CN110894227A - 一种利拉鲁肽的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利拉鲁肽的固相合成方法。包括以下步骤：按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，固相合成第1‑20氨基酸多肽片段一树脂肽；脱除多肽片段一树脂肽的第12位上赖氨酸的侧链保护基，然后与化合物Pal‑Glu(OtBu)‑OH进行偶联反应，得到多肽片段三树脂肽；按照利拉鲁肽主链C端至N端的氨基酸顺序，固相合成第21‑31氨基酸多肽片段二树脂肽，然后裂解反应脱除树脂，得到多肽片段二；多肽片段三树脂肽脱末端保护基后，经固相合成法与多肽片段二偶联反应，得到利拉鲁肽树脂；然后裂解纯化后即得利拉鲁肽。本发明方法操作简单，所得产品纯度较高，成本较低，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药类多肽原料药的化学合成，尤其涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。
背景技术
利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，与天然GLP-1相比，利拉鲁肽药效相当且作用时间更长，并且能够显著降低糖尿病患者的主要不良心血管事件。2010年1月25日，美国FDA批准由丹麦诺和诺德公司研发的利拉鲁肽(商品名为Victoza)注射剂在美国上市，2011年3月4日，利拉鲁肽获得SFDA批准上市。
利拉鲁肽的分子式为C172H265N43O51，相对分子质量3751.2，CAS登记号为204656-20-2。
发明专利CN102286092、CN103304660、CN103980358等采用逐级合成法使主链逐个缩合的方式进行利拉鲁肽的合成。该方法随着肽链的延长，氨基酸的缩合会越来越难，从而导致缺失肽的形成，产物纯度降低，并且由于单个氨基酸的缺失肽与主产物性质相差很小，该方式同时会使得产物制备困难；
发明专利CN102875665、CN104045705、CN104045706、CN105732798、CN106699871等专利采用片段法，均先合成3～5个片段，然后再将各片段缩合拼接得到利拉鲁肽；相比逐级合成法可以在一定程度上提高产物的纯度，降低其制备难度。但是这种方法往往容易消耗大大过量的片段，关键中间体多为油状物，不利于称量、析晶纯化等操作，使目标产物的制备成本大幅度增加。
专利CN201711476319中描述采用固相法合成关键第一片段和第二片段，其中的第二片段有27个氨基酸，采用逐级合成法。从一定程度上延长了利拉鲁肽的制备周期。此外，我们参照CN104045705的第二多肽片段的制备方法，进行重复实验，结果发现该片段(即本发明对比实施例中所述的片段[17-24])制备过程成中容易形成油状物，产物难以通过析晶进一步纯化。
综上所述，现有利拉鲁肽的合成方式均存在成本高、杂质多、片段不易纯化、合成周期长、废液多等不适用于工业化生产的问题。为此，本发明人对利拉鲁肽的合成方法进行了研究，通过多次实验从而得到了本发明的技术方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，提供一种新的、利拉鲁肽的合成方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
本发明提供了一种利拉鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
步骤一、按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，固相合成第1-20氨基酸多肽片段一树脂肽，所述的多肽片段一树脂肽侧链上偶联有保护基；
步骤二、脱除多肽片段一树脂肽的第12位上赖氨酸的侧链保护基，然后与化合物Pal-Glu(OtBu)-OH进行偶联反应，得到多肽片段三树脂肽；
步骤三、按照利拉鲁肽主链C端至N端的氨基酸顺序，固相合成第21-31氨基酸多肽片段二树脂肽，然后裂解反应脱除树脂，得到多肽片段二，其中所述的多肽片段二侧链上偶联有保护基；
步骤四、多肽片段三树脂肽脱末端保护基后，经固相合成法与多肽片段二偶联反应，得到利拉鲁肽树脂；
步骤五、将利拉鲁肽树脂进行裂解反应得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化后即得利拉鲁肽。
利拉鲁肽的固相合成方法中，固相合成的固相载体为取代度为0.1-0.7mmol/g的Wang树脂或取代度为0.1-1.5mmol/g的2-CTC树脂，优选为取代度0.3-0.5mmol/g的Wang树脂或0.6-0.8mmol/g的2-CTC树脂。
在本发明的所述的方法中，按照利拉鲁肽主链肽序分为上文所述的两个片段，分别先合成这两个片段，然后再将这两个片段偶联，最终获得目标产品。以利拉鲁肽主链C端到N端的氨基酸顺序编号，其肽序如下式所示：
NH2-His31-Ala30-Glu29-Gly28-Thr27-Phe26-Thr25-Ser24-Asp23-Val22-Ser21-Ser20-Tyr19-Leu18-Glu17-Gly16-Gln15-Ala14-Ala13-Lys12-[N-(1-oxohexadecyl)
-L-xoglutamyl]-Glu11-Phe10-Ile9-Ala8-Trp7-Leu6-Val5-Arg4-Gly3-Arg2-Gly1-OH进一步地，
多肽片段一树脂肽和多肽片段三树脂肽的Arg、Trp、Glu、Lys、Gln、Glu、Tyr和Ser侧链上偶联有保护基；
多肽片段二的Ser、Asp、Thr、Glu和His侧链上偶联有保护基；
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基基等干扰合成的基团的保护基团,防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中产生杂质。优选地，Tyr、Ser的保护基优选为tBu；Glu的保护基优选OtBu；Arg的保护基优选Pbf；Gln的保护基优选Trt；Trp的保护基优选Boc；
优选地，所述的多肽片段一树脂肽为
Fmoc-Ser20(tBu)-Tyr19(tBu)-Leu18-Glu17(OtBu)-Gly16-Gln15(Trt)-Ala14-Ala13-Lys12(Alloc)-Glu11(OtBu)-Phe10-Ile9-Ala8-Trp7(Boc)-Leu6-Val5-Arg4(Pbf)-Gly3-Arg2(Pbf)-Gly1-Wang树脂；
所述的多肽片段三树脂肽为
Fmoc-Ser20(tBu)-Tyr19(tBu)-Leu18-Glu17(OtBu)-Gly16-Gln15(Trt)-Ala14-Ala13-Lys12(Pal-Glu(OtBu))-Glu11(OtBu)-Phe10-Ile9-Ala8-Trp7(Boc)-Leu6-Val5-Arg4(Pbf)-Gly3-Arg2(Pbf)-Gly1-Wang树脂；
所述的多肽片段二为
Boc-His31(Trt)-Ala30-Glu29(OtBu)-Gly28-Thr27(tBu)-Phe26-Thr25(tBu)-Ser24(tBu)-Asp23(OtBu)-Val22-Ser21(tBu)-OH
作为优选的方案，
步骤一中，将Fmoc-Gly-Wang Resin，加入固相反应器中，脱Fmoc反应后与Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行偶联反应，然后重复所述的脱保护基反应和偶联反应，按照多肽片段一树脂肽序列顺序依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到所述多肽片段一树脂肽。
进一步地，步骤一中，脱Fmoc反应采用Pip/DMF、NaOH/MeOH、TEA/DMF中的任意一种，优选体积比为20％的Pip/DMF溶液；偶联缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBt/DIEA，PyBop/HOBt/DIEA一种或多种组合，优选HOBt/DIC；羧基组分与氨基组分的投料比为1：1-8：1，优选为3：1；偶联反应所用的反应溶剂优选为二氯甲烷、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；
优选地，步骤二中，多肽片段一树脂肽的脱保护基反应是在苯硅烷和四(三苯基膦)钯的作用下进行的。
步骤三中，包括将Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC脱Fmoc保护基，与Fmoc-Val-OH在HOBt/DIC作用下活化偶联反应，然后重复所述的脱保护基反应和偶联反应，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH得到多肽片段二树脂肽；
进一步地，步骤三中，裂解试剂优选为体积比15％～25％的TFE/二氯甲烷或体积比0.5％～1.5％的TFA/二氯甲烷。最优选为20％的TFE/二氯甲烷。
步骤四中，缩合剂选自DIC/HOBt，HBTU/HOBt/DIEA，PyBop/HOBt/DIEA中的一种或多种；所用的反应溶剂优选为二氯甲烷、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所用的Fmoc脱除试剂优选为体积比20％的Pip/DMF溶液。
步骤五中，采用的裂解试剂体积比为TFA：EDT：水＝90～95：1～5：1～5，优选为90：5：5。
附图说明 说明书附图图1为利拉鲁肽制备流程图
本发明的有益效果如下：
本发明采用两个片段偶联法进行固相合成利拉鲁肽，其中所述的片段三与片段二容易制备，并且可以同时进行合成，有效地缩短了利拉鲁肽合成周期，从而提高了生产效率；
针对现有技术中多个小片段合成后易为油状物(见对比实施例12)，不易操作且浪费物料，不易通过沉降析晶方式进一步实现纯化的问题，本发明所采用的片段合成法，可有效地减少缺失肽，杂质与主成份的氨基酸序列相差较多，使得产品更容易纯化，后处理操作简单，废液较少，各中间体纯度较高；
本发明所述的方法工艺稳定、制备得到的醋酸利拉鲁肽纯度可达99.6％以上，最大单杂小于0.2％，总收率较高。
具体实施方式
为便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出修正。
本发明说明书和权利要求书中所使用的缩写或英文全称的含义如下表：
实施例1 Fmoc-Gly-Wang Resin的合成：
称取Wang树脂20.00g(取代度0.48mmol/g)加入固相反应器中，加入200mLDMF溶胀30min后抽干。称取14.27gFmoc-Gly-OH，7.13gHOBt，DMAP0.53g，加入烧杯中，用DMF溶解。冰浴下放置10min后向其中加入DIC6.67g，搅拌进行活化得溶液，然后加入反应器中，氮气保护下搅拌反应2h。抽干，依次用适量DMF、IPA、二氯甲烷洗涤树脂，然后加入Ac2O和吡啶各50mL，氮气保护下搅拌进行封堵。8h后抽干溶液，依次用适量DMF、IPA、二氯甲烷洗涤树脂，最后用MeOH收缩，室温下真空干燥至恒重。经检测，取代度为0.43mmol/g。
实施例2多肽片段一树脂肽的合成
Fmoc-Ser20(tBu)-Tyr19(tBu)-Leu18-Glu17(OtBu)-Gly16-Gln15(Trt)-Ala14-Ala13-Lys12(Alloc)-Glu11(OtBu)-Phe10-Ile9-Ala8-Trp7(Boc)-Leu6-Val5-Arg4(Pbf)-Gly3-Arg2(Pbf)-Gly1-Wang树脂的合成
取实施例1中所得Fmoc-Gly-Wang Resin，加入固相反应器中，用100mL DMF溶胀30min后抽干。用体积比为20％的Pip/DMF溶液脱Fmoc两次，溶液体积各100mL，反应时间分别为5min和15min。随后经适量DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次。同时称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH16.74g(25.8mmol)，HOBt 4.18g(30.96mmol)，加入100mL DMF溶解后冰浴下放置10min。随后加入DIC 3.91g(30.96mmol)，搅拌活化得溶液，加入反应器中，氮气保护下搅拌反应2h。完成偶联后抽干反应液，依次经适量DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次。重复上述脱Fmoc、洗涤、活化、偶联、洗涤操作，依次连接如下各氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，即得所需树脂肽。
实施例3 Pal-OSu的合成
向1L单口瓶中加入50.00g(194.99mmol)Pal-OH，350mLTHF，搅拌溶解后0℃放置。向其中加入33.67g(292.49mmol)HOSu，继续0℃下搅拌1h，滴加60.31g(292.49mmol)DCC，加毕室温反应过夜。反应完毕后抽滤，用100mL THF洗涤滤饼，合并母液真空旋干，得到白色固体用500mL二氯甲烷溶解，过滤除去少量不溶物后用500mL饱和食盐水洗涤，水相用200mL二氯甲烷反萃两次。合并有机相，经无水硫酸钠干燥后真空旋干。固体用500mL无水乙醇打浆两次。抽滤得到白色固体51.53g，收率75％。
实施例4 Pal-Glu(OtBu)-OH的合成
向反应瓶中加入Glu(α-OtBu)-OH(购买)、MeOH、三乙胺，室温下搅拌。随后加入Pal-OSu，室温搅拌，点板监测反应1h后反应完毕，浓缩反应液，加入EA，用1％稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥后旋干。得白色固体。
实施例5多肽片段三树脂肽的合成
Fmoc-Ser20(tBu)-Tyr19(tBu)-Leu18-Glu17(OtBu)-Gly16-Gln15(Trt)-Ala14-Ala13-Lys12(Pal-Glu(OtBu))-Glu11(OtBu)-Phe10-Ile9-Ala8-Trp7(Boc)-Leu6-Val5-Arg4(Pbf)-Gly3-Arg2(Pbf)-Gly1-Wang树脂肽合成
向实施例2中所得树脂肽中加入200mL二氯甲烷，12.73mL(103.2mmol)苯硅烷，搅拌5min后加入2.68g(2.32mmol)四(三苯基膦)钯，避光反应0.5h。抽干，用适量二氯甲烷分六次洗涤树脂，抽干。称取Pal-Glu(OtBu)-OH 11.39g(25.8mmol)，HOBt 4.18g(30.96mmol)，加入100mL DMF溶解后冰浴下放置10min。随后加入DIC 3.91g(30.96mmol)，搅拌活化得溶液，加入反应器中，氮气保护下搅拌反应2h。茚三酮监测反应完全，抽干反应液，依次用DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次，抽干，备用。
取0.10g片段三树脂肽，投入1mL裂解液(TFA：EDT：水，90：5：5，体积比)中，室温搅拌3h。反应后过滤，树脂用少量TFA洗涤，合并有机相，与15mL冰乙醚混合沉降，离心，白色沉淀用乙醚洗涤三次。真空干燥得到固体，经检测，纯度为80％。
实施例6 Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC树脂的合成
称取2-CTC Resin(0.75mmol/g)29.00g，加入固相反应器中，用230mL二氯甲烷溶胀30min，抽干。称取25.02g(65.25mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH，加入反应器中，加入150mL二氯甲烷，搅拌下滴加16.86g(130.5mmol)DIEA，氮气保护下搅拌反应2h。茚三酮监测反应完全。随后加入115mLMeOH，搅拌1h对未反应的活性基团进行封堵。反应完成后抽干反应液，依次用DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次，最后用MeOH收缩，室温下真空干燥至恒重。干燥后测得树脂取代度为0.40mmol/g。
实施例7多肽片段二树脂肽的合成
Boc-His31(Trt)-Ala30-Glu29(OtBu)-Gly28-Thr27(tBu)-Phe26-Thr25(tBu)-Ser24(tBu)-Asp23(OtBu)-Val22-Ser21(tBu)-2-CTC树脂的合成
向实施例6得到的树脂中加入230mLDMF溶胀30min，抽干。用体积比为20％的Pip/DMF溶液脱Fmoc两次，溶液体积各115mL，反应时间分别为5min和15min。随后用DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次。同时称取Fmoc-Val-OH 11.81g(34.80mmol)，HOBt5.64g(41.76mmol)，加入1150mL DMF溶解后冰浴下放置10min。随后加入DIC 5.28g(41.76mmol)，搅拌活化得溶液，加入反应器中。氮气保护下搅拌反应2h至偶联反应结束。完成偶联后抽干反应液，依次用DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次。
重复上述脱Fmoc、洗涤、活化、偶联、洗涤操作，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH，即得所需树脂肽。全部缩合完毕后用MeOH收缩树脂。室温下真空干燥，得树脂肽50.63g。直接用于下一步反应。
实施例8多肽片段二的合成
Boc-His31(Trt)-Ala30-Glu29(OtBu)-Gly28-Thr27(tBu)-Phe26-Thr25(tBu)-Ser24(tBu)-Asp23(OtBu)-Val22-Ser21(tBu)-OH的合成
将实施例7所得的树脂加入反应瓶中，加入510mL体积分数20％的TFE/二氯甲烷溶液，室温搅拌2h。茚三酮监测反应完全，抽滤，树脂用少量二氯甲烷洗涤。合并有机相，真空浓缩至油状，加入60mL二氯甲烷，再加入600mL乙醚析出白色固体。过滤收集沉淀，用乙醚洗涤，室温下真空干燥得19.49g产物，纯度90％，收率92％。
实施例9利拉鲁肽树脂的合成
向上述实施例5得到的多肽片段三树脂中加入200mLDMF溶胀30min，抽干。用体积比为20％的Pip/DMF溶液脱保护基Fmoc两次：溶液体积各100mL，反应时间分别为5min和15min。随后用DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次。同时称取实施例8得到的片段二24.87g(30mmol)，HOBt 4.86g(36mmol)，加入100mL DMF溶解后冰浴下放置10min。随后加入DIC4.55g(36mmol)，搅拌活化得溶液，加入反应器中。氮气保护下搅拌反应2h。茚三酮监测反应完全，抽干反应液，依次用DMF、IPA、二氯甲烷各洗涤两次，抽干直接用于下一步。
实施例10利拉鲁肽粗品的合成
取上述所得利拉鲁肽树脂，加入200mL体积比为TFA:EDT:水＝90：5：5的裂解液中，室温搅拌3h。反应后过滤，树脂用少量TFA洗涤，合并有机相，加入2L冰乙醚中沉降。离心，白色沉淀用乙醚洗涤三次，真空干燥得到28.39g粗肽，收率88％，纯度74％
实施例11醋酸利拉鲁肽精肽的制备
称取1.00g利拉鲁肽粗品用胶头滴管取少量氨水加入10ml水中，进行溶解，溶解后采用汉邦制备HPLC系统，波长为220nm，色谱柱为C8反相柱，20M磷酸二氢钾，pH3.0/乙腈为流动相室温纯化，得到纯度大于99.5％的利拉鲁肽精肽。将精肽溶液采用制备HPLC系统，色谱柱为C18反相柱，0.2％醋酸/乙腈为流动相转盐，收集目标组分，减压蒸馏浓缩，冷冻干燥得到醋酸利拉鲁肽精肽0.56g，纯度为99.7％，最大单杂：0.16％；纯化收率为56％，总收率49％；
MALDI-TOF:(M+H)+＝3752.3.
对比实施例12片段[17-24]合成
参照CN104045705的第二多肽片段的制备方法进行如下实验：
称取2-CTC树脂10g(取代度为0.5mmol/g)加入到固相反应器中，二氯甲烷溶胀30min，DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(8.76g，20mmol)和DIEA(3.5mL，20mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到上述固相反应器中，氮气保护下搅拌反应5min后再次加入3.5mLDIEA，继续反应1h，加入3.2gMeOH封闭20min，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Glu(OtBu)-2-CTC树脂。
在Fmoc-Glu(OtBu)-2-CTC树脂中加入20％DBLK脱保护5min后抽干，重新加入20％DBLK脱保护15min，抽干。DMF洗涤6次，将Fmoc-Leu-OH(7.07g，20mmol)，HOBt(2.84g，21mmol)和PyBOP(12.91g，20mmol)溶解于DMF中，冰浴10min，加入7.0mLDIEA活化5min后加入到上述固相反应器中，氮气保护下搅拌反应2h，茚三酮监测反应完全，抽干，DMF洗涤3次，20％DBLK脱保护，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Leu-Glu(OtBu)-2-CTC树脂。
按照上述Fmoc-Leu-OH的偶联及脱保护的方法，在Fmoc-Leu-Glu(OtBu)-2-CTC树脂上逐个连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
将Fmoc-Ser(tBu)-OH(7.67g，20mmol)、HOBt(2.84g，21mmol)和PyBOP(12.91g，20mmol)溶解于DMF中，冰浴10min，加入7.0mLDIEA活化5min后加入到上述固相反应器中，氮气保护下搅拌反应2h，茚三酮监测反应完全，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，MeOH收缩，真空干燥，得到9.2g Ser24(tBu)-Asp23(OtBu)-Val22-Ser21(tBu)-Ser20(tBu)-Tyr19(tBu)-Leu18-Glu17(OtBu)-2-CTC树脂肽。
将上述短链树脂肽转移至500mL单口烧瓶中，加入90mL20％TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，适量DCM洗涤，合并滤液滤液并室温下减压浓缩，残留物用少量DCM溶解，石油醚加入沉降，析出油状物，离心得到油状物片段，纯度76％。
Claims (10)
1.一种利拉鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
步骤一、按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，固相合成第1-20氨基酸多肽片段一树脂肽，所述的多肽片段一树脂肽侧链上偶联有保护基；
步骤二、脱除多肽片段一树脂肽的第12位上赖氨酸的侧链保护基，然后与化合物Pal-Glu(OtBu)-OH进行偶联反应，得到多肽片段三树脂肽；
步骤三、按照利拉鲁肽主链C端至N端的氨基酸顺序，固相合成第21-31氨基酸多肽片段二树脂肽，然后裂解反应脱除树脂，得到多肽片段二，其中所述的多肽片段二侧链上偶联有保护基；
步骤四、多肽片段三树脂肽脱末端保护基后，经固相合成法将多肽片段二偶联反应，得到利拉鲁肽树脂；
步骤五、将利拉鲁肽树脂进行裂解反应得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化后即得利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：多肽片段一树脂肽和多肽片段三树脂肽的Arg、Trp、Glu、Lys、Gln、Glu、Tyr和Ser侧链上偶联有保护基；多肽片段二的Ser、Asp、Thr、Glu和His侧链上偶联有保护基；Tyr、Ser的保护基为tBu；Glu的保护基为OtBu；Arg的保护基为Pbf；Gln的保护基为Trt；Trp的保护基为Boc。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述的多肽片段一树脂肽为
Fmoc-Ser20(tBu)-Tyr19(tBu)-Leu18-Glu17(OtBu)-Gly16-Gln15(Trt)-Ala14-Ala13-Lys12(Alloc)-Glu11(OtBu)-Phe10-Ile9-Ala8-Trp7(Boc)-Leu6-Val5-Arg4(Pbf)-Gly3-Arg2(Pbf)-Gly1-Wang树脂；
所述的多肽片段三树脂肽为Fmoc-Ser20(tBu)-Tyr19(tBu)-Leu18-Glu17(OtBu)-Gly16-Gln15(Trt)-Ala14-Ala13-Lys12(Pal-Glu(OtBu))-Glu11(OtBu)-Phe10-Ile9-Ala8-Trp7(Boc)-Leu6-Val5-Arg4(Pbf)-Gly3-Arg2(Pbf)-Gly1-Wang树脂；
所述的多肽片段二为Boc-His31(Trt)-Ala30-Glu29(OtBu)-Gly28-Thr27(tBu)-Phe26-Thr25(tBu)-Ser24(tBu)-Asp23(OtBu)-Val22-Ser21(tBu)-OH。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利拉鲁肽的固相合成方法中，固相合成的固相载体为Wang树脂或2-CTC树脂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤一中，将Fmoc-Gly-Wang Resin，加入固相反应器中，脱Fmoc反应后与Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行偶联反应，然后重复所述的脱保护基反应和偶联反应，按照多肽片段一树脂肽序列顺序依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到所述多肽片段一树脂肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤一中，脱Fmoc反应采用Pip/DMF、NaOH/MeOH、TEA/DMF中的任意一种；偶联缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBt/DIEA，PyBop/HOBt/DIEA中的一种或多种组合；偶联反应所用的反应溶剂优选为二氯甲烷、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于多肽片段一树脂肽的脱保护基反应是在苯硅烷和四(三苯基膦)钯的作用下进行的。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤三中，包括将Fmoc-Ser(tBu)-2-CTC脱Fmoc保护基，与Fmoc-Val-OH在HOBt/DIC作用下活化偶联反应，然后重复所述的脱保护基反应和偶联反应，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH得到多肽片段二树脂肽。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤四中，所述的缩合剂选自DIC/HOBt，HBTU/HOBt/DIEA，PyBop/HOBt/DIEA中的一种或多种；所用的反应溶剂为二氯甲烷、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所用的Fmoc脱除试剂为V/V 20％的Pip/DMF溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤五中，采用的裂解试剂体积比为TFA：EDT：水＝90～95：1～5：1～5。
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