WO2021143159A1 - 一种制备利拉鲁肽的方法 - Google Patents

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WO2021143159A1 PCT/CN2020/114185 CN2020114185W WO2021143159A1 WO 2021143159 A1 WO2021143159 A1 WO 2021143159A1 CN 2020114185 W CN2020114185 W CN 2020114185W WO 2021143159 A1 WO2021143159 A1 WO 2021143159A1
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ala
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gly
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付玉清
李新宇
马洪季
徐州文
张利香
吴丽芬
李文静
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深圳市健元医药科技有限公司
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to the preparation of polypeptide medicines, in particular to a method for preparing liraglutide.
  • Liraglutide one of the analogs of human glucagon-like peptide-1 (GLP-1), named Liraglutide in English, is a drug for the treatment of type II diabetes developed by Novo Nordisk, Denmark. Its injections were approved by the FDA (trade name Victoza) on January 25, 2010, and SFDA approval on March 4, 2011. Liraglutide as a GLP-1 receptor agonist can play a good role in lowering blood sugar.
  • the structure of liraglutide is: H-His 1 -Ala 2 -Glu 3 -Gly 4 -Thr 5 -Phe 6 -Thr 7 -Ser 8 -Asp 9 -Val 10 -Ser 11 -Ser 12 -Tyr 13 -Leu 14 -Glu 15 -Gly 16 -Gln 17 -Ala 18 -Ala 19 -Lys 20 (N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal))-Glu 21 -Phe 22 -Ile 23 -Ala 24 -Trp 25 -Leu 26 -Val 27 -Arg 28 -Gly 29 -Arg 30 -Gly 31 -OH.
  • Step-by-step coupling solid-phase synthesis method sequentially condense amino acids with N-terminal Fmoc protection and side chain protection in accordance with the sequence of the main chain peptide of liraglutide, and the lysine adopts Fmoc-Lys(X)-OH(X is Lys side chain protecting group), the main chain coupling is finished, the Lys side chain protecting group is removed and the Glu and the fatty alkyl group are coupled in turn.
  • mismatched peptide impurities such as amino acid missing peptides, amino acid redundant peptides
  • Racemic peptide impurities the yield of crude peptides is not high; mismatched peptide impurities, racemic peptide impurities and liraglutide are very similar in nature and difficult to remove, causing great difficulties in the purification of crude peptides.
  • Fragment synthesis method There are 31 amino acids in the main chain of liraglutide. There are many forms of synthesis by fragment method, but only a suitable fragment method can help increase the yield of crude peptides and inhibit/reduce mismatched peptide impurities The production of impurities with very similar properties such as racemic peptide impurities. However, the existing fragment synthesis method does not have a high yield of crude peptide (such as CN102875665A, the yield of liraglutide crude peptide is 75.2%, 77.97%, 84.7%), and it fails to inhibit/reduce the impurity and racemization of mismatched peptides. The generation of impurities with very similar and similar properties such as peptide impurities.
  • the yield of crude peptide should be increased as much as possible, and the generation of impurities similar to and close to its structure should be reduced as much as possible, so as to ensure the yield and quality of liraglutide from the source.
  • the purpose of the present invention is to provide a new preparation method of liraglutide, which is simple in operation, low in raw material cost, short synthesis period, easy post-processing, few by-products, high product yield, etc., which is beneficial to the development of liraglutide. Mass production.
  • the technical solutions adopted by the present invention to solve its technical problems are:
  • Liraglutide resin is obtained by solid-phase synthesis. After cleavage and deprotection, the crude liraglutide peptide is obtained, and the refined liraglutide peptide is obtained after purification, which contains 18-20 positions.
  • the monomer R1-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OR2)-R3 is used, and its structure is as follows:
  • R1 is a hydrogen or amino protecting group
  • R2 is an ester protecting group
  • R3 is a hydroxyl, chlorine, OBt, OSU or OPfp group.
  • R1 is a Fmoc, Dde, Alloc, Boc, Trt or Dmb protecting group.
  • R2 is tert-butyl, methyl, ethyl, benzyl or allyl.
  • R3 is a hydroxyl group, OBt, OSU or OPfp group.
  • R1 is Fmoc
  • R2 is tert-butyl
  • R3 is hydroxyl
  • the body is easily inserted into the SPPS, which can make the amino terminal amino acid react with it more easily, and can significantly inhibit/reduce the generation of mismatched peptide impurities (such as amino acid deletion peptides, amino acid redundant peptides), racemic peptide impurities, and significantly improve Yield and purity of liraglutide crude peptide.
  • the method also includes the monomer R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6 used at positions 1 to 4, the structure of which is:
  • R4 is a hydrogen or amino protecting group
  • R5 is an ester protecting group
  • R6 is a hydroxyl, chlorine, OBt, OSU or OPfp group
  • R7 is hydrogen or an amino protecting group.
  • R8 is a protecting group for H, Hmb, Dmb, and Tmob.
  • R4 is a Fmoc, Dde, Alloc, Boc, Trt, Dmb, Mmt or Mtt protecting group.
  • R5 is tBu or Bzl.
  • R6 is hydroxyl, OBt, OSU, OPfp.
  • R7 is a Fmoc, Dde, Alloc, Boc, Trt, Dmb, Mmt or Mtt protecting group.
  • R4 is Trt
  • R5 is tBu
  • R6 is hydroxyl
  • R7 is Fmoc
  • R8 is H.
  • the peptide intermediate can be easily inserted into the SPPS It can significantly inhibit/reduce the production of mismatched peptide impurities (such as amino acid deletion peptides, amino acid redundant peptides) and racemic peptide impurities, and significantly improve the yield and purity of liraglutide crude peptides.
  • the method also includes the monomer R9-Thr(R10)-Phe-R11 used at positions 5-6, the structure of which is:
  • R9 is a hydrogen or amino protecting group
  • R10 is hydrogen or a hydroxyl protecting group
  • R11 is a hydroxyl, chlorine, OBt, OSU or OPfp group.
  • R9 is a Fmoc, Dde, Alloc, Boc, Trt, Dmb, Mmt or Mtt protecting group.
  • R10 is tBu or Bzl.
  • R11 is hydroxyl, OBt, OSU, OPfp.
  • R9 is Fmoc
  • R10 is tBu
  • R11 is hydroxyl
  • the peptide intermediate can be easily inserted into the SPPS, and the mismatched peptide impurities can be significantly inhibited/reduced (For example, amino acid deletion peptides, amino acid redundant peptides), racemic peptide impurities are produced, which obviously improves the yield and purity of liraglutide crude peptide.
  • the method also includes the monomer R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11 used at positions 1 to 6, the structure of which is:
  • R4, R5, R7, R8, R10, R11 are as defined above;.
  • R4 is a Fmoc, Dde, Alloc, Boc, Trt, Dmb, Mmt or Mtt protecting group.
  • R5 is tBu or Bzl.
  • R7 is a Fmoc, Dde, Alloc, Boc, Trt, Dmb, Mmt or Mtt protecting group.
  • R8 is a protecting group for H, Hmb, Dmb, or Tmob.
  • R10 is tBu or Bzl.
  • R11 is hydroxyl, OBt, OSU, OPfp.
  • R4 is Trt
  • R5 is tBu
  • R7 is Fmoc
  • R10 is tBu
  • R11 is hydroxyl
  • R8 is H.
  • the body is easily inserted into SPPS, which can obviously inhibit/reduce the production of mismatched peptide impurities (such as amino acid deletion peptides, amino acid redundant peptides), racemic peptide impurities, and significantly improve the yield and purity of liraglutide crude peptide.
  • the monomer R1-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OR2)-R3 is used for positions 18-20, and the monomer is used for positions 1-4 R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6, the monomer R9-Thr(R10)-Phe-R11 is used for positions 5 to 6.
  • the monomer Fmoc-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OtBu)-OH is used in positions 18-20, and the monomer used in positions 1-4 It is the monomer Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly, and the monomer Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH is used for positions 5 to 6.
  • the monomer Fmoc-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OtBu)-OH is used in positions 18-20, and the monomer used in positions 1-4 It is the monomer Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly, and the monomer Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH is used for positions 5 to 6.
  • the monomer R1-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OR2)-R3 is used for positions 18 to 20, and the monomer is used for positions 1 to 6 R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11.
  • the monomer Fmoc-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OtBu)-OH is used in positions 18-20, and the monomer used in positions 1-6 It is the monomer Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH.
  • the monomers used in the present invention can be synthesized by conventional methods, or can be obtained through purchase.
  • the present invention uses monomers to synthesize liraglutide, which enables peptide intermediates to be easily inserted into SPPS, improves reaction efficiency, and can significantly inhibit/reduce mismatched peptide impurities (e.g., amino acid missing peptides, amino acid redundant peptides). ), racemic peptides and other impurities that are very similar to the product properties, which significantly improve the yield and purity of liraglutide crude peptides. Subsequent use of conventional purification methods can obtain high-yield, high-purity liraglutide peptides.
  • the invention has the advantages of simple operation, low raw material cost, short synthesis cycle, easy post-treatment, few by-products, high product yield and the like, which is beneficial to the large-scale production of liraglutide.
  • Figure 1 is an HPLC chart of Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 is an HPLC chart of Example 3 of the present invention.
  • Figure 3 is an HPLC chart of Example 6 of the present invention.
  • Figure 4 is an HPLC chart of Example 7 of the present invention.
  • Figure 5 is an HPLC chart of Example 8 of the present invention.
  • Figure 6 is the HPLC chart of Comparative Example 1.
  • Fig. 7 is the HPLC chart after purification of Example 1 in Example 12.
  • FIG. 8 is the HPLC chart of Comparative Example 1 after purification in Example 12.
  • the present invention discloses a method for synthesizing liraglutide. Those skilled in the art can learn from the content of this article and appropriately improve the process parameters to achieve it. In particular, it should be pointed out that all similar replacements and modifications are obvious to those skilled in the art, and they are all deemed to be included in the present invention.
  • the method of the present invention has been described through preferred embodiments, and the relevant personnel can obviously modify or appropriately change and combine the compounds and preparation methods described herein without departing from the content, spirit and scope of the present invention to achieve and Apply the technology of the present invention.
  • Fmoc-Gly-OH 1.43g, HOBt 0.97g and DMAP 0.12g in 50mL DMF, add DIC 1.21g to activate for 5 minutes under ice bath conditions, add the activated solution to the solid phase reaction column, stir with nitrogen After reaction for 24.0h, Fmoc-Gly-Wang resin was end-capped with acetic anhydride/DIEA, the resin was washed with DMF and DCM, and methanol was shrunk and drained to obtain Fmoc-Gly-Wang resin. The detection degree of substitution was 0.16mmol/g;
  • Fmoc-Gly-Wang resin Take 9.37g of Fmoc-Gly-Wang resin with a substitution value of 0.16mmol/g, add it to the solid phase synthesis reaction column, wash the resin twice with DMF, swell the Fmoc-Gly-Wang resin with DMF for 30 minutes, and then use 20% DBLK to remove it. To protect, wash the resin 3 times with DMF, 3 times with DCM, and check the color of the resin with ninhydrin. The color of the resin indicates complete removal of Fmoc.
  • Fmoc-Gly-OH Dissolve 1.34g of Fmoc-Gly-OH in 50mL DMF, add DIEA 1.16g to the amino acid solution and mix well, add the amino acid solution to the above solid phase reaction column, stir and react with nitrogen for 4.0h, Fmoc-Gly-CTC resin is used Capped with methanol/DIEA, the resin was washed with DMF and DCM, and the methanol was shrunk and drained to obtain Fmoc-Gly-CTC resin with a detection degree of substitution of 0.36mmol/g;
  • Dde-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OtBu)-OH amino acid coupling is completed, using 2.0% hydrazine hydrate/DMF to remove Dde group, resin Wash 6 times with DMF, follow the sequence of liraglutide peptide to complete Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu )-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr( tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH
  • the peptide resin was deprotected with 20% DBLK, washed with DMF 3 times, DCM washed 3 times, and ninhydrin was used to detect the resin. The color of the resin indicates that the Fmoc has been completely removed.
  • the peptide resin is deprotected with 20% DBLK, washed with DMF 3 times, DCM washed 3 times, and ninhydrin is used to detect the resin.
  • the color of the resin indicates that the Fmoc has been removed completely.
  • the Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp 4.74 g Dissolve in 50mL DMF, add DIEA 2.5ml and mix well, add the amino acid solution to the above solid phase reaction column, stir the reaction with nitrogen for 2-5h, take the ninhydrin test negative as the end of the reaction, and wash the resin 3 times with DMF .
  • the peptide resin was deprotected with 20% DBLK.
  • the resin was washed with DMF 3 times, DCM washed 3 times, and the resin was detected with ninhydrin.
  • the color of the resin indicates that the Fmoc has been completely removed.
  • the Boc-His(Trt)-Ala-Glu( Dissolve 6.07g of OtBu)-Gly-OSU in 50mL DMF add DIEA 2.5ml and mix well, add the amino acid solution to the above solid phase reaction column, stir and react with nitrogen for 2-5h, and the reaction is finished when the ninhydrin test is negative ,
  • the resin was washed 3 times with DMF and 3 times with methanol.
  • Fmoc-Gly-OH Dissolve 1.34g of Fmoc-Gly-OH in 50mL DMF, add DIEA 1.16g to the amino acid solution and mix well, add the amino acid solution to the solid phase reaction column, stir and react with nitrogen for 1.0h, Fmoc-Gly-CTC resin is used Capped with methanol/DIEA, the resin was washed with DMF and DCM, and the methanol was shrunk and drained to obtain Fmoc-Gly-CTC resin with a detection substitution degree of 0.24mmol/g;
  • Liraglutide peptide sequence is completed in sequence Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Dde-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OtBu)-OH, Fmoc-Ala-Ala-Lys(N- ⁇ -( ⁇ -Glu(N- ⁇ -Pal)-OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)
  • Fmoc-Gly-OH Dissolve 1.34g of Fmoc-Gly-OH in 50mL DMF, add DIEA 1.16g to the amino acid solution and mix well, add the amino acid solution to the above solid phase reaction column, stir and react with nitrogen for 4.0h, Fmoc-Gly-CTC resin is used Capped with methanol/DIEA, the resin was washed with DMF and DCM, and the methanol was shrunk and drained to obtain Fmoc-Gly-CTC resin with a detection substitution degree of 0.32mmol/g;
  • the filtered crude peptide solution was purified by a chromatographic column with a size of 30*250mm and packed with a 10 ⁇ m C8 bonded silica gel filler.
  • Example 1 The purified HPLC spectrum of Example 1 is shown in FIG. 7, and its characteristic peak relative retention time and peak area are shown in Table 8.
  • the purified HPLC spectra of Examples 2-11 are similar to those in FIG. 7.
  • the purified HPLC spectrum of Comparative Example 1 is shown in Figure 8, and its characteristic peak relative retention time and peak area are shown in Table 9.
  • the purified HPLC profile of Comparative Example 1 is similar to that of FIG. 8.
  • Table 10 shows the purity and total yield of the purified liraglutide peptide.

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Abstract

提供一种利拉鲁肽的合成方法，包括通过固相合成得到利拉鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到利拉鲁肽粗肽，纯化后得到利拉鲁肽精肽，其中利拉鲁肽18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，1～4位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6，5～6位采用的是单体R9-Thr(R10)-Phe-R11，或者1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11。

Description

一种制备利拉鲁肽的方法 技术领域
本发明涉及多肽药物制备，特别涉及一种制备利拉鲁肽的方法。
背景技术
利拉鲁肽，人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物中的一种，英文名为Liraglutide，是丹麦诺和诺德公司研制出的一种治疗II型糖尿病的药物，其注射剂分别于2010年1月25日获得FDA批准上市(商品名为Victoza)、2011年3月4日获得SFDA批准上市。利拉鲁肽作为GLP-1受体激动剂能起到良好的降低血糖作用。
利拉鲁肽的结构为：H-His 1-Ala 2-Glu 3-Gly 4-Thr 5-Phe 6-Thr 7-Ser 8-Asp 9-Val 10-Ser 11-Ser 12-Tyr 13-Leu 14-Glu 15-Gly 16-Gln 17-Ala 18-Ala 19-Lys 20(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal))-Glu 21-Phe 22-Ile 23-Ala 24-Trp 25-Leu 26-Val 27-Arg 28-Gly 29-Arg 30-Gly 31-OH。
现有的利拉鲁肽生产方法及缺陷如下：
1、基因工程法：由于利拉鲁肽是一个具有支链修饰的非天然活性多肽，采用此种方法，主链中间体经过HPLC纯化，再在液相条件下与Glu-脂肪烷基侧链反应，会导致大量杂质产生，难以纯化。而且技术难度极大，设备要求高，大规模生产风险大，成本高，不利于工业化生产。
2、逐步偶联的固相合成方法：按照利拉鲁肽主链肽序依次缩合具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys(X)-OH(X为Lys侧链保护基团)，主链偶联结束，脱除Lys侧链保护基团依次偶联Glu和脂肪烷基。由于利拉鲁肽肽链较长，逐步偶联常导致偶联不完全(即使增加投料和延长反应时间也无法解决)，产生许多错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质，粗肽收率不高；错配肽杂质、消旋肽杂质与利拉鲁肽在性质上极为相似，难以去除，给粗肽的纯化造成极大的困难。
3、片段合成法：利拉鲁肽主链氨基酸有31个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能有利于提高粗肽的收率、抑制/减少错配肽杂质、消旋肽杂质等性质极为相似的杂质的产生。而现有的片段合成法，粗肽收率并不高(如CN102875665A，利拉鲁肽粗肽收率75.2％，77.97％，84.7％)，也未能抑制/减少错配肽杂质、消旋肽杂质等性质极为相似、相近的杂质的产生。
较低收率的粗肽，性质极为相似的杂质的存在，必然导致总收率较低。错配肽杂质、消旋肽杂质等在结构上与利拉鲁肽非常相似、接近，因此使得利拉鲁肽粗肽的纯化分离十分困难，经过使用多种纯化分离体系尝试皆不能达到良好的分离效果。如果进行尝试多次分离，则可以预见多次分离必然会导致产品的显著损失，导致产品收率低，操作繁琐，周期长，废液多，不利于环保，成本显著提高等缺陷，十分不利于利拉鲁肽的大规模生产。
因此，在利拉鲁肽的制造工艺中，应当尽可能地提高粗肽的收率，尽可能地减少与其结构相似、接近的杂质的产生，从源头保证利拉鲁肽的收率和质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的利拉鲁肽的制备方法，操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高等特点，有利于利拉鲁肽的大规模生产。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种制备利拉鲁肽的方法，通过固相合成得到利拉鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到利拉鲁肽粗肽，纯化后得到利拉鲁肽精肽，其中18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，其结构如下：
Figure PCTCN2020114185-appb-000001
R1是氢或氨基保护基团，
R2是酯保护基团，
R3是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团。
作为优选，R1是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt或Dmb保护基。
作为优选，R2是叔丁基、甲基、乙基、苄基或烯丙基。
作为优选，其中R3是羟基、OBt、OSU或OPfp基团。
在一些实施方案中，R1是Fmoc，R2是叔丁基，R3是羟基。
申请人意外地发现，通过采用单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够使氨基端氨基酸更容易与其反应，且能够明显 地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，所述方法还包括1～4位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6，其结构为：
Figure PCTCN2020114185-appb-000002
R4是氢或氨基保护基团，
R5是酯保护基团，
R6是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团，
R7是氢或氨基保护基团。
R8是H、Hmb、Dmb、Tmob保护基。
作为优选，R4是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R5是tBu、Bzl。
作为优选，R6是羟基、OBt、OSU、OPfp。
作为优选，R7是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R4是Trt，R5是tBu，R6是羟基，R7是Fmoc，R8是H。
申请人意外地发现，通过采用单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，所述方法还包括5～6位采用的是单体R9-Thr(R10)-Phe-R11，其结构为：
Figure PCTCN2020114185-appb-000003
R9是氢或氨基保护基团
R10是氢或羟基保护基团
R11是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团。
作为优选，R9是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R10是tBu或Bzl。
作为优选，R11是羟基、OBt、OSU、OPfp。
作为优选，R9是Fmoc，R10是tBu，R11是羟基。
申请人意外地发现，通过采用单体R9-Thr(R10)-Phe-R11进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，所述方法还包括1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11，其结构为：
Figure PCTCN2020114185-appb-000004
R4，R5，R7，R8，R10，R11上述所定义；。
作为优选，R4是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R5是tBu、Bzl。
作为优选，R7是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
作为优选，R8是H、Hmb、Dmb、Tmob保护基。
作为优选，R10是tBu或Bzl。
作为优选，R11是羟基、OBt、OSU、OPfp。
作为优选，R4是Trt，R5是tBu，R7是Fmoc、R10是tBu、R11是羟基，R8是H。
申请人意外地发现，通过采用单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。
作为优选，18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，1～4位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6，5～6位采用的是单体R9-Thr(R10)-Phe-R11。
在一些实施方案中，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～4位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
在一些实施方案中，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～4位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
作为优选，18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11。
在一些实施方案中，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～6位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。
本发明中所采用单体可通过常规方法自行合成，也可通过购买获得。
本发明通过采用单体进行利拉鲁肽的合成，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，提高反应效率，能够明显的抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽等与产品性质极为相似杂质的产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。后续通过常规的纯化方法即可得到高收率、高纯度的利拉鲁肽精肽。本发明操作简单，原材料成本低，合成周期短，后处理容易，副产物少，产品收率高等特点，利于利拉鲁肽的大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1的HPLC图谱。
图2为本发明实施例3的HPLC图谱。
图3为本发明实施例6的HPLC图谱。
图4为本发明实施例7的HPLC图谱。
图5为本发明实施例8的HPLC图谱。
图6为本对比例1的HPLC图谱。
图7为实施例12中纯化实施例1后的HPLC图谱。
图8为实施例12中纯化对比例1后的的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
使用的英文缩写具体含义如表1所示。
表1 本发明中所使用的英文缩写具体含义
Figure PCTCN2020114185-appb-000005
Figure PCTCN2020114185-appb-000006
实施例1
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.48mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.43g、HOBt 0.97g和DMAP 0.12g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.21g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应24.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.16mmol/g；
取替代值为0.16mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂9.37g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 1.95g和HOBt 0.45g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 0.57g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂17.11g，加入体积比为TFA：Tis：水：Mpr＝91：3：3:3的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.83g利拉鲁肽粗肽，收率为103.61％，纯度为74.79％，HPLC图谱如图1所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表2所示。
表2 利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
Figure PCTCN2020114185-appb-000007
Figure PCTCN2020114185-appb-000008
实施例2
采用单体Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH制备利拉鲁肽
取10.0g CTC树脂(0.90mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.34g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 1.16g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.36mmol/g；
取替代值为0.36mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂4.17g，加入至固相合成反应 柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH氨基酸偶联结束采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde基团，树脂用DMF洗涤6次，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂10.93g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入甲基叔丁基醚沉淀，再用甲基叔丁基醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.56g利拉鲁肽粗肽，收率为98.81％，纯度为73.52％，HPLC图谱与图1相似。
实施例3
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.48mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 3.57g、HOBt 1.78g和DMAP 0.15g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 2.27g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应6.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.23mmol/g；
取替代值为0.23mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂6.52g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂14.27g，加入体积比为TFA：EDT：PHOH：水＝92.5：2.5：2.5:2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.09g利拉鲁肽粗肽，收率为108.23％，纯度为81.05％，HPLC图谱如图2所示。特征峰相对保留时间与峰面积结果如表3所示。
表3 利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
Figure PCTCN2020114185-appb-000009
Figure PCTCN2020114185-appb-000010
Figure PCTCN2020114185-appb-000011
实施例4
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OSU、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OSU制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.80mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 2.38g、HOBt 1.19g和DMAP 0.20g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.51g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.28mmol/g；
取替代值为0.28mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂5.36g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HOBt  1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.04g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH偶联。
肽树脂采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OSU 7.83g溶解在100mL DMF中，加入DIEA 2.5ml混合均匀，将氨基酸溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH偶联。
肽树脂采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp 4.74g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 2.5ml混合均匀，将氨基酸溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，树脂用DMF洗涤3次。
肽树脂采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OSU 6.07g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 2.5ml混合均匀，将氨基酸溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，树脂用DMF洗涤3，甲醇洗涤3次。
取所得利拉鲁肽树脂13.18g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色 粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.78g利拉鲁肽粗肽，收率为102.72％，纯度为79.36％，HPLC图谱与图2相似。
实施例5
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Dde-Thr(tBu)-Phe-OH、Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.80mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 2.38g、HOBt 1.19g和DMAP 0.20g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.51g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.28mmol/g；
取替代值为0.28mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂5.36g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-5h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Dde-Thr(tBu)-Phe-OH偶联，Dde-Thr(tBu)-Phe-OH氨基酸偶联结束采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde基团，树脂用DMF洗涤6次，按照利拉鲁肽肽序完成 Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH的偶联。采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde基团。
取所得利拉鲁肽树脂14.21g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.27g利拉鲁肽粗肽，收率为111.43％，纯度为77.54％，HPLC图谱与图2相似。
实施例6
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.40mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.46g、HOBt 2.03g和DMAP 0.73g溶解在100mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.15mmol/g；
取替代值为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂10.00g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH的偶联，偶联结束采用20％DBLK脱除Fmoc保护。
取所得利拉鲁肽树脂17.62g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.37g利拉鲁肽粗肽，收率为113.21％，纯度为77.40％，HPLC图谱如图3所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表4所示。
表4 利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
Figure PCTCN2020114185-appb-000012
Figure PCTCN2020114185-appb-000013
Figure PCTCN2020114185-appb-000014
实施例7
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取10.0g CTC树脂(0.90mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.34g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 1.16g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应1.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.24mmol/g；
取替代值为0.24mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂6.25g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂13.14g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入甲基叔丁基醚沉淀，再用甲基叔丁基醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.47g利拉鲁肽粗肽，收率为97.21％，纯度为69.18％，HPLC图谱如图4所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表5所示。
表5 利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
Figure PCTCN2020114185-appb-000015
Figure PCTCN2020114185-appb-000016
实施例8
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.80mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.76g、HOBt 2.38g和DMAP 0.20g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 3.03g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应5.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.35mmol/g；
取替代值为0.35mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂4.29g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、PyBOP 4.29g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的偶联。氨基酸偶联结束，树脂采用20％DBLK脱保护，用DCM、甲醇洗涤干燥。
取所得利拉鲁肽树脂12.73g，加入体积比为TFA：EDT：水＝95：5：5的混合酸解液，搅拌均匀，30℃搅拌反应3-5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.14g利拉鲁肽粗肽，收率为109.12％，纯度为70.49％，HPLC图谱如 图5所示，特征峰相对保留时间与峰面积结果如表6所示。
表6 利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
Figure PCTCN2020114185-appb-000017
Figure PCTCN2020114185-appb-000018
实施例9
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取20.0g CTC树脂(0.60mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 3.56g溶解在100mL DMF中，加入DIEA 4.65g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应1.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.27mmol/g；
取替代值为0.27mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂5.55g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g和HOAt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.52g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Dde-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的偶联。
取所得利拉鲁肽树脂12.97g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，35±3℃搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入乙醚沉淀，再用乙醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到5.47g利拉鲁肽粗肽，收率为97.21％，纯度为71.53％，HPLC图谱与图5相似。
实施例10
采用单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH制备利拉鲁肽
取10.0g Wang树脂(0.30mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.45g、HOBt 2.04g和DMAP 0.18g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 2.00g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应24.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端3.0h，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.27mmol/g；
取替代值为0.27mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂5.55g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮 检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、PyBOP 4.29g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Dde-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的偶联。氨基酸偶联结束，树脂采用2.0％水合肼/DMF脱除Dde，用DCM、甲醇洗涤干燥。
取所得利拉鲁肽树脂13.64g，加入体积比为TFA：EDT：水＝95：5：5的混合酸解液，搅拌均匀，30℃搅拌反应3-5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂用TFA洗涤1次，合并滤液，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到6.03g利拉鲁肽粗肽，收率为107.16％，纯度为70.96％，HPLC图谱与图5相似。
对比例1
取10.0g Wang树脂(0.40mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 4.46g、HOBt 2.03g和DMAP 0.73g溶解在100mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-Wang树脂采用醋酐/DIEA封端过夜，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-Wang树脂，检测替代度为0.19mmol/g；
取替代值为0.17mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂7.89g，加入至反应容器，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-Wang树脂30min后采用 20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIC 1.46g活化5分钟，将活化后的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
向上述固相反应柱中加入100mL 2.0％水合肼的DMF溶液，氮气搅拌反应1.0h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性；
将Fmoc-Glu-OtBu6.38g、HOBt 2.03g和PyBOP7.81g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次；
将棕榈酸3.84g、HOBt2.03g和PyBOP7.81g溶解在50mL DCM/DMF＝1：1溶液中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤6次；
取所得利拉鲁肽树脂14.27g，加入体积比为TFA：Tis：水＝90：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应5小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到4.71g利拉鲁肽粗肽，收率为83.71％，纯度为61.57％。HPLC图谱如图6所示，特征峰相对时间与峰面积结果如表7所示。
表7 对比例1的利拉鲁肽粗肽的特征峰相对保留时间与峰面积结果
Figure PCTCN2020114185-appb-000019
Figure PCTCN2020114185-appb-000020
对比例2
取10.0g CTC树脂(0.90mmol/g)装入固相反应柱中，DMF洗涤两次，DMF溶胀30分钟；
将Fmoc-Gly-OH 1.34g溶解在50mL DMF中，加入DIEA 1.16g至氨基酸溶液中混合均匀，将氨基酸溶液加至上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4.0h，Fmoc-Gly-CTC树脂采用甲醇/DIEA封端，树脂用DMF、DCM洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.32mmol/g；
取替代值为0.32mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂4.69g，加入至固相合成反应柱中，用DMF洗涤树脂两次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30min后采用20％DBLK脱保护，用DMF洗涤树脂6次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Arg(pbf)-OH 4.87g、HBTU 2.84g和HOBt 1.01g溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIEA 1.94g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，以茚三酮检测呈阴性为反应结束，重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照利拉鲁肽肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
向上述固相反应柱中加入100mL DCM和3.24g苯硅烷，氮气搅拌10分钟后加入0.87g四(三苯基膦)钯，反应3.0h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性；
将Fmoc-Glu-OtBu(6.38g，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)和PyBOP (7.81g，15mmol)溶解在50mL DMF中，冰浴条件下加入DIPEA(1.94g，15mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次；
将棕榈酸3.84g、HOBt2.03g和PyBOP 7.81g溶解在50mL DCM/DMF＝4：1溶液中，冰浴条件下加入DIEA1.94g活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤6次；
取所得利拉鲁肽树脂11.67g，加入体积比为TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的混合酸解液(用量10mL/克利拉鲁肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应1小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入甲基叔丁基醚沉淀，再用甲基叔丁基醚洗涤沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重。
得到4.42g利拉鲁肽粗肽，收率为78.56％，纯度为63.52％，HPLC图谱与图6相似。
实施例12
利拉鲁肽粗肽纯化
分别将实施例1～11、对比例1～2的1.0g利拉鲁肽粗肽，加入160mL纯化水、40mL乙腈超声溶解，滴加加三乙胺至完全溶清，制成5mg/mL的粗肽溶液，经0.45μm有机滤膜过滤。
将过滤后的粗肽溶液，经色谱柱的规格为30*250mm，内装10μm的C8键合硅胶填料纯化。以50mM氯化铵pH8.5为流动相A，乙腈混合溶液作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度由50％A+50％B(V/V)变为40％A+60％B(V/V)，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰并分析纯度，得到中间体1。
将上述收集主峰，以0.1％HCOOH为流动相A，乙腈混合溶液作为流动相B，洗脱流速为25mL/min，梯度洗脱洗脱方式为：60min内，梯度由67％A+33％B(V/V)变为37％A+63％B(V/V)，采集图谱，观察吸收值的变化，收集主峰馏份并分析纯度，后将馏份进行冷冻干燥即得利拉鲁肽精肽。
实施例1纯化后的HPLC图谱如图7所示，其特征峰相对保留时间与峰面积如表8所示。实施例2～11纯化后的HPLC图谱与图7相似。对比例1纯化后的 HPLC图谱如图8所示，其特征峰相对保留时间与峰面积如表9所示。对比例1纯化后的HPLC图谱与图8相似。纯化后的利拉鲁肽精肽纯度、总收率结果如表10所示。
表8 利拉鲁肽精肽特征峰相对保留时间与峰面积
Figure PCTCN2020114185-appb-000021
表9 利拉鲁肽精肽特征峰相对保留时间与峰面积
Figure PCTCN2020114185-appb-000022
表10 利拉鲁肽精肽纯度、总收率结果
Figure PCTCN2020114185-appb-000023
Figure PCTCN2020114185-appb-000024

Claims (29)

  1. 一种制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，通过固相合成得到利拉鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到利拉鲁肽粗肽，纯化、冻干后得到利拉鲁肽精肽，其中18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，其结构如下：
    Figure PCTCN2020114185-appb-100001
    R1是氢或氨基保护基团，
    R2是酯保护基团，
    R3是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其中R1是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt或Dmb保护基。
  3. 根据权利要求1所述的方法，其中R2是叔丁基、甲基、乙基、苄基或烯丙基。
  4. 根据权利要求1所述的方法，其中R3是羟基、OBt、OSU、OPfp。
  5. 根据权利要求1所述的方法，其中R1是Fmoc，R2是叔丁基，R3是羟基。
  6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括1～4位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6，其结构为：
    Figure PCTCN2020114185-appb-100002
    R4是氢或氨基保护基团，
    R5是酯保护基团，
    R6是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团，
    R7是氢或氨基保护基团。
    R8是H、Hmb、Dmb、Tmob保护基。
  7. 根据权利要求6所述的方法，R4是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt 或Mtt保护基。
  8. 根据权利要求6所述的方法，R5是tBu、Bzl。
  9. 根据权利要求6所述的方法，R6是羟基、OBt、OSU、OPfp。
  10. 根据权利要求6所述的方法，R7是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
  11. 根据权利要求6所述的方法，R4是Trt，R5是tBu，R6是羟基，R7是Fmoc，R8是H。
  12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括5～6位采用的是单体R9-Thr(R10)-Phe-R11，其结构为：
    Figure PCTCN2020114185-appb-100003
    R9是氢或氨基保护基团
    R10是氢或羟基保护基团
    R11是羟基、氯、OBt、OSU或OPfp基团。
  13. 根据权利要求12所述的方法，R9是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
  14. 根据权利要求12所述的方法，R10是tBu或Bzl。
  15. 根据权利要求12所述的方法，R11是羟基、OBt、OSU、OPfp。
  16. 根据权利要求12所述的方法，R9是Fmoc，R10是tBu，R11是羟基。
  17. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11,其结构为：
    Figure PCTCN2020114185-appb-100004
    R4，R5，R7，R8如权利要求6所定义；R10，R11如权利要求12所定义。
  18. 根据权利要求17所述的方法，R4是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
  19. 根据权利要求17所述的方法，R5是tBu、Bzl。
  20. 根据权利要求17所述的方法，R7是Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt保护基。
  21. 根据权利要求17所述的方法，R8是H、Hmb、Dmb、Tmob保护基。
  22. 根据权利要求17所述的方法，R10是tBu或Bzl。
  23. 根据权利要求17所述的方法，R11是羟基、OBt、OSU、OPfp。
  24. 根据权利要求17所述的方法，R4是Trt，R5是tBu，R7是Fmoc、R10是tBu、R11是羟基，R8是H。
  25. 根据权利要求1，6，12任一项所述的方法，18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，1～4位采用的是单体R7-His(R4)-Ala-Glu(OR5)-(R8)-Gly-R6，5～6位采用的是单体R9-Thr(R10)-Phe-R11。
  26. 根据权利要求25所述的方法，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～4位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
  27. 根据权利要求25所述的方法，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～4位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Hmb-Gly，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
  28. 根据权利要求1，17任一项所述的方法，18～20位采用的是单体R1-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OR2)-R3，1～6位采用的是单体R7-His(R4)-Ala- Glu(OR5)-(R8)-Gly-Thr(R10)-Phe-R11。
  29. 根据权利要求28所述的方法，18～20位采用的是单体Fmoc-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，1～6位采用的是单体Fmoc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。
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