CN112250755A - 一种索马鲁肽的制备方法 - Google Patents

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CN112250755A CN202011169841.7A CN202011169841A CN112250755A CN 112250755 A CN112250755 A CN 112250755A CN 202011169841 A CN202011169841 A CN 202011169841A CN 112250755 A CN112250755 A CN 112250755A
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邱鹤
罗瑞昌
纪东亮
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Abstract

本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，涉及多肽合成技术领域。本发明先在起始树脂上偶联第37个氨基酸Fmoc‑Gly‑OH后脱除Fmoc保护基，然后依次偶联索马鲁肽序列中第36～26个氨基酸，在得到的第一肽树脂上依次偶联侧链Fmoc‑AEEA‑OH、Fmoc‑AEEA‑OH、Fmoc‑Glu‑OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，将得到的第二肽树脂中Lys主链保护基脱除后依次偶联索马鲁肽序列中第25～7个氨基酸，将得到的第三肽树脂裂解，得到索马鲁肽。本发明提供的制备方法先偶联索马鲁肽的侧链，再偶联索马鲁肽的主链，能有效避免消旋杂质的产生，降低侧链的合成难度，收率高，成本低；且制备方法简单，适宜工业化生产。

Description

一种索马鲁肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种索马鲁肽的制备方法。
背景技术
索马鲁肽(Semaglutide CAS：910463-68-2)是诺和诺德公司研发的每周一次皮下注射的长效GLP-1类似物，Semaglutide的结构上是GLP-1(7-37)链上8位Aib取代了Ala，34位Arg取代了Lys，26位上Lys接上了十八烷二酸脂肪链，谷氨酸和短链的PEG修饰。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长效的目的，其结构如下：
Figure BDA0002746955580000011
目前，索马鲁肽合成方法主要有以下两种：一是逐步偶联主链，然后脱除Lys侧链保护基，再逐步偶联侧链，然而此方法增大了侧链的偶联难度，并且在逐步偶联侧链脱除保护基的过程中，His消旋杂质的量增多，收率低；二是逐步偶联主链后脱除Lys侧链保护基，再偶联整个侧链，然而整条侧链的获取难度比较大，生产成本高。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种索马鲁肽的制备方法，本发明提供的制备方法能够有效避免消旋杂质的产生，降低了侧链的合成难度，收率高，成本低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将起始树脂、Fmoc-Gly-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合，依次进行第一偶联反应和封端树脂，得到Fomc-Gly-树脂；
(2)在所述Fomc-Gly-树脂上连接Fmoc-Arg(pbf)-OH，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂；所述连接包括依次进行的脱除Fomc保护基反应和第二偶联反应；
(3)按照所述步骤(2)的方法，在所述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和R1-Lys(R2)-OH，得到第一肽树脂；所述R1包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述R2包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述第一肽树脂的结构式为R1-Lys26(R2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gl y35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；
(4)按照所述步骤(2)的方法，在所述第一肽树脂上依次连接Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，得到第二肽树脂；所述第二肽树脂的结构式为R1-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；所述R1包括Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；
(5)将所述第二肽树脂中Lys主链R1保护基脱除，得到脱保护第二肽树脂，按照所述步骤(2)的方法，在所述脱保护第二肽树脂上依次连接F moc-Ala-OH、Fmoc-Gln、(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、F moc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-O H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH，得到第三肽树脂；所述第三肽树脂的结构式为Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tB u)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyhepta decanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；
(6)在裂解液存在下，将所述第三肽树脂进行裂解，得到索马鲁肽。
优选的，步骤(1)中，所述起始树脂包括CTC树脂或Wang树脂；
所述起始树脂的取代度为0.45～0.75mmol/g。
优选的，步骤(1)中，所述封端采用的封端试剂包括醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液或醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液。
优选的，步骤(1)中，所述偶联试剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyBOP/HOBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA；
所述起始树脂和偶联试剂的摩尔比为1：(1.5～3)。
优选的，步骤(1)中，所述溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃。
优选的，所述脱除Fmoc保护基反应采用的Fmoc脱保护试剂包括PIP、DBU或TEA。
优选的，步骤(2)中，所述第二偶联反应采用的偶联试剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyBOP/HOBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA。
优选的，步骤(2)中，所述第二偶联反应的温度为20～40℃。
优选的，步骤(5)中，所述Lys主链R1保护基脱除采用的脱保护试剂包括三氟乙酸、六氟异丙醇、三氟乙醇、水合肼和四(三苯基膦)钯中的一种或几种。
优选的，步骤(6)中，所述裂解液包括TFA、EDT、Tis和H2O，所述TFA、EDT、Tis和H2O的体积比为(85～100)：(2.5～7)：(1.25～4)：(1.25～4)；
所述裂解的温度为20～40℃，时间为2～4h。
本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将起始树脂、Fmoc-Gly-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合，依次进行第一偶联反应和封端树脂，得到Fomc-Gly-树脂；(2)在所述Fomc-Gly-树脂上连接Fmoc-Arg(pbf)-OH，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂；所述连接包括依次进行的脱除Fomc保护基反应和第二偶联反应；(3)按照所述步骤(2)的方法，在所述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和R1-Lys(R2)-OH，得到第一肽树脂；所述R1包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述R2包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述第一肽树脂的结构式为R1-Lys26(R2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；(4)按照所述步骤(2)的方法，在所述第一肽树脂上依次连接Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，得到第二肽树脂；所述第二肽树脂的结构式为R1-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；所述R1包括Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；(5)将所述第二肽树脂中Lys主链R1保护基脱除，得到脱保护第二肽树脂，按照所述步骤(2)的方法，在所述脱保护第二肽树脂上依次连接Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln、(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH，得到第三肽树脂；所述第三肽树脂的结构式为Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-As p(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(T rt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoy l41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；(6)在裂解液存在下，将所述第三肽树脂进行裂解，得到索马鲁肽。本发明提供的制备方法，通过先偶联索马鲁肽的侧链，再偶联索马鲁肽的主链，能够有效避免消旋杂质的产生，降低了侧链的合成难度，收率高，成本低；而且制备方法，操作简单，适宜工业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的索玛鲁肽的HPLC谱图；
图2为对比例1制备索玛鲁肽的反应路线图；
图3为对比例1制备的索玛鲁肽的HPLC谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将起始树脂、Fmoc-Gly-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合，依次进行第一偶联反应和封端树脂，得到Fomc-Gly-树脂；
(2)在所述Fomc-Gly-树脂上连接Fmoc-Arg(pbf)-OH，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂；所述连接包括依次进行的脱除Fomc保护基反应和第二偶联反应；
(3)按照所述步骤(2)的方法，在所述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和R1-Lys(R2)-OH，得到第一肽树脂；所述R1包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述R2包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述第一肽树脂的结构式为R1-Lys26(R2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gl y35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；
(4)按照所述步骤(2)的方法，在所述第一肽树脂上依次连接Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，得到第二肽树脂；所述第二肽树脂的结构式为R1-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；所述R1包括Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；
(5)将所述第二肽树脂中Lys主链R1保护基脱除，得到脱保护第二肽树脂，按照所述步骤(2)的方法，在所述脱保护第二肽树脂上依次连接F moc-Ala-OH、Fmoc-Gln、(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、F moc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-O H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH，得到第三肽树脂；所述第三肽树脂的结构式为Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tB u)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyhepta decanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；
(6)在裂解液存在下，将所述第三肽树脂进行裂解，得到索马鲁肽。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，缩写代表的物质如表1所示：
表1缩写对应的物质名称
Figure BDA0002746955580000061
Figure BDA0002746955580000071
本发明将起始树脂、Fmoc-Gly-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合，依次进行第一偶联反应和封端树脂，得到Fomc-Gly-树脂。
在本发明中，所述起始树脂优选包括CTC树脂(二氯树脂)或Wang树脂(王树脂)。在本发明中，所述起始树脂的取代度优选为0.45～0.75mmol/g，更优选为0.5～0.7mmol/g，最优选为0.6mmol/g。
在本发明中，所述起始树脂在使用前优选还包括进行预处理，所述预处理优选包括：将起始树脂置于有机溶剂中进行溶胀后除去所述有机溶剂。在本发明中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二氯甲烷。在本发明中，所述起始树脂和有机溶剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2。在本发明中，所述溶胀的温度优选为室温；所述溶胀的时间优选为30～120min，更优选为50～100min。在本发明中，所述溶胀的目的是将初始树脂中多余的酸中和掉，通过溶胀可以使得树脂膨胀开，反应位点舒展，有利于初始树脂偶联氨基酸。在本发明中，除去所述有机溶剂的方式优选为抽滤。
在本发明中，所述起始树脂和Fmoc-Gly-OH的摩尔比优选为1：(1.5～3)，更优选为1：(2～2.5)。
在本发明中，所述吡啶类催化剂优选为Dmap。在本发明中，所述起始树脂和吡啶类催化剂的摩尔比优选为1：(0.1～0.3)，更优选为1:0.2。
在本发明中，所述偶联试剂优选包括DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyBOP/HOBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA。在本发明中，所述DIC/HOBt中DIC和HOBt的摩尔比优选为(1.5～3)：(1.5～3)，更优选为(2～2.5)：(2～2.5)。在本发明中，所述DIC/HOAt中DIC和HOAt的摩尔比优选为(1.5～3)：(1.5～3)，更优选为(2～2.5)：(2～2.5)。在本发明中，所述PyBOP/HOBt/DIPEA中PyBOP、HOBt和DIPEA的摩尔比优选为(1.5～3)：(1.5～3)：(1.5～6)，更优选为(2～2.5)：(2～2.5)：(2～5)。在本发明中，所述HATU/DIPEA中HATU和DIPEA的摩尔比优选为(1.4～2.85)：(3～6)，更优选为(2～2.5)：(4～5)。在本发明中，所述HBTU/DIPEA中HBTU和DIPEA的摩尔比优选为(1.4～2.85)：(3～6)，更优选为(2～2.5)：(4～5)。在本发明中，所述起始树脂和偶联试剂的摩尔比优选为1：(1.5～3)更优选为1：(2～2.5)。
在本发明中，所述溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺二氯甲烷(DCM)或四氢呋喃(THF)。本发明对于所述溶剂的用量没有特殊限定，能够将偶联试剂溶解即可。
在本发明中，所述起始树脂、Fmoc-Gly-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合的顺优选为将起始树脂、Fmoc-Gly-OH、吡啶类催化剂、偶联剂中除DIPEA或DIC外的其他成分和溶剂第一混合，加入偶联剂中的DIPEA或DIC第二混合。在本发明中，所述第一混合优选在冰水浴条件下进行；所述第一混合的时间优选为15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述第二混合的温度优选为室温；所述第二混合的时间优选为4～6min，更优选为5min。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述第一偶联反应的温度优选为20～40℃，更优选为室温；时间优选为2～4h，更优选为2.5～3h。在本发明中，所述第一偶联反应优选通过茚三酮检测液检测判定反应终点，当检测结果为阴性时，所述偶联反应完毕。
所述第一偶联反应后，本发明优选还包括将所述第一偶联反应进行后处理，所述后处理包括将所述第一偶联反应的体系固液分离，将所得固体组分进行有机溶剂洗涤，得到第一偶联树脂。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。在本发明中，所述有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺；所述有机溶剂洗涤的次数优选为4～6次，更优选为5次；所述有机溶剂洗涤的目的是洗去未参加反应的氨基酸和偶联试剂。
得到第一偶联树脂后，本发明封端所述第一偶联树脂。在本发明中，所述封端采用的封端试剂包括醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液或醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液。在本发明中，所述醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液和醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液中的溶剂独立地优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。在本发明中，所述醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液中醋酸酐的浓度优选为5～30％，更优选为10～20％；所述N-甲基吗啉的浓度优选为3～16％，更优选为6～11％。在本发明中，所述醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液中醋酸酐的浓度优选为5～30％，更优选为10～20％；所述N,N-二异丙基乙胺的浓度优选为3～16％，更优选为6～11％。在本发明中，起始树脂的质量和封端试剂的体积之比优选为1g：(1～10)mL，更优选为1g：(5～6)mL。在本发明中，所述封端树脂的温度优选为室温；时间优选为2～4h，更优选为3h。
所述封端树脂后，本发明优选还包括将所述封端树脂得到的Fmoc-Gly-树脂体系依次进行酰胺类溶剂洗涤、第一醇类溶剂洗涤、二氯甲烷洗涤、第二醇类溶剂洗涤、有机溶剂溶胀和抽干溶剂，得到Fmoc-Gly-树脂。在本发明中，所述酰胺类溶剂洗涤的次数优选为2～3次，所述酰胺类溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。在本发明中，所述第一醇类溶剂洗涤的次数优选为2～3次，所述第一醇类溶剂优选包括甲醇或乙醇。在本发明中，所述二氯甲烷洗涤的次数优选为2～3次。在本发明中，所述第二醇类溶剂洗涤的次数优选为2～3次，所述第二醇类溶剂优选包括甲醇或乙醇。在本发明中，所述溶胀用有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二氯甲烷；所述起始树脂和溶胀用有机溶剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2；所述溶胀的温度优选为室温；所述溶胀的时间优选为30～120min，更优选为50～100min。
得到Fomc-Gly-树脂后，本发明在所述Fomc-Gly-树脂上连接Fmoc-Arg(pbf)-OH，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂；所述连接包括依次进行的脱除Fomc保护基反应和第二偶联反应。
在本发明中，在所述Fomc-Gly-树脂上连接Fmoc-Arg(pbf)-OH，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂，具体的，包括将Fomc-Gly-树脂、偶联试剂和溶剂混合，依次进行脱除Fomc保护基反应和第二偶联反应，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂。
在本发明中，所述Fomc-Gly-树脂和Fmoc-Arg(pbf)-OH的摩尔比优选为1：(1.5～3)，更优选为1：(2～2.5)。
在本发明中，所述偶联试剂和溶剂的可选种类优选与前述Fomc-Gly-树脂制备过程中的采用的偶联试剂和溶剂的可选种类相同，在此不再一一赘述。
在本发明中，所述脱除Fmoc保护基采用的Fmoc脱保护试剂优选包括PIP、DBU或TEA；在本发明中，所述Fmoc脱保护试剂优选以Fmoc脱保护试剂溶液形式使用，所述Fmoc脱保护试剂溶液的体积百分浓度优选为15～25％，更优选为20％。在本发明中，所述Fmoc脱保护试剂溶液中的溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。在本发明中，所述Fmoc-Gly-树脂和Fmoc脱保护试剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2。
在本发明中，当所述偶联试剂为DIC/HOBt时，所述Fmoc-Gly-树脂、Fmoc-Arg(pbf)-OH、偶联试剂和溶剂混合的顺优选为将Fmoc-Gly-树脂、Fmoc-Arg(pbf)-OH、HOBt和溶剂第三混合，加入DIC第四混合。在本发明中，所述第三混合优选在冰水浴条件下进行；所述第三混合的时间优选为15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述第四混合的温度优选为室温；所述第四混合的时间优选为4～6min，更优选为5min。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述脱除Fmoc保护基的温度优选为室温；时间优选为5min～1h，更优选为20～30min。在本发明中，所述脱除Fmoc保护基优选通过茚三酮检测液检测判定反应终点，具体步骤如下：取所述脱除Fmoc保护基的反应液有机溶剂洗涤，得到去除反应液的反应物，在所述去除反应液的反应物中加入茚三酮检测液进行检测，当检测结果为阳性时，所述脱除保护基反应完毕，即Fmoc被脱除。在本发明中，所述茚三酮检测液包括独立分装的A溶液(20w/w％无水乙醇/苯酚)、B溶液(重蒸吡啶)和C溶液(5g茚三酮溶于100mL无水乙醇中)。在本发明的实施例中，所述茚三酮检测液的加入量为A溶液、B溶液和C溶液各滴加两滴。在本发明中，所述有机溶剂洗涤优选为采用N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺进行洗涤；所述有机溶剂洗涤的次数优选为4～6次，更优选为5次。
在本发明中，所述第二偶联反应的温度优选为20～40℃，更优选为室温；时间优选为2～4h，更优选为2.5～3h。在本发明中，所述第二偶联反应优选通过茚三酮检测液检测判定反应终点，当检测结果为阴性时，所述第二偶联反应完毕。
所述第二偶联反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括将所述第二偶联反应的体系固液分离，将所得固体组分依次进行有机溶剂洗涤、有机溶剂溶胀和抽干，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。在本发明中，所述有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺；所述有机溶剂洗涤的次数优选为4～6次，更优选为5次；所述有机溶剂洗涤的目的是洗去未参加反应的氨基酸和偶联试剂或者脱保护试剂。在本发明中，所述溶胀用有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二氯甲烷。在本发明中，所述固体组分和溶胀用有机溶剂的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2。在本发明中，所述溶胀的温度优选为室温；所述溶胀的时间优选为30～120min，更优选为50～100min。
得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂后，本发明按照所述步骤(2)的方法，在所述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Il e-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和R1-Lys(R2)-OH，得到第一肽树脂；所述R1包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述R2包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述第一肽树脂的结构式为R1-L ys26(R2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂。
在本发明中，所述Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和R1-Lys(R2)-OH与所述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂的摩尔比独立地优选为(1.5～3)：1，更优选为(2～2.5)：1。
在本发明中，所述Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和R1-Lys(R2)-OH的连接操作以及条件独立地的优选与前述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂制备过程中所述Fmoc-Arg(pbf)-OH的连接操作以及条件相同，在此不再一一赘述。
得到第一肽树脂后，本发明按照所述步骤(2)的方法，在所述第一肽树脂上依次连接Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，得到第二肽树脂；所述第二肽树脂的结构式为R1-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；所述R1包括Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc。
在本发明中，脱除R2保护基采用的脱保护试剂优选包括三氟乙酸、二氯甲烷、水合肼、N,N-二甲基甲酰胺、醋酸、N-甲基吗啡吗啉、三氯甲烷和四(三苯基)膦钯中的一种或几种。在本发明中，所述第一肽树脂和脱保护试剂的体积比优选为1：(2～5)，更优选为1：(3～4)。
在本发明中，所述Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯与所述第一肽树脂的摩尔比独立地优选为(1.5～3)：1，更优选为(2～2.5)：1。
在本发明中，所述Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯的连接的条件独立地的优选与前述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂制备过程中所述Fmoc-Arg(pbf)-OH的连接条件相同，在此不再一一赘述。
得到第二肽树脂后，本发明将所述第二肽树脂中Lys主链R1保护基脱除，得到脱保护第二肽树脂，按照所述步骤(2)的方法，在所述脱保护第二肽树脂上依次连接Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln、(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH，得到第三肽树脂；所述第三肽树脂的结构式为Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂。
在本发明中，所述Lys主链R1保护基脱除采用的脱保护试剂优选包括三氟乙酸、六氟异丙醇、三氟乙醇、水合肼和四(三苯基膦)钯中的一种或几种。在本发明中，所述第二肽树脂和脱保护试剂的体积比优选为1：(2～6)，更优选为1：(3～5)。在本发明中，所述Lys主链保护基脱除的次数优选为3～4次。在本发明中，所述Lys主链R1保护基脱除的温度优选为15～40℃，更优选为20～30℃；时间优选为0.5～3h，更优选为0.5～1h。
在本发明中，所述Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln、(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH与所述第二肽树脂的摩尔比优选独立地优选为(1.5～3)：1，更优选为(2～2.5)：1。
在本发明中，所述Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln、(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH的连接的条件独立地的优选与前述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂制备过程中所述Fmoc-Arg(pbf)-OH的连接条件相同，在此不再一一赘述。
得到第三肽树脂后，本发明在裂解液存在下，将所述第三肽树脂进行裂解，得到索马鲁肽。
在本发明中，所述裂解液优选包括TFA、EDT、Tis和H2O。在本发明中，所述TFA、EDT、Tis和H2O的体积比优选为(85～100)：(2.5～7)：(1.25～4)：(1.25～4)，更优选为(90～99)：(3～6)：(1.5～3.5)：(1.5～3.5)，最优选为(90～95)：(4～5)：(2～3)：(2～3)。在本发明中，所述第三肽树脂的质量和裂解液的体积之比优选为1g：(5～15)mL，更优选为1g：10mL。
在本发明中，所述裂解的温度优选为20～40℃，更优选为室温；时间优选为2～4h，更优选为3h。
所述裂解后，本发明优选还包括将所述裂解的体系进行第一固液分离，在所得液体组分加入沉降剂进行沉降，然后第二固液分离，将所得固体组分有机溶剂洗涤、干燥和色谱柱纯化，得到索马鲁肽。在本发明中，所述第一固液分离的方式优选为过滤或抽滤；所述第一固液分离的目的是除去树脂。
在本发明中，所述沉降剂优选包括冰甲基叔丁基醚或冰乙醚；所述冰甲基叔丁基醚的温度优选为0～-20℃；所述冰乙醚的温度优选为0～-20℃；所述沉降剂和液体组分的体积比优选为(3～10)：1，更优选为(5～7)：1；所述沉降的时间优选为5～60min，更优选为10～15min。
在本发明中，所述第二固液分离的方式优选为离心分离，本发明对于离心分离的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的离心分离条件即可。
在本发明中，所述洗涤用有机溶剂优选包括冰甲基叔丁基醚或冰乙醚；所述有机溶剂洗涤的次数优选为3～4次。在本发明中，所述干燥的方式优选为真空干燥；所述干燥的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～20h，更优选为12～15h。
在本发明中，所述色谱柱纯化优选为半制备液相色谱纯化，所述半制备液相色谱纯化的条件包括：色谱柱优选为反相C18的DAC200；流动相A优选为0.05～0.2v/v％TFA水溶液，更优选为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B优选为乙腈；流动相A和流动相B的流速独立地优选为500～1000mL/min，更优选为700～800mL/min；检测波长优选为220nm；洗脱方式优选为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相A的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相B的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
所述色谱柱纯化后，本发明优选还包括将所述色谱柱纯化得到的目标峰(保留时间为19.318min)洗脱液转盐后冻干，得到醋酸盐索马鲁肽。在本发明中，所述转盐优选利用醋酸进行。本发明对于所述醋酸的用量没有特殊限定，能够得到醋酸盐索马鲁肽即可。在本发明中，所述干燥的方式优选为冻干，本发明对于所述冻干的温度和时间没有特殊限定，采用本领域人员熟知的冻干温度和时间即可；在本发明的实施例中，所述冻干优选利用挂瓶冻干机进行。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)将17.25g取代度为0.58mmol/g的王树脂加入到合成反应器中，加入80mL DMF溶胀树脂60min；将8.94g Fmoc-Gly-OH、4.08g HOBT和0.611g Dmap用20mL DMF溶解，放置于冰水浴中混合20min，加入4.62mL DIC在室温下搅拌5min，得到混合液；将得到的混合液加入到上述合成反应器中，室温下第一偶联反应2.5h，过滤，将所得固体组分DMF洗涤5次，加入100mL醋酸酐/NMM/DMF(醋酸酐浓度为20％，NMM浓度为12％)封端树脂3h，DMF洗涤2次、甲醇洗涤2次，二氯甲烷洗涤2次、甲醇洗涤2次后抽干，得到Fmoc-Gly-树脂(19.95g，9.78mmol，取代度为0.49mmol/g，收率为99.70％)。
(2)将10.21g步骤(1)得到的Fmoc-Gly-树脂(5mmol)加入到合成反应器中，用40mLDMF溶胀60min，加入40mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下第一脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除，得到Gly-树脂；
将6.49g Fmoc-Arg(pbf)-OH(10mmol)和1.35g HOBT(10mmol)用20mL DMF溶解，置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将所得混合液加入到上述合成反应器中，室温下第二偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，表示第二偶联反应完成，加入40mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除，得到Fmoc-Arg(pbf)-Gly-树脂；
(3)按照步骤(2)的方法，即重复所述第一Fmoc保护基和第二偶联反应，在步骤(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH(2.975g，10mmol)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(6.488g，10mmol)、Fmoc-Val-OH(3.394g，10mmol)、Fmoc-Leu-OH(3.535g，10mmol)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(5.266g，10mmol)、Fmoc-Ala-OH(3.115g，10mmol)、Fmoc-Ile-OH(3.535g，10mmol)、Fmoc-Phe-OH(3.875g，10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(4.255g，10mmol)和Mtt-Lys(Fmoc)-OH(6.248g，10mmol)，将得到的产物DMF洗涤5次，得到第一肽树脂Mtt-Lys26(Fmoc)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂(22.61g，收率为98.6％，纯度为89.5％)。
(4)将5mmol步骤(3)得到的第一肽树脂加入到合成反应器中，用60mL DMF溶胀60min，加入60mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下第二脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除；得到脱Fmoc保护基第一肽树脂；
将5mmol脱Fmoc保护基第一肽树脂加入到合成反应器中，用60mL DMF溶胀60min；将3.59g Fmoc-AEEA-OH(10mmol)、1.35g HOBT(10mmol)和20mL DMF置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将得到的混合液加入到上述合成反应器中，室温下进行第三偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，则表示偶联反应完成；
重复上述第二脱Fmoc保护基和第三偶联反应操作，依次连接Fmoc-AEEA-OH(3.59g，10mmol)、Fmoc-Glu–OtBu(4.255g，10mmol)和十八烷二酸单叔丁酯(3.706g，10mmol)，其中十八烷二酸单叔丁酯采用的偶联剂试为HATU/DIEA(HATU/DIEA摩尔比＝1.9/4)，将得到的产物DMF洗涤5次，得到第二肽树脂Mtt-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtB u)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；(26.40g，收率为97.7％，纯度为85.2％)。
(5)将5mmol步骤(4)得到的第二肽树脂加入到合成反应器中，加入300mL TFA/Tis/DCM(TFA/Tis/DCM体积比＝1/2/97)混合，脱除Mtt保护基3次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测呈阳性，表示Mtt被脱除，得到脱保护第二肽树脂；将取3.12g Fmoc-Ala-OH(10mmol)、1.35g HOBT(10mmol)和20mL DMF置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将混合液加入到上述合成反应器中，室温下第四偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检结果呈阴性，则表示偶联反应完成，将得到的产物用DMF洗涤5次，加入70mL20v/v％PIP/DMF溶液第三脱除Fmoc保护基，将得到的产物用DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc保护基被脱除。重复上述第四偶联反应和第三脱除Fmoc保护基操作，按照索马鲁肽序列，依次连接Fmoc-Ala-OH(10mmol)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(10mmol)、Fmoc-Gly-OH(10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Leu-OH(10mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Val-OH(10mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Phe-OH(10mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Gly-OH(10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Aib-OH(10mmol)和Boc-His(Trt)-OH(10mmol)，其中Boc-His(Trt)-OH采用的偶联剂试为HATU/DIEA(HATU/DIEA摩尔比＝1.9/4)，将得到的产物DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，抽干，得到第三肽树脂Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-As p(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(T rt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoy l41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂(37.25g，收率为96.93％，纯度为56.7％)。
(6)将步骤(5)得到的第三肽树脂加入到1000mL锥形瓶中，加入700mL冰的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O体积比＝90/5/2.5/2.5)混合，室温下裂解3h，过滤，将滤液加入到8L冰甲基叔丁基醚中进行沉淀，离心，用冰甲基叔丁基醚得到的固体组分3次，真空干燥，得到索马鲁肽粗肽。
将所述索玛鲁肽粗肽采用奥诺的半制备液相色谱仪进行纯化，收集目标峰(保留时间为19.318min)的洗脱液，加入醋酸形成醋酸盐，采用挂瓶冻干机冻干，得到索玛鲁肽醋酸盐(6.3g，收率为30.63％，纯度为99.8％，最大单杂含量为0.05％)。
其中，HPLC纯化的条件包括：色谱柱为反相C18的DAC200；检测波长为220nm；流动相A为0.1v/v％TFA水溶液；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B的流速均为800mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度系统的具体程序为：0～1h，流动相A的体积百分含量由20％匀速增加至60％，流动相B的体积百分含量由80％匀速降低至40％。
本实施例的HPLC检测结果如图1和表1所示。
表1实施例1制备的索玛鲁肽的HPLC检测结果
保留时间(min) 峰面积(mV·s) 峰面积占比(％) 峰高度(mV)
11.950 94504 0.19 3060
12.572 662121 1.30 20079
13.886 1421848 2.79 21829
15.151 1265054 2.48 22464
16.401 3297825 6.46 75807
17.197 1104593 2.16 41535
17.815 1036683 2.03 38845
18.433 1096500 2.15 44575
19.318 29965425 58.71 7600931
20.586 3002884 5.88 64403
21.556 1110692 2.18 22486
22.836 491932 0.96 19676
23.838 5996177 11.75 119537
25.329 493420 0.97 15641
由图1和表1可知，20.586min是His消旋杂质的峰，本发明制备的索玛鲁肽中His消旋杂质的纯度为5.88％。
对比例1
按照实施例1的原料用量比例，先连接索玛鲁肽主链，再连接侧链，反应路线如图2所示。
本对比例的HPLC检测结果如图3和表2所示。
表2对比例1制备的索玛鲁肽的HPLC检测结果
保留时间(min) 峰面积(mV·s) 峰面积占比(％) 峰高度(mV)
12.336 55233 0.82 2188
13.755 25014 0.37 1125
15.233 4116 0.06 592
15.933 177946 2.63 4541
16.998 172289 2.55 4642
17.733 51630 0.76 3164
18.593 4110826 60.82 124172
19.840 1397303 20.67 38938
21.200 14663 0.22 1244
21.992 484117 7.16 11752
由图3和表2可知，19.840min是His消旋杂质的峰，本对比例制备的索玛鲁肽中His消旋杂质的纯度为20.67％，His消旋杂质多。
实施例2
(1)将34.5g取代度为0.58mmol/g的王树脂加入到合成反应器中，加入300mL DMF溶胀树脂60min；将5.96g Fmoc-Gly-OH、2.72g HOBT和1.22g Dmap用80mL DMF溶解，放置于冰水浴中混合20min，加入3.08mL DIC在室温下搅拌5min，得到混合液；将得到的混合液加入到上述合成反应器中，室温下第一偶联反应2.5h，过滤，将所得固体组分DMF洗涤5次，加入500mL醋酸酐/NMM/DMF(其中，醋酸酐浓度为20％，NMM浓度为11％)封端树脂3h，DMF洗涤2次、甲醇洗涤2次，二氯甲烷洗涤2次、甲醇洗涤2次后抽干，得到Fmoc-Gly-树脂(36.42g，5.90mmol，取代度为0.16mmol/g，收率为91.03％)。
(2)将31.25g步骤(1)得到的Fmoc-Gly-树脂(5mmol)加入到合成反应器中，用200mL DMF溶胀60min，加入200mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下第一脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除，得到Gly-树脂；
将6.49g Fmoc-Arg(pbf)-OH(10mmol)和1.35g HOBT(10mmol)用50mL DMF溶解，置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将所得混合液加入到上述合成反应器中，室温下第二偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，表示第二偶联反应完成，加入200mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除，得到Fmoc-Arg(pbf)-Gly-树脂；
(3)按照步骤(2)的方法，即重复所述第一Fmoc保护基和第二偶联反应，在步骤(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH(2.975g，10mmol)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(6.488g，10mmol)、Fmoc-Val-OH(3.394g，10mmol)、Fmoc-Leu-OH(3.535g，10mmol)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(5.266g，10mmol)、Fmoc-Ala-OH(3.115g，10mmol)、Fmoc-Ile-OH(3.535g，10mmol)、Fmoc-Phe-OH(3.875g，10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(4.255g，10mmol)和Mtt-Lys(Fmoc)-OH(6.248g，10mmol)，将得到的产物DMF洗涤5次，得到第一肽树脂Mtt-Lys26(Fmoc)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂(40.11g，收率为91.2％，纯度为90.21％)。
(4)将5mmol步骤(3)得到的第一肽树脂加入到合成反应器中，用300mL DMF溶胀60min，加入300mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下第二脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除；得到脱Fmoc保护基第一肽树脂；
将5mmol脱Fmoc保护基第一肽树脂加入到合成反应器中，用300mL DMF溶胀60min；将3.59g Fmoc-AEEA-OH(10mmol)、1.35g HOBT(10mmol)和70mL DMF置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将得到的混合液加入到上述合成反应器中，室温下进行第三偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，则表示偶联反应完成；
重复上述第二脱Fmoc保护基和第三偶联反应操作，依次连接Fmoc-AEEA-OH(3.59g，10mmol)、Fmoc-Glu–OtBu(4.255g，10mmol)和十八烷二酸单叔丁酯(3.706g，10mmol)，其中十八烷二酸单叔丁酯采用的偶联剂试为HATU/DIEA(HATU/DIEA摩尔比＝1.9/4)，将得到的产物DMF洗涤5次，得到第二肽树脂Mtt-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；(42.54g，收率为88.5％，纯度为84.50％)。
(5)将5mmol步骤(4)得到的第二肽树脂加入到合成反应器中，加入500mL TFA/Tis/DCM(TFA/Tis/DCM体积比＝1/2/97)混合，脱除Mtt保护基3次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测呈阳性，表示Mtt被脱除，得到脱保护第二肽树脂；将取3.12gFmoc-Ala-OH(10mmol)、1.35g HOBT(10mmol)和70mL DMF置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将混合液加入到上述合成反应器中，室温下第四偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检结果呈阴性，则表示偶联反应完成，将得到的产物用DMF洗涤5次，加入400mL20v/v％PIP/DMF溶液第三脱除Fmoc保护基，将得到的产物用DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc保护基被脱除。重复上述第四偶联反应和第三脱除Fmoc保护基操作，按照索马鲁肽序列，依次连接Fmoc-Ala-OH(10mmol)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(10mmol)、Fmoc-Gly-OH(10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Leu-OH(10mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Val-OH(10mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Phe-OH(10mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Gly-OH(10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Aib-OH(10mmol)和Boc-His(Trt)-OH(10mmol)，其中Boc-His(Trt)-OH采用的偶联剂试为HATU/DIEA(HATU/DIEA摩尔比＝1.9/4)，将得到的产物DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，抽干，得到第三肽树脂Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂(50.73g，收率为85.30％，纯度为54.67％)。
(6)将步骤(5)得到的第三肽树脂加入到2000mL锥形瓶中，加入900mL冰的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O体积比＝90/5/2.5/2.5)混合，室温下裂解3h，过滤，将滤液加入到9L冰甲基叔丁基醚中进行沉淀，离心，用冰甲基叔丁基醚得到的固体组分3次，真空干燥，得到索马鲁肽粗肽。
实施例3
(1)将17.25g取代度为0.58mmol/g的王树脂加入到合成反应器中，加入200mL DMF溶胀树脂60min；将5.95g Fmoc-Gly-OH、2.71g HOBT和0.611g Dmap用50mL DMF溶解，放置于冰水浴中混合20min，加入3.08mL DIC在室温下搅拌5min，得到混合液；将得到的混合液加入到上述合成反应器中，室温下第一偶联反应2.5h，过滤，将所得固体组分DMF洗涤5次，加入200mL醋酸酐/NMM/DMF(醋酸酐浓度为20％，NMM浓度为11％)封端树脂3h，DMF洗涤2次、甲醇洗涤2次，二氯甲烷洗涤2次、甲醇洗涤2次后抽干，得到Fmoc-Gly-树脂(19.05g，6.73mmol，取代度为0.35mmol/g，收率为95.23％)。
(2)将14.29g步骤(1)得到的Fmoc-Gly-树脂(5mmol)加入到合成反应器中，用70mLDMF溶胀60min，加入70mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下第一脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除，得到Gly-树脂；
将6.49g Fmoc-Arg(pbf)-OH(10mmol)和1.35g HOBT(10mmol)用35mL DMF溶解，置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将所得混合液加入到上述合成反应器中，室温下第二偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，表示第二偶联反应完成，加入70mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除，得到Fmoc-Arg(pbf)-Gly-树脂；
(3)按照步骤(2)的方法，即重复所述第一Fmoc保护基和第二偶联反应，在步骤(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH(2.975g，10mmol)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(6.488g，10mmol)、Fmoc-Val-OH(3.394g，10mmol)、Fmoc-Leu-OH(3.535g，10mmol)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(5.266g，10mmol)、Fmoc-Ala-OH(3.115g，10mmol)、Fmoc-Ile-OH(3.535g，10mmol)、Fmoc-Phe-OH(3.875g，10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(4.255g，10mmol)和Mtt-Lys(Fmoc)-OH(6.248g，10mmol)，将得到的产物DMF洗涤5次，得到第一肽树脂Mtt-Lys26(Fmoc)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂(25.67g，收率为95.02％，纯度为86.25％)。
(4)将5mmol步骤(3)得到的第一肽树脂加入到合成反应器中，用100mL DMF溶胀60min，加入100mL 20v/v％PIP/DMF溶液室温下第二脱除Fmoc保护基，DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc被脱除；得到脱Fmoc保护基第一肽树脂；
将5mmol脱Fmoc保护基第一肽树脂加入到合成反应器中，用100mL DMF溶胀60min；将3.59g Fmoc-AEEA-OH(10mmol)、1.35g HOBT(10mmol)和40mL DMF置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将得到的混合液加入到上述合成反应器中，室温下进行第三偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阴性，则表示偶联反应完成；
重复上述第二脱Fmoc保护基和第三偶联反应操作，依次连接Fmoc-AEEA-OH(3.59g，10mmol)、Fmoc-Glu–OtBu(4.255g，10mmol)和十八烷二酸单叔丁酯(3.706g，10mmol)，其中十八烷二酸单叔丁酯采用的偶联剂试为HATU/DIEA(HATU/DIEA摩尔比＝1.9/4)，将得到的产物DMF洗涤5次，得到第二肽树脂Mtt-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtB u)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；(28.39g，收率为91.26％，纯度为81.97％)。
(5)将5mmol步骤(4)得到的第二肽树脂加入到合成反应器中，加入150mL TFA/Tis/DCM(TFA/Tis/DCM体积比＝1/2/97)混合，脱除Mtt保护基3次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测呈阳性，表示Mtt被脱除，得到脱保护第二肽树脂；将取3.12g Fmoc-Ala-OH(10mmol)、1.35g HOBT(10mmol)和50mL DMF置于冰水浴中混合20min，加入1.54mL DIC(10mmol)室温下混合5min，得到混合液；将混合液加入到上述合成反应器中，室温下第四偶联反应，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检结果呈阴性，则表示偶联反应完成，将得到的产物用DMF洗涤5次，加入150mL20v/v％PIP/DMF溶液第三脱除Fmoc保护基，将得到的产物用DMF洗涤5次，以茚三酮检测液检测判定反应终点，检测结果呈阳性，表示Fmoc保护基被脱除。重复上述第四偶联反应和第三脱除Fmoc保护基操作，按照索马鲁肽序列，依次连接Fmoc-Ala-OH(10mmol)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(10mmol)、Fmoc-Gly-OH(10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Leu-OH(10mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Val-OH(10mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Phe-OH(10mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Gly-OH(10mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(10mmol)、Fmoc-Aib-OH(10mmol)和Boc-His(Trt)-OH(10mmol)，其中Boc-His(Trt)-OH采用的偶联剂试为HATU/DIEA(HATU/DIEA摩尔比＝1.9/4)，将得到的产物DMF洗涤2次，甲醇洗涤3次，抽干，得到第三肽树脂Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂(38.08g，收率为89.58％，纯度为50.29％)。
(6)将步骤(5)得到的第三肽树脂加入到2000mL锥形瓶中，加入850mL冰的裂解液(TFA/EDT/Tis/H2O体积比＝90/5/2.5/2.5)混合，室温下裂解3h，过滤，将滤液加入到8.5L冰甲基叔丁基醚中进行沉淀，离心，用冰甲基叔丁基醚得到的固体组分3次，真空干燥，得到索马鲁肽粗肽。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种索马鲁肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将起始树脂、Fmoc-Gly-OH、吡啶类催化剂、偶联试剂和溶剂混合，依次进行第一偶联反应和封端树脂，得到Fomc-Gly-树脂；
(2)在所述Fomc-Gly-树脂上连接Fmoc-Arg(pbf)-OH，得到Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂；所述连接包括依次进行的脱除Fomc保护基反应和第二偶联反应；
(3)按照所述步骤(2)的方法，在所述Fomc-Arg(pbf)-Gly-树脂上依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和R1-Lys(R2)-OH，得到第一肽树脂；所述R1包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述R2包括Fmoc、Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；所述第一肽树脂的结构式为R1-Lys26(R2)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；
(4)按照所述步骤(2)的方法，在所述第一肽树脂上依次连接Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，得到第二肽树脂；所述第二肽树脂的结构式为R1-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；所述R1包括Mtt、Mmt、ivDde、Dde或Alloc；
(5)将所述第二肽树脂中Lys主链R1保护基脱除，得到脱保护第二肽树脂，按照所述步骤(2)的方法，在所述脱保护第二肽树脂上依次连接Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln、(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH，得到第三肽树脂；所述第三肽树脂的结构式为Boc-His(Trt)7-Aib8-Glu(OtBu)9-Gly10-Thr(tBu)11-Phe12-Thr(tBu)13-Ser(tBu)14-Asp(OtBu)15-Val16-Ser(tBu)17-Ser(tBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-Glu(OtBu)21-Gly22-Gln(Trt)23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA38-AEEA39-γ-Glu(OtBu)40-17-carboxyheptadecanoyl41)-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-树脂；
(6)在裂解液存在下，将所述第三肽树脂进行裂解，得到索马鲁肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述起始树脂包括CTC树脂或Wang树脂；
所述起始树脂的取代度为0.45～0.75mmol/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述封端采用的封端试剂包括醋酸酐/N-甲基吗啉混合溶液或醋酸酐/N,N-二异丙基乙胺混合溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述偶联试剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyBOP/HOBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA；
所述起始树脂和偶联试剂的摩尔比为1：(1.5～3)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱除Fmoc保护基反应采用的Fmoc脱保护试剂包括PIP、DBU或TEA。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第二偶联反应采用的偶联试剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyBOP/HOBt/DIPEA、HATU/DIPEA或HBTU/DIPEA。
8.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第二偶联反应的温度为20～40℃。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述Lys主链R1保护基脱除采用的脱保护试剂包括三氟乙酸、六氟异丙醇、三氟乙醇、水合肼和四(三苯基膦)钯中的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述裂解液包括TFA、EDT、Tis和H2O，所述TFA、EDT、Tis和H2O的体积比为(85～100)：(2.5～7)：(1.25～4)：(1.25～4)；
所述裂解的温度为20～40℃，时间为2～4h。
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