CN113135989B - 一种制备利拉鲁肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的合成方法。该方法是通过通过固相合成得到利拉鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到利拉鲁肽粗肽，纯化后得到利拉鲁肽精肽，所述方法包括1～4位采用的是单体R7‑His(R4)‑Ala‑Glu(OR5)‑(R8)‑Gly‑R6，5～6位采用的是单体R8‑Thr(R9)‑Phe‑R10，所述方法还包括1～6位采用的是单体R7‑His(R4)‑Ala‑Glu(OR5)‑(R8)‑Gly‑Thr(R10)‑Phe‑R11。本发明通过采用单体进行利拉鲁肽的合成，使肽中间体容易地被插入SPPS中，能明显抑制/减少错配肽杂质、消旋肽等与产品性质极相似杂质的产生，提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。本发明操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高，利于利拉鲁肽的大规模生产。

Description

一种制备利拉鲁肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备，特别涉及一种制备利拉鲁肽的方法。
背景技术
利拉鲁肽，人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物中的一种，英文名为Liraglutide，是丹麦诺和诺德公司研制出的一种治疗II型糖尿病的药物，其注射剂分别于2010年1月25日获得FDA批准上市(商品名为Victoza)、2011年3月4日获得SFDA批准上市。利拉鲁肽作为GLP-1受体激动剂能起到良好的降低血糖作用。
利拉鲁肽的结构为：H-His1-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal))-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-OH。
现有的利拉鲁肽生产方法及缺陷如下：
1、基因工程法：由于利拉鲁肽是一个具有支链修饰的非天然活性多肽，采用此种方法，主链中间体经过HPLC纯化，再在液相条件下与Glu-脂肪烷基侧链反应，会导致大量杂质产生，难以纯化。而且技术难度极大，设备要求高，大规模生产风险大，成本高，不利于工业化生产。
2、逐步偶联的固相合成方法：按照利拉鲁肽主链肽序依次缩合具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys(X)-OH(X为Lys侧链保护基团)，主链偶联结束，脱除Lys侧链保护基团依次偶联Glu和脂肪烷基。由于利拉鲁肽肽链较长，逐步偶联常导致偶联不完全(即使增加投料和延长反应时间也无法解决)，产生许多错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质，粗肽收率不高；错配肽杂质、消旋肽杂质与利拉鲁肽在性质上极为相似，难以去除，给粗肽的纯化造成极大的困难。
3、片段合成法：利拉鲁肽主链氨基酸有31个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能有利于提高粗肽的收率、抑制/减少错配肽杂质、消旋肽杂质等性质极为相似的杂质的产生。而现有的片段合成法，粗肽收率并不高(如CN102875665A，利拉鲁肽粗肽收率75.2％，77.97％，84.7％)，也未能抑制/减少错配肽杂质、消旋肽杂质等性质极为相似、相近的杂质的产生。
较低收率的粗肽，性质极为相似的杂质的存在，必然导致总收率较低。错配肽杂质、消旋肽杂质等在结构上与利拉鲁肽非常相似、接近，因此使得利拉鲁肽粗肽的纯化分离十分困难，经过使用多种纯化分离体系尝试皆不能达到良好的分离效果。如果进行尝试多次分离，则可以预见多次分离必然会导致产品的显著损失，导致产品收率低，操作繁琐，周期长，废液多，不利于环保，成本显著提高等缺陷，十分不利于利拉鲁肽的大规模生产。
因此，在利拉鲁肽的制造工艺中，应当尽可能地提高粗肽的收率，尽可能地减少与其结构相似、接近的杂质的产生，从源头保证利拉鲁肽的收率和质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的利拉鲁肽的制备方法，操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高等特点，有利于利拉鲁肽的大规模生产。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种制备利拉鲁肽的方法，通过固相合成得到利拉鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到利拉鲁肽粗肽，纯化后得到利拉鲁肽精肽，其中18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，其结构如下：
R1是氢或氨基保护基团，
R2是酯保护基团，
R3是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团。
作为优选，R1是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt或Dmb保护基。
作为优选，R2是叔丁基、甲基、乙基、苄基或烯丙基。
作为优选，其中R3是羟基、OBt、OSU或OPfp基团。
在一些实施方案中，R1是Fmoc，R2是叔丁基，R3是羟基。
申请人意外地发现，通过采用单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够使氨基端氨基酸更容易与其反应，且能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，所述方法还包括1～4位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6，其结构为：
R4是氢或氨基保护基团，
R5是酯保护基团，
R6是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团，
R7是氢或氨基保护基团。
R8是H、Hmb、Dmb、Tmob保护基。
作为优选，R4是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R5是tBu、Bzl。
作为优选，R6是羟基、OBt、OSU、OPfp。
作为优选，R7是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R4是Trt，R5是tBu，R6是羟基，R7是Fmoc，R8是H。
申请人意外地发现，通过采用单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，所述方法还包括5～6位采用的是单体R9-Thr(R10)-Phe-R11，其结构为：
R9是氢或氨基保护基团
R10是氢或羟基保护基团
R11是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团。
作为优选，R9是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R10是tBu或Bzl。
作为优选，R11是羟基、OBt、OSU、OPfp。
作为优选，R9是Fmoc，R10是tBu，R11是羟基。
申请人意外地发现，通过采用单体R9-Thr(R10)-Phe-R11进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，所述方法还包括1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11，其结构为：
R4，R5，R7，R8，R10，R11上述所定义；。
作为优选，R4是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R5是tBu、Bzl。
作为优选，R7是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R8是H、Hmb、Dmb、Tmob保护基。
作为优选，R10是tBu或Bzl。
作为优选，R11是羟基、OBt、OSU、OPfp。
作为优选，R4是Trt，R5是tBu，R7是Fmoc、R10是tBu、R11是羟基，R8是H。
申请人意外地发现，通过采用单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，1～4位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6，5～6位采用的是单体R9-Thr(R10)-Phe-R11。
在一些实施方案中，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～4位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
在一些实施方案中，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～4位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
作为优选，18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11。
在一些实施方案中，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～6位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。
本发明中所采用单体可通过常规方法自行合成，也可通过购买获得。
本发明通过采用单体进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，提高反应效率，能够明显的抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽等与产品性质极为相似杂质的产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。后续通过常规的纯化方法即可得到高收率、高纯度的利拉鲁肽精肽。本发明操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高等特点，利于利拉鲁肽的大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1的HPLC图谱。
图2为本发明实施例3的HPLC图谱。
图3为本发明实施例6的HPLC图谱。
图4为本发明实施例7的HPLC图谱。
图5为本发明实施例8的HPLC图谱。
图6为本对比例1的HPLC图谱。
图7为实施例12中纯化实施例1后的HPLC图谱。
图8为实施例12中纯化对比例1后的的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
使用的英文缩写具体含义如表1所示。
表1本发明中所使用的英文缩写具体含义
实施例1
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.48mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.43g、HOBt 0.97g和DMAP 0.12g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.21g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应24.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.16mmol/g；
取替代值为0.16mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂9.37g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 1.95g和HOBt 0.45g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 0.57g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂17.11g，加入体积比为TFA：Tis：水：Mpr＝91：3：3:3的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.83g利拉鲁肽粗肽，收率为103.61％，纯度为74.79％，HPLC图谱如图1所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表2所示。
表2利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
实施例2
采用单体Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH制备利拉鲁肽
取10.0g CTC树脂(0.90mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.34g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 1.16g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.36mmol/g；
取替代值为0.36mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂4.17g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH4.87g、HBTU 2.84g和HOBt1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH氨基酸偶联结束采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde基团，树脂用DMF洗涤6次，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂10.93g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入甲基叔丁基醚沉淀，再用甲基叔丁基醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.56g利拉鲁肽粗肽，收率为98.81％，纯度为73.52％，HPLC图谱与图1相似。
实施例3
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.48mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 3.57g、HOBt 1.78g和DMAP 0.15g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 2.27g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应6.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.23mmol/g；
取替代值为0.23mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂6.52g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂14.27g，加入体积比为TFA：EDT：PHOH：水＝92.5：2.5：2.5:2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.09g利拉鲁肽粗肽，收率为108.23％，纯度为81.05％，HPLC图谱如图2所示。特征峰相对保留时间与峰面积结果如表3所示。
表3利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
/>
实施例4
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OSU、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OSU制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.80mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 2.38g、HOBt 1.19g和DMAP 0.20g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.51g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.28mmol/g；
取替代值为0.28mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂5.36g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.04g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH偶联。
肽树脂采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OSU 7.83g溶解在100mL DMF中，加入DIEA 2.5ml混合均匀，将氨基酸溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH偶联。
肽树脂采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp 4.74g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 2.5ml混合均匀，将氨基酸溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，树脂用DMF洗涤3次。
肽树脂采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OSU 6.07g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 2.5ml混合均匀，将氨基酸溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，树脂用DMF洗涤3，甲醇洗涤3次。
取所得利拉鲁肽树脂13.18g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.78g利拉鲁肽粗肽，收率为102.72％，纯度为79.36％，HPLC图谱与图2相似。
实施例5
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Dde-Thr(tBu)-Phe-OH、Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.80mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 2.38g、HOBt 1.19g和DMAP 0.20g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.51g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.28mmol/g；
取替代值为0.28mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂5.36g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Dde-Thr(tBu)-Phe-OH偶联，Dde-Thr(tBu)-Phe-OH氨基酸偶联结束采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde基团，树脂用DMF洗涤6次，按照利拉鲁肽肽序完成Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH的偶联。采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde基团。
取所得利拉鲁肽树脂14.21g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.27g利拉鲁肽粗肽，收率为111.43％，纯度为77.54％，HPLC图谱与图2相似。
实施例6
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.40mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.46g、HOBt 2.03g和DMAP 0.73g溶解在100mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.15mmol/g；
取替代值为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂10.00g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH的偶联，偶联结束采用20％DBLK脱除Fmoc保护。
取所得利拉鲁肽树脂17.62g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.37g利拉鲁肽粗肽，收率为113.21％，纯度为77.40％，HPLC图谱如图3所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表4所示。
表4利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
/>
/>
实施例7
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取10.0g CTC树脂(0.90mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.34g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 1.16g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应1.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.24mmol/g；
取替代值为0.24mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂6.25g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂13.14g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入甲基叔丁基醚沉淀，再用甲基叔丁基醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.47g利拉鲁肽粗肽，收率为97.21％，纯度为69.18％，HPLC图谱如图4所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表5所示。
表5利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
/>
实施例8采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.80mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.76g、HOBt 2.38g和DMAP 0.20g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 3.03g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应5.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.35mmol/g；
取替代值为0.35mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂4.29g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、PyBOP 4.29g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的偶联。氨基酸偶联结束，树脂采用20％DBLK脱保护，用DCM、甲醇洗涤干燥。
取所得利拉鲁肽树脂12.73g，加入体积比为TFA：EDT：水＝95：5：5的混合酸解液，搅拌均匀，30℃搅拌反应3-5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.14g利拉鲁肽粗肽，收率为109.12％，纯度为70.49％，HPLC图谱如图5所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表6所示。
表6利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
/>
实施例9
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取20.0g CTC树脂(0.60mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 3.56g溶解在100mL DMF中，加入DIEA 4.65g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应1.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.27mmol/g；
取替代值为0.27mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂5.55g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH4.87g和HOAt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.52g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂12.97g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，35±3℃搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入乙醚沉淀，再用乙醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.47g利拉鲁肽粗肽，收率为97.21％，纯度为71.53％，HPLC图谱与图5相似。
实施例10
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.30mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.45g、HOBt 2.04g和DMAP 0.18g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 2.00g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应24.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端3.0h，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.27mmol/g；
取替代值为0.27mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂5.55g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、PyBOP 4.29g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的偶联。氨基酸偶联结束，树脂采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde，用DCM、甲醇洗涤干燥。
取所得利拉鲁肽树脂13.64g，加入体积比为TFA：EDT：水＝95：5：5的混合酸解液，搅拌均匀，30℃搅拌反应3-5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂用TFA洗涤1次，合并滤液，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.03g利拉鲁肽粗肽，收率为107.16％，纯度为70.96％，HPLC图谱与图5相似。
对比例1
取10.0g Wang树脂(0.40mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.46g、HOBt 2.03g和DMAP 0.73g溶解在100mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.19mmol/g；
取替代值为0.17mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂7.89g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.46g活化5分钟，将活化后的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
向上述固相反应柱中加入100mL 2.0％水合肼的DMF溶液，氮气搅拌反应1.0h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性；
将Fmoc-Glu-OtBu6.38g、HOBt 2.03g和PyBOP7.81g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次；
将棕榈酸3.84g、HOBt2.03g和PyBOP7.81g溶解在50mL DCM/DMF＝1：1溶液中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤6次；
取所得利拉鲁肽树脂14.27g，加入体积比为TFA：Tis：水＝90：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到4.71g利拉鲁肽粗肽，收率为83.71％，纯度为61.57％。HPLC图谱如图6所示，特征峰相对时间与峰面积结果如表7所示。
表7对比例1的利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
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对比例2
取10.0g CTC树脂(0.90mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.34g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 1.16g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.32mmol/g；
取替代值为0.32mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂4.69g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH4.87g、HBTU 2.84g和HOBt1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
向上述固相反应柱中加入100mL DCM和3.24g苯硅烷，氮气搅拌10分钟后加入0.87g四(三苯基膦)钯，反应3.0h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性；
将Fmoc-Glu-OtBu(6.38g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIPEA(1.94g，15mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次；
将棕榈酸3.84g、HOBt2.03g和PyBOP 7.81g溶解在50mL DCM/DMF＝4：1溶液中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤6次；
取所得利拉鲁肽树脂11.67g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入甲基叔丁基醚沉淀，再用甲基叔丁基醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到4.42g利拉鲁肽粗肽，收率为78.56％，纯度为63.52％，HPLC图谱与图6相似。
实施例12
利拉鲁肽粗肽纯化
分别将实施例1～11、对比例1～2的1.0g利拉鲁肽粗肽，加入160mL纯化水、40mL乙腈超声溶解，滴加加三乙胺至完全溶清，制成5mg/mL的粗肽溶液，经0.45μm有机滤膜过滤。
将过滤后的粗肽溶液，经色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料纯化。以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，乙腈混合溶液作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并分析纯度，得到中间体1。
将上述收集主峰，以0.1％HCOOH为流动相A，乙腈混合溶液作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰馏份并分析纯度，后将馏份进行冷冻干燥即得利拉鲁肽精肽。
实施例1纯化后的HPLC图谱如图7所示，其特征峰相对保留时间与峰面积如表8所示。实施例2～11纯化后的HPLC图谱与图7相似。对比例1纯化后的HPLC图谱如图8所示，其特征峰相对保留时间与峰面积如表9所示。对比例1纯化后的HPLC图谱与图8相似。纯化后的利拉鲁肽精肽纯度、总收率结果如表10所示。
表8利拉鲁肽精肽特征峰相对保留时间与峰面积
表9利拉鲁肽精肽特征峰相对保留时间与峰面积
表10利拉鲁肽精肽纯度、总收率结果
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Claims (12)

1.一种制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，通过固相合成得到利拉鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到利拉鲁肽粗肽，纯化、冻干后得到利拉鲁肽精肽，其中18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，其结构如下：
R1是氢或氨基保护基团，
R2是酯保护基团，
R3是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团，
其中，1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11,其结构为：
R4是氢或氨基保护基团，
R5是酯保护基团，
R7是氢或氨基保护基团，
R8是H、Hmb、Dmb或Tmob保护基，
R10是氢或羟基保护基团，
R11是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中R1是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt或Dmb保护基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中R2是叔丁基、甲基、乙基、苄基或烯丙基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中R3是羟基、OBt、OSU或OPfp。
5.根据权利要求1所述的方法，其中R1是Fmoc，R2是叔丁基，R3是羟基。
6.根据权利要求1所述的方法，R4是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
7.根据权利要求1所述的方法，R5是tBu或Bzl。
8.根据权利要求1所述的方法，R7是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
9.根据权利要求1所述的方法，R8是H、Hmb、Dmb或Tmob保护基。
10.根据权利要求1所述的方法，R10是tBu或Bzl。
11.根据权利要求1所述的方法，R11是羟基、OBt、OSU或OPfp。
12.根据权利要求1所述的方法，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～6位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。
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