CN113583106A - 一种索玛鲁肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种索玛鲁肽固相合成方法，属于多肽合成技术领域，所述方法包括以下步骤：以氨基树脂载体，第一个氨基酸Gly使用特殊的经取代的苄基修饰后的结构，通过固相合成法连接主链至Lys26，再连接侧链后，继续完成剩余主链的连接，得到全肽树脂。酸解同步进行脱侧链保护基及切肽，得到索玛鲁肽粗品，经纯化、冻干得到索玛鲁肽纯品。本发明采用了经特殊取代苄基修饰后的Gly，可使用氨基树脂作为载体，避免了传统使用Wang树脂或CTC树脂连接时肽链易从载体脱落而导致的合成收率低的问题。同时避免了C端[+Gly]杂质的产生，所得粗品纯度高，易于纯化，具有较好的应用前景。
Description
技术领域：本发明涉及多肽药物制备领域，尤其是涉及一种固相法制备索玛鲁肽的方法
背景技术：
中文名：索玛鲁肽
英文名：Semaglutide
肽序列：H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG2-PEG2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
分子量：4113.6
CAS:910463-68-2
索玛鲁肽(Semaglutide)是一种新的长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，原研产品由诺和诺德公司研发。适用于成人2型糖尿病，可使患者血糖水平大幅改善，并降低低血糖风险。于2017年获得FDA批准上市。其结构是GLP-1(7-37)链上8号位的Ala被Aib取代，34号位的Lys被Arg取代，并在26号位的Lys侧链上连接了短链P EG，谷氨酸及十八烷二酸脂肪链修饰。
使用固相合成法，因其操作简便，后处理简单，是大批量生产多肽的常规方式。对于索玛鲁肽这样C端为羧酸基团肽链，大都使用Wang树脂或CTC树脂。如CN108059666B、CN110372785B。本发明人在实验过程中发现，Wang树脂的缺点在于，当使用主链带有Dde保护基的Lys连接Lys26，在连接完侧链之后，需要在固相树脂上使用水合肼溶液脱除Dde保护基。肽链与Wang树脂结合的酯结构会发生大量肼解，使得肽链从固相树脂上脱落而导致合成收率大幅降低。CTC树脂的缺点在于其本身对于温度等较敏感，在固相合成中别是像索玛鲁肽这样长链的合成过程中，也会发生肽链从树脂上脱落，使得合成收率大幅降低。此外，由于索玛鲁肽序列C端首个氨基酸为Gl y，由于Gly自身结构的特点，使其在连接树脂载体时极易产生[+Gly]的杂质，此杂质与目标肽的性质相近，在纯化时难易分离，导致产品收率降低。
发明内容：
有鉴于此，开发一种避免合成过程中肽链脱落，合成收率高且节约成本的索玛鲁肽制备方法十分必要。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种索玛鲁肽的制备方法，包括：
步骤1)将经取代的苄基修饰后的Gly与氨基树脂缩合得到Gly-氨基树脂。
第37号位Gly采用如下结构的砌块，结构式：
步骤2)取步骤1制得的Gly-氨基树脂，按照索玛鲁肽主链序列，利用固相合成法连接保护的氨基酸或多肽至Glu27。
步骤3)使用主链带有Dde保护基的Lys连接Lys26，按照侧链序列连接侧链至十八烷二酸。
步骤4)脱除Lys26主链保护基Dde，按照主链序列，利用固相合成法连接保护的氨基酸或多肽连接至His7。裂解肽树脂得到粗品，经纯化、冻干后得到索玛鲁肽纯品。
作为优选，步骤1)合成Gly-氨基树脂所用的树脂为MBHA树脂，其初始取代度为0.1～0.8mmol/g。因为肽链序列比较长，取代度过高，会导致连接更加困难；取代度过低，会对试剂造成浪费，对生产设备的规模和性能提出过高的要求，没法进行大规模工业化生产。
作为优选，步骤1)中使用的Gly为结构式1和结构式4，有效避免了传统使用W ang树脂或CTC树脂收率低及C端产生[+Gly]杂质的问题。
作为优选，步骤2)、步骤3)、步骤4)中偶联的偶联试剂为HOBt、HOAt与DIC的混合物，或PyAop、PyBop与碱的混合物，或HBTU、HATU与碱的混合物。其中，有机碱选自DIPEA、NMM中的一种。更优选为HOBt与DIC的组合。
作为优选，步骤1)和步骤2)中氨基酸与缩合试剂的比例为1:0.9～1:1。
作为优选，步骤4)中所用的裂解试剂包括三氟乙酸，茴香硫醚，苯甲醚，三异丙基硅烷，苯酚，1,2-乙二硫醇，水等。更为优选，裂解试剂的比例为三氟乙酸：茴香硫醚：三异丙基硅烷：1,2-乙二硫醇：水＝90：2.5：2.5：2.5：2.5。
优点和好处
1、采用了经取代的苄基修饰后的Gly与氨基树脂缩合得到Gly-氨基树脂，与传统的CTC树脂相比，肽链的连接可以在较高的温度下顺利完成。合成反应更快，从而提高了合成收率；反应更完全，减少了粗品中产生的缺失肽杂质。与采用Wang树脂相比，可以在使用水合肼溶液脱除Dde保护基的过程中，避免肽链与Wang树脂结合的酯结构会发生大量肼解，从而大幅提高收率，提高幅度可以达到30％-40％，大幅节约了成本。
2、结构式1和4的采用，一方面这两种结构本身更容易制备，所用原料成本低，另一方面，结构式1和4连接到固相载体上后，位阻较小，有利于后续肽链的连接。整体上，进一步节约了成本，提高了收率。
3、采用了经取代的苄基修饰后的Gly与氨基树脂缩合得到Gly-氨基树脂，溶胀性能更好，有利于后续肽链的连接。整体上，进一步节约了成本，提高了收率。
4、由于Gly自身结构的特点，使其在连接树脂载体时极易产生[+Gly]的杂质，此杂质与目标肽的性质相近，在纯化时难易分离，导致产品收率降低。而采用经取代的苄基修饰后的Gly与氨基树脂缩合得到Gly-氨基树脂，避免了此位点[+Gly]的杂质的产生，从而降低了纯化难度，提高了产品收率。
5、MBHA树脂的采用，进一步降低了成本，更适于大规模生产。
6、裂解试剂的比例，进一步避免了保护基未脱除完全杂质的产生，进一步提高了粗品纯度。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种索玛鲁肽的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，进行包括分段方法以及缩合条件等工艺参数的改进。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
实施例1：
称取取代度为0.5mmol/g的空白MBHA树脂50.00g(40mmol)，加入三倍树脂体积的5％NMM/DMF溶胀2h以上，抽去溶剂。将如结构式1所示的Gly 46.0g，HBTU28.8g混合后加入DMF溶解，再加入2当量于氨基酸的NMM 17.9mL，在10-20℃下活化10-20min。最后缓慢加入至溶胀好的MBHA树脂中，搅拌反应2h后至茚三酮检测为阴性。抽去反应液，用DMF洗涤3次。得到Gly(结构式1)-MBHA树脂。
将制备所得的Gly(结构式1)-MBHA树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取77.8gFmoc-Arg(Pbf)-OH(120mmol)，16.2g HOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mLDIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽序列，从C端到N端依次使用Fmoc-Gly35-OH，Fmoc-Arg(Pbf)34-OH，Fmoc-Val33-OH，Fmoc-Leu32-OH，Fmoc-Trp(Boc)31-OH，Fmoc-Ala30-OH，Fmoc-Ile29-OH，Fmoc-Phe28-OH，Fmoc-Glu(OtBu)27-OH完成连接至Glu27。完成Fmoc-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-MBHA树脂的制备。
将前述的Fmoc-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-MBHA树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取63.9gDde-Lys(Fmoc)-OH(120mmol)，16.2g HOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mLDIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu，十八烷二酸单叔丁酯完成连接至Lys26。得到Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-MBHA树脂。
将前述制备所得的Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-MBHA树脂.加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取37.4g Fmoc-Ala-OH(120mmol)，16.2gHOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-Ala24-OH,Fmoc-Gln(Trt)23-OH,Fmoc-Gly22-OH,Fmoc-Glu(OtBu)21-OH,Fmoc-Leu20-OH,Fmoc-Tyr(tBu)19-OH,Fmoc-Ser(tBu)18-OH,Fmoc-Ser(tBu)17-OH,Fmoc-Val16-OH,Fmoc-Asp(OtBu)15-OH,Fmoc-Ser(tBu)14-OH,Fmoc-Thr(tBu)13-OH,Fmoc-Phe12-OH,Fmoc-Thr(tBu)11-OH,Fmoc-Gly10-OH,Fmoc-Glu(OtBu)9-OH,Fmoc-Aib8-OH,Fmoc-His(Trt)7-OH，脱除最后的Fmoc保护基后，完成连接至His7。甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。
将干燥过夜后的H-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-MBHA树脂置于裂解反应器中，以15mL/g树脂的比例加入裂解试剂(三氟乙酸/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇/三异丙基硅烷/水＝90/2.5/2.5/2.5/2.5)室温搅拌3h。反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，将合并后的滤液加入至预冷的无水乙醚中，离心收集沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到固体，即索玛鲁肽粗品肽，粗品收率为：98％，HPLC纯度为68.60％。
实施例2：
称取取代度为0.5mmol/g的空白MBHA树脂50.00g，加入三倍树脂体积的5％NMM/DMF溶胀2h以上，抽去溶剂。将如结构式4所示的Gly46.0 g，HBTU 28.8g混合后加入DMF溶解，再加入2当量于氨基酸的NMM 17.9mL，在10-20℃下活化10-20min。最后缓慢加入至溶胀好的MBHA树脂中，搅拌反应2h后至茚三酮检测为阴性。抽去反应液，用DMF洗涤3次。
将制备所得的Gly(结构式4)-MBHA树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取77.8gFmoc-Arg(Pbf)-OH(120mmol)，16.2gHOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽序列，从C端到N端依次使用Fmoc-Gly35-OH，Fmoc-Arg(Pbf)34-OH，Fmoc-Val33-OH，Fmoc-Leu32-OH，Fmoc-Trp(Boc)31-OH，Fmoc-Ala30-OH，Fmoc-Ile29-OH，Fmoc-Phe28-OH，Fmoc-Glu(OtBu)27-OH完成连接至Glu27。完成Fmoc-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式4)37-MBHA树脂的制备。
将前述的树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取63.9gDde-Lys(Fmoc)-OH(120mmol)，16.2gHOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu，十八烷二酸单叔丁酯完成连接至Lys26。得到Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式4)37-MBHA树脂。
将前述制备所得的Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式4)37-MBHA树脂.加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取37.4g Fmoc-Ala-OH(120mmol)，16.2gHOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-Ala24-OH,Fmoc-Gln(Trt)23-OH,Fmoc-Gly22-OH,Fmoc-Glu(OtBu)21-OH,Fmoc-Leu20-OH,Fmoc-Tyr(tBu)19-OH,Fmoc-Ser(tBu)18-OH,Fmoc-Ser(tBu)17-OH,Fmoc-Val16-OH,Fmoc-Asp(OtBu)15-OH,Fmoc-Ser(tBu)14-OH,Fmoc-Thr(tBu)13-OH,Fmoc-Phe12-OH,Fmoc-Thr(tBu)11-OH,Fmoc-Gly10-OH,Fmoc-Glu(OtBu)9-OH,Fmoc-Aib8-OH,Boc-His(Trt)7-OH，完成连接至His7。甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。
将干燥过夜后的Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-MBHA树脂置于裂解反应器中，以15mL/g树脂的比例加入裂解试剂(三氟乙酸/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇/三异丙基硅烷/水＝90/2.5/2.5/2.5/2.5)室温搅拌3h。反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，将合并后的滤液加入至预冷的无水乙醚中，离心收集沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到固体，即索玛鲁肽粗品肽，粗品收率为：95％，HPLC纯度为65.85％。
实施例3
称取取代度为0.5mmol/g的空白Sieber树脂50.00g，加入三倍树脂体积的5％NMM/DMF溶胀2h以上，抽去溶剂。将如结构式1所示的Gly46.0 g，HBTU 28.8g混合后加入DMF溶解，再加入2当量于氨基酸的NMM 17.9mL，在10-20℃下活化10-20min。最后缓慢加入至溶胀好的Sieber树脂中，搅拌反应2h后至茚三酮检测为阴性。抽去反应液，用DMF洗涤3次。得到Gly(结构式1)-Sieber树脂。
将制备所得的Gly(结构式1)-Sieber树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取77.8gFmoc-Arg(Pbf)-OH(120mmol)，16.2gHOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽序列，从C端到N端依次使用Fmoc-Gly35-OH，Fmoc-Arg(Pbf)34-OH，Fmoc-Val33-OH，Fmoc-Leu32-OH，Fmoc-Trp(Boc)31-OH，Fmoc-Ala30-OH，Fmoc-Ile29-OH，Fmoc-Phe28-OH，Fmoc-Glu(OtBu)27-OH完成连接至Glu27。完成Fmoc-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-Sieber树脂的制备。
将前述的Fmoc-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-Sieber树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取63.9gDde-Lys(Fmoc)-OH(120mmol)，16.2gHOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu，十八烷二酸单叔丁酯完成连接至Lys26。得到Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-Sieber树脂。
将前述制备所得的Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-Sieber树脂.加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取37.4g Fmoc-Ala-OH(120mmol)，16.2gHOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-Ala24-OH,Fmoc-Gln(Trt)23-OH,Fmoc-Gly22-OH,Fmoc-Glu(OtBu)21-OH,Fmoc-Leu20-OH,Fmoc-Tyr(tBu)19-OH,Fmoc-Ser(tBu)18-OH,Fmoc-Ser(tBu)17-OH,Fmoc-Val16-OH,Fmoc-Asp(OtBu)15-OH,Fmoc-Ser(tBu)14-OH,Fmoc-Thr(tBu)13-OH,Fmoc-Phe12-OH,Fmoc-Thr(tBu)11-OH,Fmoc-Gly10-OH,Fmoc-Glu(OtBu)9-OH,Fmoc-Aib8-OH,Fmoc-His(Trt)7-OH，脱除最后的Fmoc保护基后，完成连接至His7。甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。
将干燥过夜后的H-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-Sieber树脂置于裂解反应器中，以15mL/g树脂的比例加入裂解试剂(三氟乙酸/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇/三异丙基硅烷/水＝90/2.5/2.5/2.5/2.5)室温搅拌3h。反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，将合并后的滤液加入至预冷的无水乙醚中，离心收集沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到固体，即索玛鲁肽粗品肽，粗品收率为：97％，HPLC纯度为66.70％。
实施例4
称取取代度为0.5mmol/g的空白AM树脂50.00g，加入三倍树脂体积的5％NMM/DMF溶胀2h以上，抽去溶剂。将如结构式1所示的Gly 46.0g，HBTU 28.8g混合后加入DMF溶解，再加入2当量于氨基酸的NMM 17.9mL，在10-20℃下活化10-20min。最后缓慢加入至溶胀好的AM树脂中，搅拌反应2h后至茚三酮检测为阴性。抽去反应液，用DMF洗涤3次。得到Gly(结构式1)-AM树脂。
将制备所得的Gly(结构式1)-AM树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取77.8gFmoc-Arg(Pbf)-OH(120mmol)，16.2g HOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mLDIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽序列，从C端到N端依次使用Fmoc-Gly35-OH，Fmoc-Arg(Pbf)34-OH，Fmoc-Val33-OH，Fmoc-Leu32-OH，Fmoc-Trp(Boc)31-OH，Fmoc-Ala30-OH，Fmoc-Ile29-OH，Fmoc-Phe28-OH，Fmoc-Glu(OtBu)27-OH完成连接至Glu27。完成Fmoc-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-AM树脂的制备。
将前述的Fmoc-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-AM树脂。加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入加入1.0倍树脂体积的20％哌啶的DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取63.9gDde-Lys(Fmoc)-OH(120mmol)，16.2g HOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu，十八烷二酸单叔丁酯完成连接至Lys26。得到Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-AM树脂。
将前述制备所得的Dde-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-γ-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-AM树脂.加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应5min，抽去脱保护液。再加入1.0倍树脂体积的3％水合肼/DMF溶液反应15min，抽去脱保护液。树脂层使用1.0倍树脂体积的DMF洗涤树脂8次。茚三酮检测为阳性。称取37.4g Fmoc-Ala-OH(120mmol)，16.2g HOBt(120mmol)，溶于DMF中，冰水浴下加入18.6mL DIC(120mmol)活化10-15min。将活化后的反应液加入至反应器中，20-40℃下反应至茚三酮检测为阴性。反应结束后抽干反应液，加入DMF洗涤树脂3次。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应保护的氨基酸或保护的多肽偶联的步骤，按照索玛鲁肽侧链序列，依次使用Fmoc-Ala24-OH,Fmoc-Gln(Trt)23-OH,Fmoc-Gly22-OH,Fmoc-Glu(OtBu)21-OH,Fmoc-Leu20-OH,Fmoc-Tyr(tBu)19-OH,Fmoc-Ser(tBu)18-OH,Fmoc-Ser(tBu)17-OH,Fmoc-Val16-OH,Fmoc-Asp(OtBu)15-OH,Fmoc-Ser(tBu)14-OH,Fmoc-Thr(tBu)13-OH,Fmoc-Phe12-OH,Fmoc-Thr(tBu)11-OH,Fmoc-Gly10-OH,Fmoc-Glu(OtBu)9-OH,Fmoc-Aib8-OH,Fmoc-His(Trt)7-OH，脱除最后的Fmoc保护基后，完成连接至His7。甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。
将干燥过夜后的H-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(Octadecanedioic(tBu)-Glu(OtBu)-PEG2-PEG2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36–Gly(结构式1)37-AM树脂置于裂解反应器中，以15mL/g树脂的比例加入裂解试剂(三氟乙酸/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇/三异丙基硅烷/水＝90/2.5/2.5/2.5/2.5)室温搅拌3h。反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，将合并后的滤液加入至预冷的无水乙醚中，离心收集沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到固体，即索玛鲁肽粗品肽，粗品收率为：97％，HPLC纯度为69.30％。
实施例5～19，操作条件与实施例1～4类似，其不同之处及粗品收率、粗品纯度如下表所示
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种固相法合成索玛鲁肽的方法，所述方法包含如下步骤：
a)将如结构式1～5所示的任意一种化合物与氨基树脂缩合得到Gly-氨基树脂；
第37号位Gly采用如下结构的砌块，结构式：
b)按照索玛鲁肽主链序列，利用固相合成法连接至Glu27；
c)使用主链带有Dde保护基的Lys连接Lys26，；
d)按照侧链序列连接侧链至十八烷二酸；
e)脱除Lys26主链保护基Dde，按照主链序列采用固相连接法连接至His7。
f)裂解肽树脂得到粗品，经纯化、冻干后得到索玛鲁肽纯品。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，第37号位Gly采用如下结构的砌块：Gly结构式1或Gly结构式4。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相合成氨基树脂为MBHA树脂、BHA树脂、AM树脂、Sieber树脂中的任意一种，或其中任意一种与Rink Amide Linker组成的Fmoc-Rinker amide氨基树脂。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述固相合成氨基树脂为MBHA树脂。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相连接时使用单个保护的氨基酸逐个连接或使用保护的多肽片段连接。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相合成策略中使用的偶联试剂为HOBt，HOAt与DIC的混合物，或PyAop、PyBop与碱的混合物，或HBTU、HATU与碱的混合物。优选HOBt与DIC的混合物。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相合成策略中使用的偶联试剂为HOBt与DIC的混合物。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述脱侧链保护基及切肽中所用的裂解试剂为三氟乙酸与茴香硫醚，苯甲醚，三异丙基硅烷，苯酚，1,2-乙二硫醇，水中任意一种或几种的组合。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述脱侧链保护基及切肽中所用的裂解试剂为三氟乙酸与茴香硫醚，三异丙基硅烷，1,2-乙二硫醇，水的组合，比例为，90：2.5：2.5：2.5：2.5。
10.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述固相合成氨基树脂取代度为0.1～0.8mmol/g。
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