CN115433266A - 一种特立帕肽的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽合成方法，旨在提供一种特立帕肽的固相合成方法，其技术方案要点是，包括以下步骤：S1、制备树脂肽阶段，通过分步固相多肽合成法制备树脂肽，将Fmoc‑Phe‑OH的羧基锚定到CTC树脂上，然后基于特立帕肽的序列，重复Fmoc去保护步骤和相应的氨基酸偶联，得到特立帕肽的树脂肽；S2、切割特立帕肽的树脂肽阶段，将裂解试剂加入特立帕肽的树脂肽中，得到特立帕肽的线性肽；S3、纯化特立帕肽阶段，将特立帕肽的线形肽溶于碳酸氢铵溶液中，通过使用流动相梯度洗脱特立帕肽，得到纯度为99.6%的纯固体，所有杂质含量都低于0.1%。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，更具体地说，它涉及一种特立帕肽的固相合成方法。
背景技术
特立帕肽（重组人甲状旁腺激素）是一种由礼来公司开发的，能够促进骨合成代谢的药物，用于治疗骨质疏松症，特立帕肽是人甲状旁腺激素(PTH)的一部分，内源性PTH是骨骼和肾脏内钙、磷代谢的主要调节因子，每日注射特立帕肽能刺激新骨形成，增加骨密度，特立帕肽注射液（商品名FORTEO）是一种重组人甲状旁腺激素类似物PTH(1-34)，它与含84个氨基酸的人甲状旁腺激素的N端前1-34位氨基酸具有相同的序列。
特立帕肽的常规合成第一种类型是直接固相合成，包括先将氨基酸C端连接到树脂上，然后通过重复脱去N端的氨基保护基，再与保护的氨基酸偶联的步骤，来逐步增长肽链。
CN109897099A描述了通过直接固相多肽合成法来制备特立帕肽，其中肽链增长通过单个氨基酸从C端到N端并按照序列来偶联，在该过程中，溶于DMF的三乙胺被用作Fmoc脱保护试剂，温度为30至65℃，这种脱保护条件可能不适合长期用于切割Fmoc保护基，并且易于外消旋，而且，该专利未提及对特定杂质的控制，如特立帕肽杂质F、D-His、Met(O)8和Met(O)18等。
CN104910269A描述了通过直接固相多肽合成法来制备特立帕肽，其中肽链增长通过单个氨基酸按照从C端到N端的顺序依次偶联到HMP linker树脂上，只是改用了HMPlinker树脂，并且在不改变任何特定的偶联策略和氨基酸保护基的情况下，对于想提高特立帕肽的产率和纯度的可能性还是比较小的。
CN107501408A描述了通过直接固相多肽合成法来制备特立帕肽，其中肽链增长通过单个氨基酸按照从C端到N端的顺序依次偶联到CTC linker树脂上，通过使用COMU作为偶联试剂，哌啶/Cl-HOBT的DMF溶液作为脱保护试剂，His32位置上的外消旋可能很难被抑制住。
第二种类型类似于收敛固相多肽合成（CSPPS），该方法涉及受保护多肽的固相合成（从树脂上切割下来后，这些多肽必须保留Nα-氨基的保护基团和侧链官能团），接着纯化受保护的多肽以及它们的固相偶联。
CN111057139A专利属于收敛固相多肽合成策略，在该专利中，在CTC树脂上合成十肽和十二肽片段，并将肽链切割下来以获得保护肽片段，该保护肽片段又通过使用DIC作为偶联剂，偶联到肽树脂上，然而，较长的肽片段（如十肽和十二肽片段）的溶解度非常低，反应也不容易顺利进行，这将在反应中产生更多不确定性的因素。
CN102731643A专利属于收敛合成工艺，其中在树脂上合成五个保护肽片段，然后部分肽片段被切割下来后与肽树脂进行偶联，通过这五个制备的保护肽片段，最终合成的产物纯度最多仅达到99.3%。
而且，该专利没有描述特定的杂质控制过程，也没描述另外三个受保护肽片段的合成，其纯化也比较昂贵，因此该工艺不太适合商业化，因此亟需一种可以高纯度生产特立帕肽的新型固相合成方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种特立帕肽的固相合成方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种特立帕肽的固相合成方法，包括以下步骤，
S1、制备特立帕肽树脂肽阶段，将CTC树脂加入固相多肽合成仪中，通过DMF洗涤树脂后，向CTC树脂后加入Fmoc-Phe-OH和DIPEA，待反应完全后，通过混合液封闭60分钟后对其进行排干并采用DMF冲洗，然后采用甲醇对其收缩，得到Fmoc-Phe-CTC树脂，将Fmoc-Phe-CTC树脂加入合成反应仪中随后，通过DMF洗涤Fmoc-Phe-CTC树脂两次，并在DMF中溶胀30分钟，然后采用哌啶DMF溶液将Fmoc-Phe-CTC树脂处理后，继续采用DMF反复洗涤，待Fmoc基团脱保护后，将Fmoc-Asn(Trt)-OH加入到树脂肽中，再将HOBt溶于DMF中，并将其加入固相反应合成仪，再向其中加入DIC，室温下反应3-4小时，通过Kaiser试验监测偶联反应的进展，基于特立帕肽的序列，重复上述Fmoc去保护步骤和相应的氨基酸偶联，最后采用甲醇收缩，排干后得到特立帕肽的树脂肽；
S2、切割特立帕肽的树脂肽阶段，将裂解试剂加入特立帕肽的树脂肽中，控制温度为13-17℃，使其反应3-4小时，反应完成后，过滤树脂并收集滤液，将滤液加入甲基叔丁基醚中，并搅拌以得到湿固体，将所得固体加入异丙醚中进行打浆洗涤，经过过滤和真空干燥后，得到特立帕肽的线性肽；
S3、纯化特立帕肽阶段，将特立帕肽的线形肽溶于碳酸氢铵溶液中，并在C18柱上分16次装载，通过使用流动相梯度洗脱特立帕肽，其中流动相A为TFA水溶液；流动相B为乙腈和甲醇的混合液，同时根据紫外吸光度和UPLC的分析来收集组分，将纯度>99%和其他杂质<0.1%的组分收集起来并合并，然后进行冻干，得到纯度为99.6%的纯固体，所有杂质含量都低于0.1%。
本发明进一步设置为：步骤S1中，在固相合成中，分别在特立帕肽树脂肽的序列30和31位上使用Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH，用于防止天冬氨酰亚胺的形成，分别在特立帕肽树脂肽的序列9、14和32位使用Fmoc-His(MBom)-OPfp，用于控制D-His的外消旋杂质。
本发明进一步设置为：步骤S2中，所述裂解试剂按照如下体积比进行配置，TFA:TIS:水:苯甲硫醚:吲哚:甲氧基胺盐酸盐为85:2.5:2.5:5.0:2.5:2.5，用于控制杂质Met(O)18、Met(O)8以及Met(O)18和Met(O)8杂质的混合物的产生。
本发明进一步设置为：步骤S1中，包括以下阶段，
步骤S10、固相合成的第一步，将Fmoc-Phe-OH的羧基锚定到固相载体上；
步骤S11、在锚定第一个氨基酸后，使用哌啶DMF溶液裂解Fmoc基团，游离氨基将与序列中的下一个氨基酸即Fmoc-Asn(Trt)-OH在偶联试剂如DIC的存在下偶联；
步骤S12、第二个氨基酸偶联后，连接的Fmoc基团被裂解，同样，序列中的其他氨基酸按以下顺序偶联和裂解，Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH, Boc-Ser(tBu)-OH。
通过采用上述技术方案，特立帕肽杂质F通过在第30和31个氨基酸位置上使用Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH来控制；D-His杂质通过使用Fmoc-His(MBom)-OPfp（在特立帕肽序列的相应位置）来控制，Met(O)8和Met(O)18杂质通过使用加入到树脂裂解液中的作为清除剂的苯甲硫醚来控制，通过控制这些杂质，使得制得的特立帕肽纯度和产率大大提高。
附图说明
图1为本发明一种特立帕肽的化学结构图；
图2为为特立帕肽杂质F的化学结构图；
图3为Fmoc-His(MBom)-OH的化学结构图；
图4为Met(O)8、18杂质的化学结构图。
具体实施方式
参照图1至图4对本发明一种特立帕肽的固相合成方法实施例做进一步说明。
含天冬氨酸的多肽在碱性和酸性pH条件下，会发生降解现象，从而形成天冬氨酰亚胺或氨基琥珀酰亚胺（3-氨基吡咯烷-2,5-二酮，Asu），该降解反应在Asp-Gly、Asp-Ala和Asp-Val位点尤其普遍，并导致生成多种重排和外消旋产物，其中非天然β-Asp通常形成的量最多，通过N-(2,4-二甲氧基苄基)(Dmb)基团对肽键进行保护，可以阻止酰胺键中的氮对β羧基的进攻，从而消除了天冬氨酰亚胺的形成，组氨酸很容易外消旋，特别是组氨酸的衍生物，在涉及咪唑环π-氮原子的偶联过程中易于外消旋，在组氨酸上引入MBom（4-甲氧基苄氧基甲基）基团，然后结合Fmoc化学方法，可以有效抑制外消旋作用，所对应的氨基酸为Fmoc-His(MBom)-OPfp。
将多肽从树脂上切割下来时，蛋氨酸容易被氧化，在裂解反应期间，特立帕肽更倾向于形成杂质Met(O)18、Met(O)8、以及Met(O)18和Met(O)8杂质的混合物，这些杂质由裂解混合液中的选择性清除剂控制，添加苯甲硫醚等清除剂，在减少这些杂质方面起着关键作用，如果裂解混合试剂中没有加入苯甲硫醚清除剂，这些杂质会增加20%至35%，通过使用这种清除剂，这些杂质大大减少到0.5%至2%，并通过制备色谱纯化来去除。
一种特立帕肽的固相合成方法，包括以下步骤：
S1、制备特立帕肽树脂肽阶段，将CTC树脂加入固相多肽合成仪中，通过DMF洗涤树脂后，向CTC树脂后加入Fmoc-Phe-OH和DIPEA，待反应完全后，通过混合液封闭60分钟后对其进行排干并采用DMF冲洗，然后采用甲醇对其收缩，得到Fmoc-Phe-CTC树脂，将Fmoc-Phe-CTC树脂加入合成反应仪中随后，通过DMF洗涤Fmoc-Phe-CTC树脂两次，并在DMF中溶胀30分钟，然后采用哌啶DMF溶液将Fmoc-Phe-CTC树脂处理后，继续采用DMF反复洗涤，待Fmoc基团脱保护后，将Fmoc-Asn(Trt)-OH加入到树脂肽中，再将HOBt溶于DMF中，并将其加入固相反应合成仪，再向其中加入DIC，室温下反应3-4小时，通过Kaiser试验监测偶联反应的进展，基于特立帕肽的序列，重复上述Fmoc去保护步骤和相应的氨基酸偶联，最后采用甲醇收缩，排干后得到特立帕肽的树脂肽；
S2、切割特立帕肽的树脂肽阶段，将裂解试剂加入特立帕肽的树脂肽中，控制温度为13-17℃，使其反应3-4小时，反应完成后，过滤树脂并收集滤液，将滤液加入甲基叔丁基醚中，并搅拌以得到湿固体，将所得固体加入异丙醚中进行打浆洗涤，经过过滤和真空干燥后，得到特立帕肽的线性肽；
S3、纯化特立帕肽阶段，将特立帕肽的线形肽溶于碳酸氢铵溶液中，并在C18柱上分16次装载，通过使用流动相梯度洗脱特立帕肽，其中流动相A为TFA水溶液；流动相B为乙腈和甲醇的混合液，同时根据紫外吸光度和UPLC的分析来收集组分，将纯度>99%和其他杂质<0.1%的组分收集起来并合并，然后进行冻干，得到纯度为99.6%的纯固体，所有杂质含量都低于0.1%。
步骤S1中，在固相合成中，分别在特立帕肽树脂肽的序列30和31位上使用Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH，用于防止天冬氨酰亚胺的形成，分别在特立帕肽树脂肽的序列9、14和32位使用Fmoc-His(MBom)-OPfp，用于控制D-His的外消旋杂质。
步骤S2中，所述裂解试剂按照如下体积比进行配置，TFA:TIS:水:苯甲硫醚:吲哚:甲氧基胺盐酸盐为85:2.5:2.5:5.0:2.5:2.5，用于控制杂质Met(O)18、Met(O)8以及Met(O)18和Met(O)8杂质的混合物的产生。
步骤S1中，包括以下阶段：
步骤S10、固相合成的第一步，将Fmoc-Phe-OH的羧基锚定到固相载体上；
步骤S11、在锚定第一个氨基酸后，使用哌啶DMF溶液裂解Fmoc基团，游离氨基将与序列中的下一个氨基酸即Fmoc-Asn(Trt)-OH在偶联试剂如DIC的存在下偶联；
步骤S12、第二个氨基酸偶联后，连接的Fmoc基团被裂解，同样，序列中的其他氨基酸按以下顺序偶联和裂解，Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH, Boc-Ser(tBu)-OH。
步骤S1中，取代度为0.9mmol/g的Fmoc-Phe-CTC树脂的合成，树脂肽的合成通过采用分步固相多肽合成法来制备。
其具体操作方式为：称取50.0g取代度为1.1mmol/g的CTC树脂，将其加入固相多肽合成仪中，随后用DMF对树脂进行洗涤，并在DMF中溶胀60分钟，然后向树脂中加入42.61 g的Fmoc-Phe-OH，并加入43.1mL DIPEA，搅拌5-6小时，待反应完成后，再用DMF洗涤树脂6次，未反应完的树脂用DCM:甲醇:DIPEA（体积比8.5：1：0.5）的混合液封闭60分钟，然后排干并再次用DMF冲洗，最后树脂用甲醇收缩，将甲醇干燥后，获得62.0 g Fmoc-Phe-CTC树脂，检测到的取代度为0.9 mmol/g。
步骤S2中，称取62.0g取代度为0.9mmol/g的Fmoc-Phe-CTC树脂，加入合成反应仪中，随后用DMF洗涤树脂两次，并在DMF中溶胀30分钟，通过用20%的哌啶DMF溶液将树脂处理两次来除去Fmoc保护基，接着用DMF洗涤5次，这个脱保护反应通过Kaiser试验来监控进程，在Fmoc基团脱保护后，把67.12g的Fmoc-Asn(Trt)-OH（2.5 eq）加入到树脂肽中，再将15.2g的HOBt（2.5 eq）溶于250mL的DMF中，加入固相反应合成仪，然后加入42.27mL的DIC（6.0eq），并在室温下反应3-4小时，通过Kaiser试验监测偶联反应的进展，基于特立帕肽的序列，重复上述Fmoc去保护步骤和相应的氨基酸偶联步骤，
Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH, Boc-Ser(tBu)-OH，
对于Fmoc-His(MBom)-OPfp的偶联，本方法中无需使用DIC等偶联剂，只需将氨基酸溶解在DMF中，加入到树脂中，通过Kaiser试验监控反应进程，在所有氨基酸偶联后，用甲醇收缩树脂，然后将其排干，得到250g特立帕肽的树脂肽。
步骤S3中，配置2.5L裂解试剂，裂解试剂按照如下原料及体积比进行配置，TFA:TIS:水:苯甲硫醚:吲哚:甲氧基胺盐酸盐，以85:2.5:2.5:5.0:2.5:2.5的体积比配制，并装入三颈瓶中，将裂解试剂冷却至15±2℃，并加入步骤S2中的所制备的250.0 g树脂肽，裂解反应在15±2℃下进行3-4个小时，待反应完成后，过滤树脂并收集滤液，将合并的滤液加入甲基叔丁基醚（2500mL）中，并搅拌以得到湿固体，将所得固体加入异丙醚（2 X 2500 mL）中进行两次打浆洗涤，经过过滤和真空干燥后，得到160.0 g 特立帕肽的线性肽。
步骤S4中，将所制备的特立帕肽粗品（160.0 g）溶于0.1M碳酸氢铵溶液中，并在C18柱（80mm x 250mm）上分16次装载，通过使用流动相梯度洗脱特立帕肽，其中流动相A为0.1%TFA水溶液；流动相B为乙腈和甲醇的混合液，根据紫外吸光度和UPLC的分析来收集组分，将纯度>99%和其他杂质<0.1%的组分收集起来并合并，然后进行冻干，得到30g纯度为99.6%的纯固体，所有杂质含量都低于0.1%。
本发明中缩写说明，Asu：3-氨基吡咯烷-2,5-二酮；Boc：叔丁氧羰基；CTC：2-氯三苯甲基氯；DCC：N,N'-二环己基碳二亚胺；DCM：二氯甲烷；DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺；DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；
Dmb：N-(2,4-二甲氧基苄基)；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；Fmoc：9-芴基甲氧基羰基；HOBt：1-羟基苯并三唑；Mbom：4-甲氧基苄氧基甲基；OMpe：O-(3-甲基-戊基)；OBno：O-(5-丁基-5-壬基)；OPhp：O-(4-丙基-4-庚基)；OPfp：五氟苯基酯；Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；TFA：三氟乙酸；TIS：三异丙基硅烷；THF：四氢呋喃；Trt：三苯甲基。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行通常的变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种特立帕肽的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备特立帕肽树脂肽阶段，将CTC树脂加入固相多肽合成仪中，通过DMF洗涤树脂后，向CTC树脂后加入Fmoc-Phe-OH和DIPEA，待反应完全后，通过混合液封闭60分钟后对其进行排干并采用DMF冲洗，然后采用甲醇对其收缩，得到Fmoc-Phe-CTC树脂，将Fmoc-Phe-CTC树脂加入合成反应仪中，随后通过DMF洗涤Fmoc-Phe-CTC树脂两次，并在DMF中溶胀30分钟，然后采用哌啶DMF溶液将Fmoc-Phe-CTC树脂处理后，继续采用DMF反复洗涤，待Fmoc基团脱保护后，将Fmoc-Asn(Trt)-OH加入到树脂肽中，再将HOBt溶于DMF中，并将其加入固相反应合成仪，再向其中加入DIC，室温下反应3-4小时，通过Kaiser试验监测偶联反应的进展，基于特立帕肽的序列，重复上述Fmoc去保护步骤和相应的氨基酸偶联，最后采用甲醇收缩，排干后得到特立帕肽的树脂肽；
S2、切割特立帕肽的树脂肽阶段，将裂解试剂加入特立帕肽的树脂肽中，控制温度为13-17℃，使其反应3-4小时，反应完成后，过滤树脂并收集滤液，将滤液加入甲基叔丁基醚中，并搅拌以得到湿固体，将所得固体加入异丙醚中进行打浆洗涤，经过过滤和真空干燥后，得到特立帕肽的线性肽；
S3、纯化特立帕肽阶段，将特立帕肽的线形肽溶于碳酸氢铵溶液中，并在C18柱上分16次装载，通过使用流动相梯度洗脱特立帕肽，其中流动相A为TFA水溶液；流动相B为乙腈和甲醇的混合液，同时根据紫外吸光度和UPLC的分析来收集组分，将纯度>99%和其他杂质<0.1%的组分收集起来并合并，然后进行冻干，得到纯度为99.6%的纯固体，所有杂质含量都低于0.1%。
2.根据权利要求1所述的一种特立帕肽的固相合成方法，其特征在于：步骤S1中，在固相合成中，分别在特立帕肽的序列30和31位上使用Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH，用于防止天冬氨酰亚胺的形成，分别在特立帕肽树脂肽的序列9、14和32位使用Fmoc-His(MBom)-OPfp，用于控制D-His的外消旋杂质。
3.根据权利要求1所述的一种特立帕肽的固相合成方法，其特征在于：步骤S2中，所述裂解试剂按照如下体积比进行配置，TFA：TIS：水：苯甲硫醚：吲哚：甲氧基胺盐酸盐为85：2.5：2.5：5.0：2.5：2.5，用于控制杂质Met(O)18、Met(O)8以及Met(O)18和Met(O)8杂质的混合物的产生。
4.根据权利要求1所述的一种特立帕肽的固相合成方法，其特征在于，步骤S1中，包括以下阶段：
步骤S10、固相合成的第一步，将Fmoc-Phe-OH的羧基锚定到固相载体上；
步骤S11、在锚定第一个氨基酸后，使用哌啶DMF溶液裂解Fmoc基团，游离氨基将与序列中的下一个氨基酸即Fmoc-Asn(Trt)-OH在偶联试剂如DIC的存在下偶联；
步骤S12、第二个氨基酸偶联后，连接的Fmoc基团被裂解，同样，序列中的其他氨基酸按以下顺序偶联和裂解，Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH, Boc-Ser(tBu)-OH。
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