CN113150108A - 一种利拉鲁肽的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法，将Fmoc‑Arg(NO2)‑Gly‑OH连接到固相载体上，然后按照利拉鲁肽序列偶联其他氨基酸和片段以产生肽树脂，将肽树脂从树脂中切割出新型硝基保护的利拉鲁肽，其中精氨酸残基的两个胍基受硝基保护，在液相中合成了在C端含有OPfp酯的片段，并将其偶联到固相载体上，有效地减少了与产品性质高度相似的消旋杂质His1的产生，并减少了类似的缺失杂质如Ala2、Gly4、Glu3，并通过在纯化步骤之前选择等电点沉淀策略来降低利拉鲁肽的生产成本。

Description

一种利拉鲁肽的固相合成方法
技术领域
本发明涉及利拉鲁肽技术领域，尤其涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。
背景技术
利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发，是一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，采用基因重组技术制备。专利US6268343B1和US6458924B2中描述了利拉鲁肽的固液相合成，其中需要反相HPLC纯化中间体GLP-1(7-37)-OH，然后与Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu在液相条件下反应。在该工艺中，GLP-1(7-37)-OH的N端未受到保护，侧链的保护基团全部被去除，导致杂质大量产生，纯化困难，操作步骤复杂。这些工艺技术复杂，成本高，不适合大规模生产多肽。
专利W02018032521A1描述了采用二肽、三肽、四肽和五肽偶联策略合成利拉鲁肽，具有较好的产率和纯度。然而，在实际应用中，三肽和五肽片段在DMF、NMP或DMSO等偶联溶剂中的溶解度较低，且偶联效率会随着片段大小的增加而降低。
EP2757107描述了在赖氨酸位置使用Fmoc-Lys(Alloc)-OH合成利拉鲁肽。但这些方法工艺复杂，成本高，不适合大规模生产。Alloc的脱保护需要金属催化剂，如较为昂贵的Pd(PPh3)4。此外，催化剂对水分敏感，反应必须在受控条件下进行，最终产物中的重金属含量也是一个需要考虑的问题。因此，这个工艺在商业上是不可行的。
WO2016067271A1描述了利用四肽偶联策略合成利拉鲁肽，以及用于赖氨酸的Fmoc-Lys(Dde)-OH。然而，利用固相合成技术合成四肽及其在后续步骤中的应用是非常昂贵的。Dde基团的脱保护需要水合肼溶液，由于它具有氧化性，易引起多种副反应。
WO2018104922A1描述了通过氨基酸顺序偶联合成利拉鲁肽，以及用于赖氨酸的Fmoc-Lys(Mtt)-OH。然而Mtt基团的去除需要重复使用酸性试剂，这样会影响到主链上不耐酸的氨基酸保护基团和树脂，从而产生更多的杂质。
除此之外，在所有上述专利和固相多肽合成的一般技术中，都存在一些缺点，例如产生大量的废弃物，这意味着在全体脱保护中通过裂解液从树脂中分离多肽时，会产生不需要的固体物质。继而乙腈、硅胶和试剂的高消耗又增加了纯化成本。
利拉鲁肽的合成方法在现有技术中都存在缺陷。
当利拉鲁肽的合成通过逐步顺序氨基酸偶联进行时，会有更大的可能形成类似如des-Ala2、des-Gly4、des-Thr5和des-Thr7的缺失杂质，这反过来又增加了纯化成本，并且杂质去除也很繁琐。这是由于偶联效率随着肽链的增加而降低。
发明内容
鉴于背景技术存在的不足，本发明涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法，根据上述问题，设计了一种固相多肽合成技术，该技术使用了含有OPfp酯的二肽片段，在肽片段C端的OPfp酯基提高了氨基酸的缩合效率，有效地防止了合成过程中β折叠的生成，有效地提高了产率和纯度，有效地减少了与产品性质高度相似的消旋杂质His1的产生，并减少了类似的缺失杂质如Ala2、Gly4、Glu3，并通过在纯化步骤之前选择等电点沉淀策略来降低利拉鲁肽的生产成本。
本发明涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法，所述方法包括以下步骤：S1：在活化剂体系存在下，将N端Fmoc保护的二肽Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH偶联到树脂固相载体上；S2：在第一个二肽片段，即Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH锚定后，使用含10%-30%的哌啶溶液来切割Fmoc基团；S3：在切割Fmoc保护基团后，游离氨基与序列中的下一个氨基酸偶联；S4：在第二个肽片段即Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp偶联后，所连接的Fmoc基团被裂解；S5：在所有氨基酸完成连接后，通过使用混合裂解液，从树脂中切割出肽链，反应在0-40℃下保持搅拌2-5小时；S6：用乙醚、二异丙基醚或甲基叔丁基醚处理TFA中的裂解肽链，并在5-10℃下放置1-2小时，使产品沉淀，将沉淀产物过滤并用乙醚洗涤3-5次并干燥；S7：用氢氧化钠溶液或DIPEA或氨水将被硝基保护的利拉鲁肽粗品水溶液的pH调节至8.0-9.5，除去废弃物；S8：过滤所得的反应物，并根据等电点，通过使用乙酸或高氯酸或三氟乙酸来调节上述水溶液的pH值至5.0-6.5；S9：使用甲酸和钯碳从硝基保护的利拉鲁肽中脱去硝基；S10：对上述利拉鲁肽粗品水溶液进行反相高效液相色谱纯化，并将所需纯组分冻干，得到>99.4%的纯利拉鲁肽，其序列为NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(NO2)-Gly-Arg(NO2)-Gly-COOH。
作为对上述合成方法的进一步实施，S1中所述固相载体包括王树脂、CTC树脂、PHB树脂、HMPA树脂、HMPB树脂、Rink acid树脂、TentaGel TGA树脂、TentaGel S PHB树脂。
作为对上述合成方法的进一步实施，S2中的哌啶溶液可以但不局限于是哌啶溶于DMF、DMSO、NMP或N,N-二乙基乙酰胺这些非质子溶剂，S3中所述该氨基酸是溶于DMF、DMSO、N，N-二乙基乙酰胺或NMP的Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp。
作为对上述合成方法的进一步实施，Fmoc保护的氨基酸和偶联试剂总是过量投入，投入量是树脂取代物的2-4倍当量。
作为对上述合成方法的进一步实施，氨基酸按照以下序列进行偶联和裂解：Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH，Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp，Fmoc-Leu-Val-OPfp， Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ile-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OPfp， Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OPfp ， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OPfp， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp ，Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Boc-His(Boc)-Ala-OPfp。
作为对上述合成方法的进一步实施，S5中所述混合裂解液体积比TFA:TIS: PhOH:H2O 为92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5，用于从树脂中分离多肽。
作为对上述合成方法的进一步实施，除了含有OPfp酯的二肽片段以外，所有氨基酸或肽片段的偶联试剂可为DIC、HBTU、TBTU、PyBoP、HATU、HCTU，以及三级碱如DIPEA、N-甲基吗啉。
作为对上述合成方法的进一步实施，C端含有OPfp酯的二肽片段不使用偶联剂。
作为对上述合成方法的进一步实施，选择0.1%TFA作为流动相A，乙腈作为流动相B。
作为对上述合成方法的进一步实施，选择0.01M磷酸二氢铵作为流动相A，乙腈和甲醇比（1:1）混合液作为流动相B。
本发明的优点如下：
1）通常，所有多肽合成工艺都使用非常昂贵且商业上不易获得的构建模块Fmoc-Arg(Pmc/Pbf)-OH进行合成，而在本发明中，构建模块被廉价且易获得的Fmoc-Arg(NO2)-OH取代。
2）由于采用沉淀法策略去除了大量的废弃物和不需要的固体物质，减少了乙腈和硅胶的消耗。除此之外，提高了纯度和含量，进而更有利于纯化，以获得纯度大于99.0%的产品。
3）在固相多肽合成中使用OPfp酯，可以避免DIC、HBTU、TBTU、PyBoP、HATU、HCTU等加成偶联试剂的使用。对于含有OPfp酯的结构，偶联效率也更高，并有效地阻止了固相多肽合成中的β折叠。
4）随着肽链长度的增加，在利拉鲁肽序列中形成像Des-Ala2、Des-Gly4、Des-Thr5等缺失杂质的可能性变大。将Boc-His(Boc)-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp用于固相多肽合成时，没有形成缺失杂质。
5）使用Boc-His(Boc)-Ala-OPfp可大大减少类似D-组氨酸等可能出现的消旋杂质。
6）将这些二肽片段用于固相多肽合成，由于偶联步骤较少，提高了含量和纯度。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的固相合成方法示意图。
图2是本发明的线性利拉鲁肽王树脂制备示意图。
图3是本发明的Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp的合成示意图。
图4是本发明的Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp的合成示意图。
图5是本发明的含硝基的利拉鲁肽粗品的合成示意图。
图6是本发明的硝基裂解示意图。
具体实施方式
以下将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述和讨论，显然，这里所描述的仅仅是本发明的一部分实例，并不是全部的实例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
为了便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例作进一步的解释说明，且各个实施例不构成对本发明实施例的限定。
本发明所使用的缩写的含义列于下表中：
缩写 中文名称
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CTC resin 2-氯三苯甲基氯树脂
tBu 叔丁基
Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Trt 三苯甲基
CDI N'N-羰基二咪唑
DCC N，N'-二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
DIC N，N-二异丙基碳二亚胺
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
HBTU 苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲四氟硼酸酯
HCTU 6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBT 1-羟基苯并三唑
TFA 三氟乙酸
TIS 三异丙基硅烷
Pal 棕榈酸
PyBOP 1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐
Pfp 五氟苯酚
PhOH 苯酚
以下为文中讨论的杂质：
杂质 1:
NH2-D-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH (消旋异构体)
杂质 2:
NH2-His-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH (Des-Ala2)
杂质 3:
NH2-His-Ala-Glu-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH (Des-Gly4)
杂质 4:
NH2-His-Ala-Glu-Gly-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH (Des-Thr5)
杂质 5:
NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH (Des-Thr7)
本发明的合成产物利拉鲁肽结构如下：
NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH
本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的实施例一参照图1所示，涉及一种高成本效益的利拉鲁肽的合成，特别是减少消旋杂质和缺失杂质，开发了固相多肽合成技术，该技术使用了含有OPfp酯的二肽片段。含C端OPfp基团的二肽片段在溶解度、偶联效率和产率等方面均优于含C端酸性基团的二肽片段。在本发明中，使用含C端OPfp酯的二肽片段作为起始材料。在肽片段C端的OPfp酯基提高了氨基酸的缩合效率，有效地防止了合成过程中β折叠的生成，有效地提高了产率和纯度。
其步骤可分为：
a）树脂结合保护肽的制备。
b）切割多肽树脂，以产生保护的利拉鲁肽，其中两个精氨酸的胍基被硝基保护。
c）通过还原法脱除保护利拉鲁肽的硝基，得到利拉鲁肽粗品。
d）粗肽通过两个阶段的制备高效液相色谱纯化。
上述步骤的具体实施如下：
S1：在活化剂体系存在下，固相合成的第一步是将N端Fmoc保护的二肽Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH的羧基锚定在固相载体上，包括各种固相载体，如王树脂、CTC树脂、PHB树脂、HMPA树脂、HMPB树脂、Rink acid树脂、TentaGel TGA树脂、TentaGel S PHB树脂，用于合成多肽。然而，王树脂和CTC树脂是首选的，因为其更好、更容易的锚定程序和商业化易得性。
S2：在第一个二肽片段，即Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH锚定后，使用含10%-30%的哌啶溶液来切割Fmoc基团，所述哌啶溶液可以是哌啶溶于DMF、DMSO、NMP、N,N-二乙基乙酰胺或合适的非质子溶剂。
S3：在切割Fmoc保护基团后，游离氨基与序列中的下一个氨基酸偶联，该氨基酸是溶于DMF、DMSO、N，N-二乙基乙酰胺、NMP或任何其他合适的非质子溶剂中的Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp。 除了含有OPfp酯的二肽片段以外，所有氨基酸或肽片段的偶联试剂可为DIC、HBTU、TBTU、PyBoP、HATU、HCTU，以及三级碱如DIPEA、N-甲基吗啉，C端含有OPfp酯的二肽片段不使用偶联剂。Fmoc保护的氨基酸和偶联试剂总是过量投入。它可以是树脂取代物的2-4倍当量。
S4：在第二个肽片段即Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp偶联后，所连接的Fmoc基团被裂解，并且类似地，序列中的其他氨基酸按照以下序列进行偶联和裂解：Fmoc-Leu-Val-OPfp，Fmoc-Trp(Boc)-OH， Fmoc-Ile-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OPfp， Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp，Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OPfp ， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OPfp， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp ， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Boc-His(Boc)-Ala-OPfp。偶联和去偶联通过Kaiser检测和四氯苯醌检测来进行监控。
S5：在所有氨基酸完成连接后，通过使用混合裂解液（以TFA（三氟乙酸）、苯酚、TIS（三异丙基硅烷）和水以不同比例组成），从树脂中切割出肽链。混合裂解液优选体积比TFA:TIS: PhOH:H2O 为（92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5），反应在0-40℃下保持搅拌2-5小时。
S6：用合适的溶剂（如乙醚、二异丙基醚或甲基叔丁基醚）处理TFA中的裂解肽，并在5-10℃下放置1-2小时，使产品沉淀。将沉淀产物过滤并用乙醚洗涤3-5次并干燥。通常在多肽从树脂中分离的过程中会产生大量的废弃物和不需要的固体物质。如果纯化过程中伴随着这些废弃物，乙腈和硅胶的消耗量将会更大。单单因为这两种物质的消耗，合成多肽的成本就会很高。由于这种等电点沉淀策略，提高了利拉鲁肽粗品的含量和纯度，并使纯化变得容易，去除了与产物类似的，如缺失肽、添加肽和消旋肽等杂质，大量减少了乙腈和硅胶的消耗。
S7：为了去除这种废弃物，用氢氧化钠溶液或DIPEA或氨水将被硝基保护的利拉鲁肽粗品水溶液的pH调节至8.0-9.5。
S8：过滤所得的反应物，并根据等电点，通过使用乙酸或高氯酸或三氟乙酸来调节上述水溶液的pH值（例如pH 5.0-6.5）。
S9：使用甲酸和钯碳从硝基保护的利拉鲁肽中脱去硝基。
S10：对上述利拉鲁肽粗品水溶液进行反相高效液相色谱纯化，并将所需纯组分冻干，得到>99.4%的纯利拉鲁肽。
上述合成方法中的一些物质合成方法如下：
A）取代度为0.8 mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Gly-Wang树脂的合成如下：
称取50.0g取代度为1.1mmol/g的王树脂，并加入固相多肽合成仪。随后，用DMF冲洗树脂两次，并在DMF中溶胀30分钟。54.78g Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH和13.9g DIC在冰水浴条件下溶解在DMF中，然后加入到上述装载着树脂的合成仪中。5分钟后，加入0.1g DMAP，搅拌2小时。随后，分别用DMF和DCM洗涤树脂3次，用乙酸酐/吡啶/DMF (15mL:15mL:500ml)封闭30分钟，排干。用甲醇对树脂进行收缩，并将甲醇干燥后得到取代度为0.8mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Gly-Wang树脂。
B）参照图2所示，线性利拉鲁肽王树脂的制备如下：
称取65.0g取代度为0.8mmol/g的Fmoc-Arg(NO2)-Gly-Wang树脂，加入反应器中。随后，用DMF洗涤Fmoc-Arg(NO2)-Gly-Wang树脂两次，在DMF中溶胀30分钟。用含20%哌啶的DMF溶液去除Fmoc保护，然后用DMF洗涤树脂5次。采用茚三酮法对树脂进行检测，通过树脂显色表明Fmoc保护基已经去除。
将79.7g的Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp（120.0mmol）溶于DMF中，装入固相反应合成仪，在室温下反应3～4小时。采用茚三酮法确定反应终点。基于利拉鲁肽的肽链骨架序列，重复上述的脱Fmoc保护基和相应的氨基酸偶联步骤：Fmoc-Leu-Val-OPfp， Fmoc-Trp(Boc)-OH， Fmoc-Ile-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OPfp， Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OPfp， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OPfp，Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Boc-His(Boc)-Ala-OPfp，分别被依次偶联起来。
在反应过程中，采用HOBt/DIC体系应用于C-端含有羧基的氨基酸如Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH， Fmoc-Trp(Boc)-OH， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，反应溶剂为DMF，而对于C端含有OPfp酯基的氨基酸，如Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp，Fmoc-Leu-Val-OPfp， Fmoc-Ile-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OPfp， Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp， Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OPfp ， Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OPfp， Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Boc-His(Boc)-Ala-OPfp，则不使用偶联试剂和HOBT体系。
所有氨基酸偶联后，用甲醇将树脂收缩，然后将树脂干燥，得到300.0g利拉鲁肽王树脂的粗品。
C）参照图3所述， Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp的合成如下：
a) Fmoc-Gln(Trt)-OSu的合成
称取Fmoc- Gln(Trt)-OH（61.07 g，100 mmol）并加入到含有500 mL四氢呋喃的三颈烧瓶中。所得混合物在25±2℃下搅拌5分钟，然后加入13.81g（120 mmol）N-羟基丁二酰亚胺，并搅拌5-10分钟。在另一个圆底烧瓶中，将24.76 g（120 mmol）的DCC溶于300 mL四氢呋喃中。然后用此溶液，滴加到上述Fmoc-Gln(Trt)-OH的THF溶液中，控制温度在10±2℃，并在30-45分钟时间内滴完。滴加完成后，将系统加热至室温，再反应3小时。用薄层色谱法（TLC）监测原料直至反应完全。把反应液过滤除去尿素，用旋转蒸发仪将四氢呋喃完全除去，得到粘稠状固体产物。向上述固体产物中加入300mL乙酸乙酯/石油醚，搅拌30分钟，过滤。经过滤、真空干燥，得到白色固体66.0g，收率为93%。
b) Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH的合成
称取L-丙氨酸（9.44 g，105.9 mmol），加入到含有600 mL四氢呋喃和水（1:1）的三颈烧瓶中。该混合物在25±2℃下搅拌5分钟，然后加入11.23g（105.9 mmol）Na2CO3并搅拌5-10分钟。在另一个圆底烧瓶中，取50.0 g Fmoc-Gln(Trt)-OSu（70.64 mmol）溶于500 mL四氢呋喃中，然后将此溶液慢慢滴加到上述溶液中，控制温度在25±2℃，并在30-45分钟的时间内滴完。滴加完成后，将系统加热至室温，再反应3小时。用薄层色谱法（TLC）监测原料直至反应完全。反应完成后，使用旋转蒸发仪完全去除四氢呋喃，向水相中加入600 mL乙酸乙酯，并通过10%柠檬酸溶液将pH值调节至3.5±0.5。分离水层，用乙酸乙酯进一步萃取，减压去除溶剂，得到白色固体。然后用乙酸乙酯和丙酮重结晶纯化，得到干燥的白色固体Fmoc-Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH(47.0g，收率97%）
c) Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp的合成
称取Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH（40.0 g，58.6 mmol）并加入到含有280 mL四氢呋喃的三颈烧瓶中。该混合物在25±2℃下搅拌5分钟，然后加入溶于40.0 mL THF中的五氟苯酚12.95g（70.40 mmol）并搅拌5-10分钟。在另一个圆底烧瓶中，将15.73 g（76.26 mmol）的DCC溶于80 mL四氢呋喃，然后将此溶液慢慢滴加到上述Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH的四氢呋喃溶液中，控制温度在25±2℃，并在30-45分钟的时间内滴完。滴加完成后，在相同温度下再搅拌3-4小时。用薄层色谱法（TLC）监测原料直至反应完全。反应液经过滤除去尿素，溶剂四氢呋喃经旋转蒸发仪完全除去，得到粘稠状固体产物。向上述固体产物中加入甲醇800ml，搅拌90分钟，再过滤。经过滤、真空干燥后，得到白色固体46.5g，收率为93.5%。
类似地，所有二肽和二肽OPfp酯将根据上述步骤来制备。
D）参照图4所示，Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp的合成如下：
a) Pal-Glu(OH)-OtBu 的合成：
称取棕榈酸（100.0 g，389.9 mmol）和N，N'-羰基二咪唑（75.88 g ，467.96mmol），加入到第一个三颈圆底烧瓶中，并加入1000 mL四氢呋喃。该混合物在27±2℃下搅拌3-4小时。在第二个圆底烧瓶中，加入H-Glu(OH)-OtBu（71.33 g，350.97 mmol），54.81 mL三乙胺（389.9 mmol），并将反应物冷却至10±5℃。到达该温度后，慢慢向上述溶液滴加59.4 mL三甲基氯硅烷（467.96 mmol），并在30-45分钟内滴完。滴加完成后，将系统升温至室温，再反应3-4小时。然后将第二个圆底烧瓶的反应物温度冷却至10±5℃，在这个温控范围内将第一个烧瓶的反应物溶液滴加到第二个烧瓶的反应物溶液中，在30-45分钟内滴完。滴加完成后，将系统升温至室温，再反应4小时。反应完成后，通过使用1N HCl溶液将反应物溶液的pH值调节至7±0.5。用旋转蒸发仪将四氢呋喃完全除去，并用1N HCl溶液在5±5℃下，调节反应物溶液的pH至2-3。过滤固体，用水洗涤并干燥，得到白色固体。然后用甲苯和庚烷重结晶纯化Pal-Glu(OH)-OtBu，得到干燥的白色固体（160.0g，收率93%）。
b) Pal-Glu(OSu)-OtBu的合成：
称取Pal-Glu(OH)-OtBu（150.0g，339.62mmol），加入到含有600mL四氢呋喃的三颈烧瓶中。该混合物在25℃±2℃下搅拌5分钟，然后加入46.90 g（407.5 mmol）的N-羟基丁二酰亚胺并搅拌5-10分钟。在另一个圆底烧瓶中，将84.08 g的DCC（407.5 mmol）溶于600 mL四氢呋喃中，然后慢慢滴加到上述Pal-Glu(OH)-OtBu的四氢呋喃溶液中，控制温度在10±2℃，并在30-45分钟时间内滴完。滴加完成后，将系统升温至室温，再反应3小时。用薄层色谱法（TLC）监测原料直至完全反应。过滤反应液以除去尿素，并通过旋转蒸发仪完全除去THF，将所得到的反应物溶解于DCM中，用NaHCO3溶液、饱和食盐水洗涤，并用旋转蒸发仪完全除去DCM，然后用庚烷重结晶。经过滤和真空干燥后，得到170.0g白色固体，产率为93%。
c) Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH的合成：
称取Fmoc-Lysine-OH（102.6 g，278.44 mmol），加入到含有400mL四氢呋喃和水（1:1）的三颈烧瓶中。该混合物在25±2℃下搅拌5分钟，然后加入29.51 g Na2CO3，并搅拌5-10 分钟。在另一个圆形底烧瓶中，将100 g Pal-Glu(OSu)-OtBu（185.62mmol）溶于600 mL四氢呋喃中，然后将此溶液慢慢滴加到上述溶液中，控制温度在25±2℃，在30-45分钟的时间内滴完。滴加完成后，将系统升温至室温，再反应3小时。用薄层色谱法（TLC）监测原料直至完全反应。反应完成后，使用旋转蒸发仪彻底去除THF，将1000mL乙酸乙酯加入水相中，并使用10%柠檬酸溶液将pH值调整为3.5±0.5。分离水层，用乙酸乙酯进一步萃取，减压去除溶剂，得到白色固体。然后用甲醇来重结晶纯化，得到干燥的白色固体Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (135.0g，收率92.0%）
d) Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp的合成：
称取Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH（100 g，126.25 mmol），加入到含有700 mL四氢呋喃的三颈烧瓶中。该混合物在25℃±2℃下搅拌5分钟，然后加入溶于100.0 mL 四氢呋喃的27.88g（151.50 mmol）五氟苯酚，搅拌5-10分钟。在另一个圆底烧瓶中，将33.86 g的DCC（164.13 mmol）溶于400 mL四氢呋喃中，然后将此溶液慢慢滴加到上述Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH 四氢呋喃溶液中，控制温度在25±2℃，在30-45分钟的时间内滴完。滴加完成后，在相同温度下再搅拌3-4小时。用薄层色谱法（TLC）监测原料直至完全反应。反应液经过滤除去尿素，溶剂四氢呋喃经旋转蒸发仪完全除去，得到粘稠状固体产物。向上述固体产物中加入甲醇1000mL，搅拌90分钟，过滤。固体粗品用乙酸乙酯进行重结晶。经过滤、真空干燥后，得到白色固体110.0g，收率90.0%。
E）参照图5所示，含硝基的利拉鲁肽粗品的合成如下：
以（TFA:苯甲硫醚:TIS:H2O）的体积比（92.5:2.5:2.5:2.5）来配制1.3L混合裂解液，装入三颈烧瓶。裂解液冷却至15±2℃，加入259.0g完全保护的利拉鲁肽。反应在15±2℃下进行3.5个小时。反应完成后，树脂被过滤并收集滤液。用少量TFA清洗树脂。将滤液合并，并将其加入到甲苯（5000 mL）和异丙醚（7000 mL）中，以获得湿固体。将所得固体用异丙醚（2 X 1200 mL）进行两次打浆洗涤。过滤和真空干燥后，得到200.0g白色固体。
F）含硝基利拉鲁肽粗品的沉淀方法：
采用等电点沉淀法对含有大量废弃物和不需要的固体化合物的利拉鲁肽粗品进行处理，以减少乙腈和硅胶在进一步纯化过程中的消耗，从而降低成本。
称取利拉鲁肽粗品（200.0 g），加入到含有4000 mL水的三颈烧瓶中。用氨水溶液调节反应物的pH值至9.0±0.5，在25±2℃下搅拌20分钟。过滤反应物，并用乙酸溶液将所得滤液的pH值调节为5±0.5，从而得到沉淀物。所得固体用乙酸乙酯进行两次打浆洗涤。经过滤和真空干燥后，得到140.0g白色固体。
参照图6所示，硝基裂解：
称取硝酸保护的利拉鲁肽（4.0g），加入Pd/C（4.0g），甲酸（300ml），在45℃下搅拌4-6个小时。用高效液相色谱法监控直至完全反应。反应完成后，反应物被过滤以分离Pd/C和产物，得到的利拉鲁肽粗溶液准备进行反相色谱纯化。
利拉鲁肽的纯化：
将利拉鲁肽粗品溶解于浓度为10-30mg/mL的稀氨水溶液中，并在C18柱（50mm x250mm）上进行第一阶段反相HPLC纯化。用流动相梯度洗脱利拉鲁肽（流动相A: 0.2%TFA；流动相B: 乙腈:甲醇）。收集并合并纯度>93%的组分，并将收集到组分总体积的一半的水加入到里面，然后在C8柱（50mm x 250mm）上进一步进行第二阶段反相HPLC纯化。采用流动相梯度洗脱法对纯组分进行洗脱（流动相A: 含0.5%TFA 的0.01 M NH4H2PO4；流动相B: 乙腈）。这一步骤有助于减少相近的拖尾和前延杂质。将>99%的组分汇集，并加入汇集组分总体积一半的水到里面，并将其加载到C18柱上，先用乙酸铵洗涤，再通过使用流动相（流动相A：氨水溶液；流动相B: 乙腈）的梯度洗脱来洗脱所需组分。将>99.4%的组分汇集，在真空下浓缩，然后在等电点处沉淀以获得纯固体产物。
最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
S1：在活化剂体系存在下，将N端Fmoc保护的二肽Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH偶联到树脂固相载体上；
S2：在第一个二肽片段，即Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH锚定后，使用含10%-30%的哌啶溶液来切割Fmoc基团；
S3：在切割Fmoc保护基团后，游离氨基与序列中的下一个氨基酸偶联；
S4：在第二个肽片段即Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp偶联后，所连接的Fmoc基团被裂解；
S5：在所有氨基酸完成连接后，通过使用混合裂解液，从树脂中切割出肽链，反应在0-40℃下保持搅拌2-5小时；
S6：用乙醚、二异丙基醚或甲基叔丁基醚处理TFA中的裂解肽链，并在5-10℃下放置1-2小时，使产品沉淀，将沉淀产物过滤并用乙醚洗涤3-5次并干燥；
S7：用氢氧化钠溶液或DIPEA或氨水将被硝基保护的利拉鲁肽粗品水溶液的pH调节至8.0-9.5，除去废弃物；
S8：过滤所得的反应物，并根据等电点，通过使用乙酸或高氯酸或三氟乙酸来调节上述水溶液的pH值至5.0-6.5；
S9：使用甲酸和钯碳从硝基保护的利拉鲁肽中脱去硝基；
S10：对上述利拉鲁肽粗品水溶液进行反相高效液相色谱纯化，并将所需纯组分冻干，得到>99.4%的纯利拉鲁肽，其序列为NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(NO2)-Gly-Arg(NO2)-Gly-COOH。
2.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：S1中所述固相载体包括王树脂、CTC树脂、PHB树脂、HMPA树脂、HMPB树脂、Rink acid树脂、TentaGel TGA树脂、TentaGel S PHB树脂。
3.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：S2中的哌啶溶液可以但不局限于是哌啶溶于DMF、DMSO、NMP或N,N-二乙基乙酰胺这些非质子溶剂，S3中所述氨基酸是溶于DMF、DMSO、N，N-二乙基乙酰胺或NMP的Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp。
4.根据权利要求1或3所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：Fmoc保护的氨基酸和偶联试剂总是过量投入，投入量是树脂取代物的2-4倍当量。
5.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：氨基酸按照以下序列进行偶联和裂解：Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OH，Fmoc-Arg(NO2)-Gly-OPfp，Fmoc-Leu-Val-OPfp， Fmoc-Trp(Boc)-OH， Fmoc-Ile-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OPfp， Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp， Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp， Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OPfp ， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OPfp， Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp ，Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp， Boc-His(Boc)-Ala-OPfp。
6.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：S5中所述混合裂解液体积比TFA:TIS: PhOH:H2O 为92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5，用于从树脂中分离多肽。
7.根据权利要求1或2或3或5所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：除了含有OPfp酯的二肽片段以外，所有氨基酸或肽片段的偶联试剂可为DIC、HBTU、TBTU、PyBoP、HATU、HCTU，以及三级碱如DIPEA、N-甲基吗啉。
8.根据权利要求7所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：C端含有OPfp酯的二肽片段不使用偶联剂。
9.根据权利要求8所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：选择0.1%TFA作为流动相A，乙腈作为流动相B。
10.根据权利要求9所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：选择0.01M磷酸二氢铵作为流动相A，乙腈和甲醇比（1:1）混合液作为流动相B。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286092A (zh) * 2011-09-14 2011-12-21 深圳翰宇药业股份有限公司 利拉鲁肽的固相合成方法
CN106699871A (zh) * 2016-12-27 2017-05-24 哈药集团技术中心 一种利拉鲁肽的制备方法
CN107022021A (zh) * 2017-03-24 2017-08-08 吉尔生化（上海）有限公司 一种利拉鲁肽的固相合成法
CN107903317A (zh) * 2017-12-29 2018-04-13 江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司 一种利拉鲁肽的合成方法
CN110845600A (zh) * 2018-08-21 2020-02-28 鲁南制药集团股份有限公司 一种制备利拉鲁肽的方法
CN110894227A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 南京华威医药科技集团有限公司 一种利拉鲁肽的固相合成方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286092A (zh) * 2011-09-14 2011-12-21 深圳翰宇药业股份有限公司 利拉鲁肽的固相合成方法
CN106699871A (zh) * 2016-12-27 2017-05-24 哈药集团技术中心 一种利拉鲁肽的制备方法
CN107022021A (zh) * 2017-03-24 2017-08-08 吉尔生化（上海）有限公司 一种利拉鲁肽的固相合成法
CN107903317A (zh) * 2017-12-29 2018-04-13 江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司 一种利拉鲁肽的合成方法
CN110845600A (zh) * 2018-08-21 2020-02-28 鲁南制药集团股份有限公司 一种制备利拉鲁肽的方法
CN110894227A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 南京华威医药科技集团有限公司 一种利拉鲁肽的固相合成方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y M ANGELL等: "Practical protocols for stepwise solid-phase synthesis of cysteine-containing peptides", 《THE JOURNAL OF PEPTIDE RESEARCH》, vol. 60, no. 5, 30 November 2002 (2002-11-30), pages 292 - 299, XP001130120, DOI: 10.1034/j.1399-3011.2002.02838.x *

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