，在固相合成反应中Arg属于困难氨基酸，在缩合过程中缩合效率低下，极易产生缺失肽杂质Des-1Arg-阿巴帕肽、Des-2Arg-阿巴帕肽和Des-3Arg-阿巴帕肽。因此，本领域迫切需要找到一种有效合成阿巴帕肽的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿巴帕肽的固相合成方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一条合适的可工业化生产的合成路线，解决如下技术问题：现有固相合成法得到的粗肽纯度低，制备纯化难度较高，产品总收率不高。
本发明主要通过如下方式解决固相合成法得到阿巴帕肽粗肽纯度低，产品总收率不高的技术问题：(1)通过采用Rink Amide Linker-AAn-AM树脂作为起始树脂偶联阿巴帕肽，避免肽序合成过程中肽序β折叠引起某些氨基酸的偶联及去保护非常困难，有效减少脱除Fmoc以及偶联不完全导致的缺失杂质的含量。(2)采用Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH作为连续Arg-Arg-Arg的保护型氨基酸偶联缩合得到阿巴帕肽，粗品中有效降低Des-Arg-阿巴帕肽、Des-2Arg-阿巴帕肽和Des-3Arg-阿巴帕肽的含量。
本发明在制备阿巴帕肽的过程中，所用的起始原料为式I所示的固相合成树脂。
Rink Amide Linker-AAn-AM树脂
I
其中，AA为Lys或Arg；
n为2～6，最优为4
该树脂的侧链保护基团选自：Boc、Pbf。
优选的，式I所示的固相合成树脂为：
Rink Amide Linker-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM，
或者，
Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM。
本发明提供式I所示固相合成树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Fmoc-AAn-OH和AM树脂缩合，得到Fmoc-AAn-AM树脂；
(2)Fmoc-AAn-AM树脂和去保护剂混合、洗涤得到AAn-AM树脂；
(3)将Rink Amide Linker和AAn-AM树脂缩合，得到式I所示的固相合成树脂；
其中，AA为Lys(Boc)或Arg(Pbf)；n为2～6，最优为4。
上述Fmoc-AA-OH及Rink Amide Linker和树脂的缩合在缩合试剂的存在下进行，缩合剂试剂为N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。
本发明式I所示的固相合成树脂在制备阿巴帕肽中的应用。
阿巴帕肽的结构如式II所示，式I式II式III属于现有产品。
本发明的另一个目的在于提供阿巴帕肽的固相合成方法，包括以下步骤：
以式I所示的固相合成树脂为起始树脂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸和脱除Fmoc反应，获得保护型34肽树脂，经裂解后获得阿巴帕肽。
阿巴帕肽的固相合成方法，包括以下步骤：
(1)Rink Amide Linker-AAn-AM树脂进行脱Fmoc反应；
(2)氨基酸缩合反应：Fmoc-Ala-OH在偶联试剂存在下进行缩合反应，洗涤后得到Fmoc-Ala-Rink Amide Linker-AAn-AM树脂；
(3)脱Fmoc反应：按照规定的去保护时间进行脱Fmoc反应，洗涤后得到NH2-Ala-Rink AmideLinker-AAn-AM；
(4)交替重复步骤(2)氨基酸缩合反应和步骤(3)脱Fmoc反应，采用固相合成法将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，直至所有保护型氨基酸偶联完全，即可得到如式III所示阿巴帕肽肽树脂
NH2-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂
III
(5)裂解反应：将阿巴帕肽肽树脂加入到裂解试剂中，室温搅拌反应，过滤，将滤液加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽。
优选的，阿巴帕肽的固相合成方法，包括以下步骤：
1)Rink Amide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成
将AM树脂加入固相反应器，加入DCM溶胀后，将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，偶联反应完全后洗涤树脂，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂；
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备
将CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，随后加入Fmoc-Fmoc-Arg(Pbf)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，经洗涤干燥后得到片段肽树脂Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin；
将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，加入TFEA/DCM搅拌反应，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH固体；
3)阿巴帕肽肽树脂的合成
将Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器，加入DCM溶胀后，加入PIP/DMF进行脱Fmoc反应，将Fmoc-Ala-OH和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，偶联反应完全后洗涤树脂，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，重复以上步骤，依次连接Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，经洗涤干燥后得到阿巴帕肽肽树脂。
4)阿巴帕肽肽树脂的裂解
将阿巴帕肽肽树脂加入到裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应，过滤，将滤液中加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽。
其中，步骤5中的制备方法采用Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH作为连续Arg-Arg-Arg的保护型氨基酸。
其中，步骤5中裂解试剂中含有下述一种或一种以上的混合：三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水、苯甲硫醚、苯甲醚。
其中，Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成：Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的替代度为0.05-0.5mmol/g；优选为0.15-0.35mmol/g，
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备：CTC-Cl树脂的取代值在0.6-1.2mmol/g，优选为0.9-1.1mmol/g，
其中，阿巴帕肽肽树脂的合成：固相合成中使用的偶联剂为DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA；反应溶剂为DMF、NMP、DMSO；反应温度为室温，反应时间为搅拌2-4h，
其中，脱除氨基保护基Fmoc的试剂优选20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺混合溶液，
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin裂解：选用20-30％(V/V)TFEA/DCM或1-10％(V/V)TFA/DCM，室温搅拌1-2h，采用甲基叔丁基醚沉降离心后得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH，
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH合成：偶联缩合剂DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA，优选DIC/HOBt，反应溶剂为DMF、NMP、或混合溶剂，优选DMSO/DMF，室温搅拌2-3h，
其中，所述的裂解试剂为：TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1，室温搅拌2-3h，采用甲基叔丁基醚沉淀阿巴帕肽粗肽。
优选的，本发明所述固相合成阿巴帕肽方法，包括以下步骤：
1)Rink Amide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成
将AM树脂加入固相反应器，加入DCM溶胀后，将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，偶联反应完全后洗涤树脂3次，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂。
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备
将CTC-Cl树脂(CTC-Cl树脂是指用于合成片段肽的起始树脂)加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，随后加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，经洗涤干燥后得到片段肽树脂Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。
将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，加入TFEA/DCM搅拌反应，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH固体。
3)阿巴帕肽肽树脂的合成
将Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器，加入DCM溶胀后，加入PIP/DMF按照规定的去保护时间进行脱Fmoc反应，将Fmoc-Ala-OH和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，偶联反应完全后洗涤树脂3次，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，重复以上步骤，依次连接Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，经洗涤干燥后得到阿巴帕肽肽树脂。
4)阿巴帕肽肽树脂的裂解
将阿巴帕肽肽树脂加入到裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应，过滤，将滤液中加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽。
其中，Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成：RinkAmide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的替代度为0.05-0.5mmol/g；优选为0.15-0.35mmol/g
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备：CTC-Cl树脂的取代值在0.6-1.2mmol/g，优选为0.9-1.1mmol/g。
其中，阿巴帕肽肽树脂的合成：固相合成中使用的偶联剂为DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA；反应溶剂为DMF、NMP、DMSO；反应温度为室温，反应时间为搅拌2-4h。
其中，脱除氨基保护基Fmoc的试剂优选20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺混合溶液。
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin裂解：选用20-30％(V/V)TFEA/DCM或1-10％(V/V)TFA/DCM，室温搅拌1-2h，采用甲基叔丁基醚沉降离心后得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH合成：偶联缩合剂DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA，优选DIC/HOBt，反应溶剂为DMF、NMP、或混合溶剂，优选DMSO/DMF，室温搅拌2-3h。
其中，所述的裂解试剂为：TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1，室温搅拌2-3h，采用甲基叔丁基醚沉淀阿巴帕肽粗肽。
优选的，起始树脂为：Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM Resin，
Arg偶联方式为：Fmoc--Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段偶联，
偶联活化试剂为：DIEA/HOBt/PyBop，
反应溶剂为：DMSO/DMF。
进一步优选的，阿巴帕肽的合成方法，包括以下步骤：
1)Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成
将AM树脂加入固相反应器，加入DMF溶胀，用DMF洗涤两遍，把Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOBt溶解于DMF中，于0-10℃加入DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性，
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂。
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备
将CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，于0-10℃加入DIC，预活化，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤。加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性，重复以上步骤再次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH，经洗涤干燥后得到片段肽树脂Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。
将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，并加入TFEA/DCM搅拌反应1-2h，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH固体。
3)阿巴帕肽肽树脂的合成
将上述得到的Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器，加入DMF溶胀，用DMF洗涤两遍，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性。把Fmoc-Ala-OH和HOBt溶解于DMF中，于0-10℃加入DIC，预活化，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性。重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，经洗涤干燥后得到阿巴帕肽肽树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：把片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、PyBop、HOBt溶解于DMSO/DMF中，于0-10℃加入DIEA，预活化，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤，
4)阿巴帕肽肽树脂的裂解
将上述得到阿巴帕肽肽树脂加入0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应，过滤裂解液，将滤液中加入到0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽。
5)阿巴帕肽粗肽的制备
粗肽的溶解：将阿巴帕肽粗品，加纯化水搅拌溶解，用滤膜过滤，即可得到阿巴帕肽粗品。
根据实施例之一，阿巴帕肽的合成方法，包括以下步骤：
1)Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成
称取10.0g AM树脂加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，称量14.1g Fmoc-Lys(Boc)-OH和4.05g HOBt溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂。
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备
称量30.0g CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入210ml DCM溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH 29.2g和DIEA 20.4ml，室温搅拌3小时。过滤，采用DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次。
称量58.4g Fmoc-Arg(Pbf)-OH和12.2g HOBt溶于80ml DMF中，于0-10℃加入16.7ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性，重复以上步骤再次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH，经洗涤干燥后得到片段肽树脂Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。
将70g Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，并加入0.7L20％TFEA/DCM搅拌反应1-2h，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH固体。
3)阿巴帕肽肽树脂的合成
将上述得到的Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。称量9.34g Fmoc-Ala-OH和4.05g HOBt溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，经洗涤干燥后得到阿巴帕肽肽树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：称量30.78g片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、10.4g PyBop、2.7g HOBt溶解于50ml DMSO/DMF中，于0-10℃加入3.4ml DIEA，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。
4)阿巴帕肽肽树脂的裂解
将上述得到阿巴帕肽肽树脂加入加入1L 0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到10L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽。
5)阿巴帕肽粗肽的制备
粗肽的溶解：将阿巴帕肽粗品30g，加0.3L纯化水搅拌溶解，用0.45um滤膜过滤，即可得到阿巴帕肽粗品溶液，待纯化。
阿巴帕肽粗品的纯化工艺步骤：
经转盐后得到阿巴帕肽醋酸盐纯品溶液，浓缩，冷冻干燥后得到阿巴帕肽成品。
以下通过实验数据说明本发明的有益成果
1、不同起始树脂固相合成阿巴帕肽粗品纯度以及粗品收率对比
通过选用不同的起始树脂偶联合成得到阿巴帕肽，选用TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1体系裂解得到阿巴帕肽粗品，对比不同起始树脂合成得到的阿巴帕肽粗品纯度以及粗品收率。
使用不同起始树脂合成得到阿巴帕肽粗品纯度以及粗品收率结果如下：
2、不同个数疏水性氨基酸起始树脂固相合成阿巴帕肽粗品纯度以及粗品收率对比
通过选用不同个数疏水性氨基酸起始树脂固相偶联合成得到阿巴帕肽，选用TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1体系裂解得到阿巴帕肽粗品，对比不同个数疏水性氨基酸起始树脂合成得到的阿巴帕肽粗品纯度以及粗品收率。
使用不同个数疏水性氨基酸起始树脂合成得到阿巴帕肽粗品纯度以及粗品收率结果如下：
3、Fmoc-Arg(Pbf)-OH逐个偶联以及Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段固相合成阿巴帕肽粗品纯度对比
通过选用不同Arg偶联方式合成得到阿巴帕肽，选用TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1体系裂解得到阿巴帕肽粗品，对比不同Arg偶联方式合成得到的阿巴帕肽粗品纯度，同时考察阿巴帕肽粗品中对比Des-Arg杂质/Des-2Arg杂质/Des-3Arg杂质的含量。使用不同Arg偶联方式合成得到阿巴帕肽粗品纯度以及杂质的含量结果如下：
4、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH偶联试剂以及反应溶剂的筛选
由于阿巴帕肽肽序中有连续Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)，选用Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH片段替代Fmoc-Arg(Pbf)-OH逐个偶联，由于片段偶联过程中存在反应不完全的情况，导致大大增加粗品中Des-3Arg杂质含量，粗品纯度下降明显。通过筛选Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH偶联活化试剂以及反应溶剂，优化偶联反应效率，提高粗品纯度，选用DIC/HOBt、DIEA/HOBt/PyBop、DIEA/HOBt/HBTU这三种活化试剂以及DMF、DMSO、DMSO/DMF这三种反应溶剂作为Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH片段偶联试剂以及反应溶剂，同时在阿巴帕肽粗品中检测对比Des-3Arg杂质的含量。
使用不同偶联活化试剂偶联Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH合成得到阿巴帕肽粗品纯度以及杂质的含量结果如下：
| 偶联活化试剂 | 粗肽纯度 | Des-3Arg杂质含量 |
| DIC/HOBt | 79.24％ | 0.52％ |
| DIEA/HOBt/PyBop | 80.56％ | 0.08％ |
| DIEA/HOBt/HBTU | 80.18％ | 0.23％ |
使用不同反应溶剂偶联Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH合成得到阿巴帕肽粗品纯度以及杂质的含量结果如下：
| 反应溶剂 | 粗肽纯度 | Des-3Arg杂质含量 |
| DMF | 80.39％ | 0.28％ |
| DMSO | 81.57％ | 0.25％ |
| DMSO/DMF | 82.78％ | 0.05％ |
附图说明
图1显示了本发明提供的阿巴帕肽的合成工艺流程图。
图2显示了实施例制备得到的阿巴帕肽成品的HPLC图。
图3显示了实施例制备得到的阿巴帕肽成品的LC-MS图。
具体实施方式
上述描述和实施例中所采用的缩写及其代表如下
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本发明中涉及的结构式入下表所示：
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通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为限制。
实施例1：Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备
称量30.0g CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入210ml DCM溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH 29.2g和DIEA 21ml，室温搅拌3小时。过滤，采用DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次。
称量58.4g Fmoc-Arg(Pbf)-OH和12.2g HOBt溶于800ml DMF中，于0-10℃加入16.7ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性，重复以上步骤再次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH，经洗涤干燥后得到片段肽树脂Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。
将70g Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，并加入700ml20％TFEA/DCM搅拌反应1-2h，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH固体。
实施例2：起始Rink Amide AM树脂合成阿巴帕肽
称取20.0g Rink Amide AM树脂(10mmol，替代度0.5mmol/g)加入固相反应器，加入140ml DMF溶胀30min，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。称量9.33g Fmoc-Ala-OH(3.0eq)和4.05g HOBt(3.0eq)溶解于100ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC(3.6eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到阿巴帕肽肽树脂77g。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：称量30.78g片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、10.4g PyBop、2.7g HOBt溶解于50ml DMSO/DMF中，于0-10℃加入3.4ml DIEA，预活化5-10min，，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。
将上述肽树脂77g加入745ml 0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到7.7L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为73.59％，粗品收率为41.5％。
实施例3：起始Rink Amide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂合成阿巴帕肽
称取10gAM树脂(10mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，称量14.06gFmoc-Lys(Boc)-OH和4.05g HOBt溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂。
将上述Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器中，溶胀30min后，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。称量9.33g Fmoc-Ala-OH(3.0eq)和4.05g HOBt(3.0eq)溶解于100ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC(3.6eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到阿巴帕肽肽树脂74.5g。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：称量30.78g片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、10.4g PyBop、2.7g HOBt溶解于50ml DMSO/DMF中，于0-10℃加入3.4ml DIEA，预活化5-10min，，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。
将上述肽树脂74.5g加入745ml 0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到7.5L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为83.13％，粗品收率为56.3％。
实施例4：起始Rink Amide-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM树脂合成阿巴帕肽
称取10gAM树脂(10mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，称量19.46g Fmoc-Arg(Pbf)-OH和4.05g HOBt溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM树脂。
将上述Rink Amide Linker-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM树脂加入固相反应器中，溶胀30min后，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。称量9.33g Fmoc-Ala-OH(3.0eq)和4.05g HOBt(3.0eq)溶解于100ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC(3.6eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到阿巴帕肽肽树脂71.8g。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：称量30.78g片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、10.4g PyBop、2.7g HOBt溶解于50ml DMSO/DMF中，于0-10℃加入3.4ml DIEA，预活化5-10min，，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。
将上述肽树脂74.5g加入745ml 0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到7.5L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为80.24％，粗品收率为53.4％。
实施例5：起始Rink Amide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂合成阿巴帕肽
称取10g AM树脂(10mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，称量14.06g Fmoc-Lys(Boc)-OH和4.05g HOBt溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到RinkAmide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂。
将上述Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器中，溶胀30min后，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。称量9.33g Fmoc-Ala-OH(3.0eq)和4.05g HOBt(3.0eq)溶解于100ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC(3.6eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到阿巴帕肽肽树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：称量30.78g片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、10.4g PyBop、2.7g HOBt溶解于50ml DMSO/DMF中，于0-10℃加入3.4ml DIEA，预活化5-10min，，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。
将上述肽树脂78g加入780ml 0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到7.8L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为80.56％，粗品收率为53.8％。
实施例6：起始Rink Amide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂合成阿巴帕肽
称取10gAM树脂(10mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，称量14.06gFmoc-Lys(Boc)-OH和4.05g HOBt溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂。
将上述Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器中，溶胀30min后，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。称量9.33g Fmoc-Ala-OH(3.0eq)和4.05g HOBt(3.0eq)溶解于100ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC(3.6eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到阿巴帕肽肽树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：称量30.78g片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、10.4g PyBop、2.7g HOBt溶解于50ml DMSO/DMF中，于0-10℃加入3.4ml DIEA，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。
将上述肽树脂75g加入750ml 0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到7.5L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为81.67％，粗品收率为51.4％。
实施例7：起始Rink Amide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂逐个偶联合成阿巴帕肽
称取10gAM树脂(10mmol，替代度1.0mmol/g)加入固相反应器，加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍。加入70ml DMF溶胀30min，用DMF洗涤两遍，称量14.06gFmoc-Lys(Boc)-OH和4.05g HOBt溶解于50ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂。
将上述Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器中，溶胀30min后，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。称量9.33g Fmoc-Ala-OH(3.0eq)和4.05g HOBt(3.0eq)溶解于100ml DMF中，于0-10℃加入5.6ml DIC(3.6eq)，预活化5-10min，加入固相反应器中，鼓氮气反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次，MeOH洗涤2次，干燥后可得到阿巴帕肽肽树脂。
将上述肽树脂73g加入770ml 0-10℃的裂解试剂(TFA∶Thio∶EDT∶TIS∶H2O＝90∶5∶2∶2∶1)中，室温搅拌反应3h，过滤裂解液，将滤液中加入到7.3L 0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽，HPLC纯度(面积归一化法)为78.11％，粗品收率为46.8％
实例8：阿巴帕肽粗品纯化制备
粗品的溶解：将阿巴帕肽粗品30g，加0.3L纯化水搅拌溶解，用0.45um滤膜过滤，即可得到阿巴帕肽粗品溶液，待纯化。
阿巴帕肽粗品的纯化工艺步骤如下：
根据上述纯化工艺步骤制备阿巴帕肽粗品溶液，各个步骤中控检测纯化杂质去除情况，具体如下：
经转盐后得到阿巴帕肽醋酸盐纯品溶液，浓缩至150ml，冷冻干燥后得到15.2g阿巴帕肽成品，HPLC纯度为99.97％，单杂低于0.10％，总收率为50.6％。成品送检质谱确认为阿巴帕肽目标产物分子量(3960.59)，阿巴帕肽在质谱中主要为带四个到八个电荷的分子碎片峰，分别为991.29(M+4H)/4、793.33(M+5H)/5、/661.28(M+6H)/6、566.98(M+7H)/7、496.22(M+8H)/8.
Claims (9)
1.一种结构如式Ⅰ所示的固相合成树脂在制备阿巴帕肽中的应用，其特征在于，所述树脂结构如下：
Rink Amide Linker-AAn-AM树脂
I
其中，AA为Lys或Arg；
n为2～6，
该树脂的侧链保护基团选自：Boc、Pbf。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，式Ⅰ所示的固相合成树脂为
Rink Amide Linker-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AM，
或者，
Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的固相合成树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Fmoc-AAn-OH和AM树脂缩合，得到Fmoc-AAn-AM树脂；
(2)Fmoc-AAn-AM树脂和去保护剂混合、洗涤得到AAn-AM树脂；
(3)将Rink Amide Linker和AAn-AM树脂缩合，得到式Ⅰ所示的固相合成树脂；
其中，AA为Lys(Boc)或Arg(Pbf)；n为2～6。
4.一种阿巴帕肽的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
以权利要求1或2中所述的任意一个固相合成树脂为起始树脂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸和脱除Fmoc反应，获得保护型34肽树脂，经裂解后获得阿巴帕肽。
5.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)Rink Amide Linker-AAn-AM树脂进行脱Fmoc反应；
(2)氨基酸缩合反应：Fmoc-Ala-OH在偶联试剂存在下进行缩合反应，洗涤后得到Fmoc-Ala-Rink Amide Linker-AAn-AM树脂；
(3)脱Fmoc反应：按照规定的去保护时间进行脱Fmoc反应，洗涤后得到NH2-Ala-RinkAmide Linker-AAn-AM；
(4)交替重复步骤(2)氨基酸缩合反应和步骤(3)脱Fmoc反应，采用固相合成法将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，直至所有保护型氨基酸偶联完全，即可得到如式III所示阿巴帕肽肽树脂，
NH2-Ala-Val–Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)–Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Rink Amide Linker-AAn-AM树脂
III
(5)裂解反应：将阿巴帕肽肽树脂加入到裂解试剂中，室温搅拌反应，过滤，将滤液加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽。
6.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)Rink Amide-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成
将AM树脂加入固相反应器，加入DCM溶胀后，将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，偶联反应完全后洗涤树脂，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Bo c)-Lys(Boc)-AM树脂；
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备
将CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，随后加入Fmoc-Fmoc-Arg(Pbf)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，加入DIC，预活化，随后加入固相反应器中，搅拌反应，抽干，DMF洗涤,经洗涤干燥后得到片段肽树脂Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin；
将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，加入TFEA/DCM搅拌反应，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH固体；
3)阿巴帕肽肽树脂的合成
将Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器，加入DCM溶胀后，加入PIP/DMF进行脱Fmoc反应，将Fmoc-Ala-OH和HOBt溶解于DMF中，在加入DIC，随后加入到固相反应器中，偶联反应完全后洗涤树脂，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，重复以上步骤，依次连接Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，经洗涤干燥后得到阿巴帕肽肽树脂，
4)阿巴帕肽肽树脂的裂解
将阿巴帕肽肽树脂加入到裂解试剂(TFA：Thio：EDT：TIS：H2O＝90：5：2：2：1)中，室温搅拌反应，过滤，将滤液中加入到甲基醚中沉降析出粗品固体，离心，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽。
7.根据权利要求5所述的固相合成方法，其特征在于，
其中，Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成：Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的替代度为0.05-0.5mmol/g；
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备：CTC-Cl树脂的取代值在0.6-1.2mmol/g，
其中，阿巴帕肽肽树脂的合成：固相合成中使用的偶联剂为DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA；反应溶剂为DMF、NMP、DMSO；反应温度为室温，反应时间为搅拌2-4h，
其中，脱除氨基保护基Fmoc的试剂为20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin裂解：选用20-30％(V/V)TFEA/DCM或1-10％(V/V)TFA/DCM，室温搅拌1-2h，采用甲基叔丁基醚沉降离心后得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH，
其中，Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH合成：偶联缩合剂DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/HOBt/DIEA、HBTU/Cl-HOBt/DIEA、PyBop/HOBt/DIEA、PyBop/Cl-HOBt/DIEA，反应溶剂为DMF、NMP、或混合溶剂，室温搅拌2-3h，
其中，所述的裂解试剂为：TFA：Thio：EDT：TIS：H2O＝90：5：2：2：1，室温搅拌2-3h，采用甲基叔丁基醚沉淀阿巴帕肽粗肽。
8.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于，
起始树脂为：Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AMResin，
Arg偶联方式为：Fmoc--Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段偶联，
偶联活化试剂为：DIEA/HOBt/PyBop，
反应溶剂为：DMSO/DMF。
9.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂的合成
将AM树脂加入固相反应器，加入DMF溶胀，用DMF洗涤两遍，把Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOBt溶解于DMF中，于0-10℃加入DIC，预活化5-10min，加入固相反应器中，搅拌反应，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性，
重复以上步骤，依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Rink Amide-Linker，得到Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂，
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH制备
将CTC-Cl树脂加入固相合成反应釜，加入DCM溶胀，用DMF洗涤，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH和DIEA，室温搅拌，过滤，采用DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOBt溶于DMF中，于0-10℃加入DIC，预活化，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性，重复以上步骤再次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH，经洗涤干燥后得到片段肽树脂Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin，
将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin加入圆底烧瓶中，并加入TFEA/DCM搅拌反应1-2h，过滤收集滤液，将滤液浓缩至油状后，加入甲基叔丁基醚析出粗品固体，离心，干燥得到片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH固体，
3)阿巴帕肽肽树脂的合成
将上述得到的Rink Amide Linker-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-AM树脂加入固相反应器，加入DMF溶胀，用DMF洗涤两遍，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性，把Fmoc-Ala-OH和HOBt溶解于DMF中，于0-10℃加入DIC，预活化，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤，加入PIP/DMF脱Fmoc保护，DMF洗涤，茚三酮检测呈阳性，重复以上步骤，依次连接Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH，经洗涤干燥后得到阿巴帕肽肽树脂，
其中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的偶联反应条件为：把片段肽Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、PyBop、HOBt溶解于DMSO/DMF中，于0-10℃加入DIEA，预活化，加入固相反应器中，搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤，
4)阿巴帕肽肽树脂的裂解
将上述得到阿巴帕肽肽树脂加入0-10℃的裂解试剂(TFA：Thio：EDT：TIS：H2O＝90：5：2：2：1)中，室温搅拌反应，过滤裂解液，将滤液中加入到0-10℃的甲基醚中沉降析出粗品固体，洗涤干燥后得到阿巴帕肽粗肽，
5)阿巴帕肽粗肽的制备
粗肽的溶解：将阿巴帕肽粗品，加纯化水搅拌溶解，用滤膜过滤，即可得到阿巴帕肽粗品。
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| GR01 | Patent grant | ||
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