CN113748125A - 胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备胰高血糖素样肽‑1(glp‑1)受体激动剂及其类似物的方法。本发明还涉及用于制备利拉鲁肽、D‑利拉鲁肽、索马鲁肽和D‑索马鲁肽的方法。本发明具体涉及用于制备胰高血糖素样肽‑1(glp‑1)激动剂及其类似物的方法，其中生产的利拉鲁肽、D‑利拉鲁肽、索马鲁肽和D‑索马鲁肽基本上是纯的。本发明也涉及通过固相和液相方法制备胰高血糖素样肽‑1(glp‑1)激动剂及其类似物。
Description
技术领域
本发明涉及药物。具体而言，本发明涉及制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂、其类似物及其药学上可接受的盐的方法。更具体而言，本发明涉及制备包括利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽在内的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的方法。本发明具体涉及制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物的方法，其中生产的利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽基本上是纯的。本发明也涉及通过固相和液相方法制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物。
背景技术
背景描述包括可能有助于理解本发明的信息。并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)由肠道产生，并以葡萄糖依赖的方式刺激胰岛素分泌，同时抑制胰高血糖素分泌，减少食欲和能量摄入，延迟胃排空。该类药物还被证明可促进体重减轻和降低SBP，这可能有益于2型糖尿病患者，胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RAs)作为一种新的治疗分类于2005年上市，临床用于治疗2型糖尿病(T2DM)。自2005年以来，市场上已经有六种批准的产品，最新的产品是索马鲁肽。GLP-1R激动剂索马鲁肽最近被注册用于治疗2型糖尿病。与人类GLP-1(Aib(8),Arg(34))相比，索马鲁肽具有两个氨基酸取代，在26位赖氨酸处衍生。
由式(I)表示的利拉鲁肽是人类GLP-1的类似物，并用作GLP-1受体激动剂。据提示，其可治疗2型糖尿病患者以改进血糖控制。利拉鲁肽的肽前体通常通过包括在酿酒酵母中表达重组DNA的过程产生，并且已通过在34位用精氨酸取代赖氨酸而被工程化为与天然人类GLP-1具有97％的同源性。
已经报道了利拉鲁肽和索马鲁肽的不同制备工艺。US7572884公开了一种通过重组技术然后酰化和移除N-末端延伸来制备利拉鲁肽的方法。WO2017162650公开了另一种制备利拉鲁肽的方法，该方法包括通过将利拉鲁肽或前体肽与包含二异丙基醚和乙腈的抗溶剂混合来沉淀利拉鲁肽或前体肽。WO2014199397公开了一种通过利用Wang树脂的固相合成来获得利拉鲁肽的方法。这类工艺受到一个或多个限制，如具有非常大的特异性、在工业层面实施非常复杂、最终产品的纯度特性和产量不令人满意或商业上不可行。
尽管已知GLP1受体激动剂的制备有多种合成工艺，但仍需探索可扩大且经济可行的新合成方案。更具体而言，仍然需求能够克服与已知技术相关的一个或多个缺陷的合成方案，使得本发明的合成方案可适应作为适于制备不同的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物(包括利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽)的通用方案，特别是具有改进的纯度特性且适用于工业规模。
发明目的
本公开的一个目的是提供用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物、其药学上可接受的盐及其制剂的方法，其可满足现有需要并可克服本领域现有技术中发现的一个或更多个缺陷。
本公开的一个目的是提供用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物的方法，其可作为经济上可行的方案。
本公开的一个目的是提供用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物的方法，其可作为工业上可扩展的方案。
本公开的一个目的是提供用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及类似物(基本上是纯的)的方法。
本公开的另一个目的是提供一种用于制备利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽的化学合成方法。
发明内容
本公开涉及用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂、其类似物和药学上可接受的盐的方法。
在一个方面中，本公开涉及制备基本上纯的(glp-1)受体激动剂或其类似物，所述类似物选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在另一个方面中，本公开涉及通过固相方法制备(glp-1)受体激动剂或其类似物，所述类似物选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在另一个方面中，本公开涉及通过液相方法制备(glp-1)受体激动剂或其类似物，所述类似物选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在又一个方面中，本公开涉及采用FMOC策略，通过固相或液相方法制备(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，所述类似物选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在又一个方面中，本公开涉及通过重复二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH合成的(glp-1)受体激动剂或其类似物的制备方法，所述类似物选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在一个方面中，本公开提供一种用于制备(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，所述方法包括：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上，对其进行封端，和；
b)使经锚定的片段进行顺序偶联的多个循环；
其中，
多个循环包括：
-选择性脱保护氨基基团并在偶联剂的存在下使另一个二肽片段的C-末端偶联至经锚定且脱保护的片段的N-末端，
-选择性脱保护氨基基团并在偶联剂的存在下使所得片段偶联至下一个N-保护的氨基酸的C-末端，
-重复所述偶联步骤以获得所需线性胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或其类似物的氨基酸序列，所述序列包括
所需线性胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂类似物的氨基酸序列；
c)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与长链脂肪酸偶联；以及从所述树脂上切下所述肽以获得所需的线性粗胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂；和
d)任选地纯化所述粗胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于制备利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的二肽片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段的N-末端；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有利拉鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后使步骤(f)的肽片段与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与棕榈酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗利拉鲁肽；
i)任选地纯化所述粗利拉鲁肽。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于制备利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护步骤(a)的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得线性粗利拉鲁肽的氨基酸序列；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后使步骤(c)的肽片段与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与棕榈酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗利拉鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗利拉鲁肽。
在又一个方面中，本公开提供一种用于制备D-利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的二肽片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有D-利拉鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的所述肽的N-末端与棕榈酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-利拉鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗D-利拉鲁肽。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于制备D-利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得线性粗D-利拉鲁肽的安激素序列；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与棕榈酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-利拉鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗D-利拉鲁肽。
在一个方面中，本公开提供一种用于制备索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有索马鲁肽的相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗索马鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗索马鲁肽。
在一个方面中，本公开提供一种用于制备索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH，二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH，二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得具有索马鲁肽的氨基酸序列的线性粗肽；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗索马鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗索马鲁肽。
在一个方面中，本公开提供一种用于制备D-索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有D-索马鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-索马鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗D-索马鲁肽。
在一个方面中，本公开提供一种用于制备D-索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得线性粗D-索马鲁肽的氨基酸序列；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-索马鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗D-索马鲁肽。
在另一个方面中，本公开提供一种用于制备二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的方法，所述方法包括以下步骤：
e)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
f)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
g)在偶联剂的存在下使甘氨酸烷基酯偶联至步骤(b)的片段；
h)从所述树脂上切下步骤(c)中获得的二肽片段；
i)任选地纯化所述粗二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于制备二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使甘氨酸烷基酯偶联至步骤(b)的片段；
d)从所述树脂上切下步骤(c)中获得的二肽片段；
e)任选地纯化所述粗二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
通过以下对优选实施方式的详细描述，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并包括在说明书内以进一步说明本公开的各个方面。通过参考附图并结合本文呈现的特定实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开。
图1是描绘利拉鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案1中所示的步骤。
图2是描绘利拉鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案2中所示的步骤。
图3是描绘D-利拉鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案3中所示的步骤。
图4是描绘D-利拉鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案4中所示的步骤。
图5是描绘索马鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案5中所示的步骤。
图6是描绘索马鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案6中所示的步骤。
图7是描绘D-索马鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案7中所示的步骤。
图8是描绘D-索马鲁肽制备方案的流程图，该方案包括根据一个示例性实施方式的方案8中所示的步骤。
具体实施方式
以下是本发明实施方式的详细描述。这些实施方式如此详细以致清楚地传达本公开。然而，所提供的细节的量并非旨在限制实施方式的预期变化；相反，其意图是涵盖属于所附权利要求所定义的本公开的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。
本文中的所有出版物均以引用的方式并入，其程度与每个单独出版物或专利申请明确且单独地表明以引用的方式并入的程度相同。如果并入的引用文件中的术语的定义或使用与本文提供该术语的定义不一致或相反，则本文提供该术语的定义适用，而引用文件中该术语的定义不适用。
在本说明书全文中对“一个实施方式”或“实施方式”的引用意味着结合该实施方式描述的特定特点、结构或特征包括在至少一个实施方式中。因此，在本说明书的各个地方出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不一定都指同一实施方式。此外，在一个或多个实施方式中，可以以任何合适的方式组合特定特点、结构或特征。
在一些实施方式中，用于描述和保护本发明的某些实施方式的表示组分的量、性质(例如浓度、反应条件等)的数字应理解为在某些情况下由术语“约”修改。因此，在一些实施方式中，在书面描述和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方式寻求获得的期望特性而变化。在一些实施方式中，数值参数应根据报告的有效数字和应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本公开的一些实施方式的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值尽可能精确地报告。本公开的一些实施方式中呈现的数值可能包含必然来自于在其各自的测试测量中确立的标准偏差的某些误差。
如在本文的描述中以及随后的权利要求中所使用的，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数引用，除非上下文另有明确规定。此外，如在本文的描述中使用的，“在…中”的含义包括“在…中”和“在…上”，除非上下文另有明确规定。
除非上下文另有要求，在随后的整个说明书中，“包含”一词及其变体，例如，“包含”和“包括”应以开放、包容的含义解释为“包括但不限于”。
本文中数值范围的叙述仅旨在用作单独引用落入范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另有说明，每个单独的值都被并入到说明书中，就好像在本文中单独叙述一样。除非本文另有说明或是上下文明显矛盾，本文所述的所有方法均可按任何适当顺序执行。关于本文中的某些实施方式提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明对本发明的实践至关重要的任何未要求保护的要素。
本文公开的本发明的替代要素或实施方式的分组不应解释为限制。各组成员可单独或以与组的其他成员或本文中确立的其他要素的任何组合一起被提及和保护。出于方便和/或专利性的原因，可以将组的一个或多个成员可包含在组中或从中删除。当出现任何此类包含或删除时，本说明书在此被视为包含已修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
下面的描述以及其中描述的实施方式是通过说明本公开的原理和方面的特定实施方式的一个或多个示例来提供的。提供这些示例的目的是为了解释而非限制那些原理和本公开。
还应当理解，本公开可以以多种方式实施，包括作为系统、方法或装置。在本说明书中，这些实施或本发明可采取的任何其他形式可称为方法。一般来说，在本发明的范围内，可以改变所公开的方法的步骤的顺序。
本文提供的本发明的标题和摘要仅为方便起见，并不解释实施方式的范围或含义。
以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施方式。尽管每个实施方式表示发明要素的单个组合，但本发明主题被认为包括所公开要素的所有可能组合。因此，如果一个实施方式包括要素A、B和C，且第二实施方式包括要素B和D，则本发明主题还被认为包括A、B、C或D的其他剩余组合，即使未明确公开。
本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文定义，则其应被给予相关领域中的人员在提交时给出的该术语的最广泛定义，如印刷出版物和发布的专利中所反映的。
本公开涉及用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂、其类似物及其药学上可接受的盐的方法。
在一个实施方式中，本公开涉及一种用于制备基本上纯的形式的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的方法，所述类似物选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
由式(I)表示的利拉鲁肽是人类GLP-1的类似物，并用作GLP-1受体激动剂。表明用它来治疗2型糖尿病患者以改进血糖控制。利拉鲁肽的肽前体通常通过包括在酿酒酵母中表达重组DNA的过程产生，并且已通过在34位用精氨酸取代赖氨酸而被设计为与天然人类GLP-1具有97％的同源性。利拉鲁肽是通过将C-16脂肪酸(棕榈酸)与谷氨酸间隔基连接在肽前体26位的剩余赖氨酸残基上而制备的。
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-棕榈酰基)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
式(I)
D-利拉鲁肽是由式(II)表示的利拉鲁肽的类似物，用作GLP-1受体激动剂。它是通过用D-丙氨酸替换天然利拉鲁肽2位的氨基酸制备的。
H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-棕榈酰基)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
式(II)
由式(III)表示的索马鲁肽是人类GLP-1的类似物，并用作GLP-1受体激动剂。索马鲁肽的序列具有包含31个氨基酸的主链。PEG、谷氨酸和氧代十八烷酸脂肪族链将在26位接枝到Lys，非天然氨基酸氨基异丁酸位于其8位。索马鲁肽的氨基酸序列为：
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-18氧代十八烷酰基)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
式(III)
由式(IV)表示的D-索马鲁肽是索马鲁肽的类似物，并用作GLP-1受体激动剂。这是通过用D-丙氨酸替换天然索马鲁肽2位的氨基酸制备的。
H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-18氧代十八烷酰基)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
式(IV)
在一个实施方式中，本公开涉及一种通过固相和液相方法制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)激动剂，所述激动剂选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在一个实施方式中，本公开涉及一种通过采用FMOC策略的固相或液相方法制备(glp-1)受体激动剂的方法，所述激动剂选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在又一个实施方式中，本公开涉及一种通过重复二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH合成的(glp-1)受体激动剂或其类似物的制备方法，所述类似物选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
在一个实施方式中，本公开提供一种用于制备(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上，对其进行封端，和；
b)使经锚定的片段进行顺序偶联的多个循环；
其中，
多个循环包括：
-选择性脱保护氨基基团并在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的C-末端偶联至经锚定且脱保护的片段的N-末端，
-选择性脱保护氨基基团并在偶联剂的存在下使所得片段偶联至下一个N-保护的氨基酸的C-末端，
-重复所述偶联步骤以获得所需线性胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或其类似物的氨基酸序列，所述序列包括
所需线性胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或类似物的氨基酸序列；
c)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与长链脂肪酸偶联；以及从所述树脂上切下所述肽以获得所需的线性粗胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂；和
d)任选地纯化所述粗胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂。
在另一个实施方式中，本公开涉及一种用于制备利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的二肽片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段的N-末端；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有利拉鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后使步骤(f)的肽片段与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与棕榈酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗利拉鲁肽；
i)任选地纯化所述粗利拉鲁肽。
在另一个方面中，本公开涉及一种用于制备利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
g)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
h)选择性脱保护步骤(a)的片段的氨基基团；
i)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得线性粗利拉鲁肽；
j)移除赖氨酸侧链保护基，然后使步骤(c)的肽片段与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与棕榈酸偶联；
k)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗利拉鲁肽；和
l)任选地纯化所述粗利拉鲁肽。
在又一个实施方式中，本公开提供了一种用于制备D-利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的二肽片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有D-利拉鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的N-末端肽与棕榈酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-利拉鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗D-利拉鲁肽。
在另一个实施方式中，本公开涉及一种用于制备D-利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得线性粗D-利拉鲁肽；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的所述肽的N-末端与棕榈酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-利拉鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗D-利拉鲁肽。
在一个实施方式中，本公开提供一种用于制备索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有索马鲁肽序列的相应氨基酸的肽序列；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗索马鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗索马鲁肽。
在一个实施方式中，本公开提供一种一种用于制备索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得具有索马鲁肽的氨基酸序列的线性粗肽；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗索马鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗索马鲁肽。
在一个实施方式中，本公开提供一种用于制备D-索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有D-索马鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-索马鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗D-索马鲁肽。
在一个实施方式中，本公开提供一种用于制备D-索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)进行以下顺序偶联：片段二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得线性粗D-索马鲁肽的氨基酸序列；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-索马鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗D-索马鲁肽。
在另一个实施方式中，本公开提供一种用于制备二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使甘氨酸烷基酯偶联至步骤(b)的片段；
d)从所述树脂上切下步骤(c)中获得的二肽片段；
e)任选地纯化所述粗二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。
在另一个实施方式中，本公开涉及一种用于制备二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使甘氨酸烷基酯偶联至步骤(b)的片段；
d)从所述树脂上切下步骤(c)中获得的二肽片段；
e)任选地纯化所述粗二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
在一个实施方式中，氨基基团的脱保护通过精氨酸进行。
在一个实施方式中，固相是树脂。
在一个实施方式中，树脂选自但不限于2-氯三苯甲基氯(2-CTC)、Sasrin、entaGelS、TentaGel TGA、Rink、Wang、AmphiSpheres和其他适宜的树脂。
在一个实施方式中，封端是使用选自但不限于N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、甲醇、乙酸酐及其组合的封端剂进行的。
在一个实施方式中，偶联剂选自但不限于1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三唑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、苯并三唑-l-基-氧基-三(二甲氨基)-鏻六氟磷酸盐(BOP)和O-(7-氮杂苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)及其组合。
在一个实施方式中，用于偶联反应的溶剂选自DMF、吡啶、乙酸酐、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯乙烷、1,4-二氧六环、2-甲基四氢呋喃、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙酸乙酯、乙腈、丙酮等及其组合。
在一个实施方式中，通过液相方法合成了一个或多个重复的二肽片段，如Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
在一个实施方式中，氨基基团可以通过本领域已知的方法选择性地脱保护，例如在适当的溶剂(诸如DMF)中使用哌啶、DBU和二氯甲烷的混合物。
在一个实施方式中，所形成的肽可使用选自但不限于二氟乙酸、三氟乙酸等的化学品从树脂上切下。
在一个实施方式中，选自利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽的GLP-1类似物的纯化过程可通过本领域已知的方法执行。纯化方法可从选自但不限于制备型反相HPLC、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱法等。
在一个实施方式中，本公开提供一种用于纯化前述权利要求任一项的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，所述方法包括：
a)使用包含碳酸氢铵和乙腈的pH为8.5至9.5的流动相对所述粗GLP1受体激动剂或其类似物进行第一次HPLC纯化；
b)收集并合并来自步骤(a)的汇集部分，并使用包含三氟乙酸和乙腈的洗脱流动相以30％B至45％B的线性梯度进行第二次HPLC纯化；
c)使用包含氢氧化铵、乙腈、乙酸铵和纯化水的流动相，对步骤(b)中由第二次HPLC纯化获得的部分进行第三次HPLC纯化；
d)浓缩步骤(c)中由第三次HPLC纯化获得的部分并进行冷冻干燥，以提供纯化的glp-1受体激动剂或其类似物。
在一个实施方式中，使用选自Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的两个二肽片段有助于减少相应的内源甘氨酸杂质。
在另一个实施方式中，本公开涉及利拉鲁肽的制备方法，其包括如方案1所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及利拉鲁肽的制备方法，其包括如方案2所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及D-利拉鲁肽的制备方法，其包括如方案3所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及D-利拉鲁肽的制备方法，其包括如方案4所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及索马鲁肽的制备方法，其包括如方案5所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及索马鲁肽的制备方法，其包括如方案6所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及D-索马鲁肽的制备方法，其包括如方案7所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及D-索马鲁肽的制备方法，其包括如方案8所示的步骤。
在另一个实施方式中，本公开涉及胰高血糖素样肽-1(glp-1)激动剂或其类似物的制备方法，其中两个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的使用有助于减少相应的糖苷内切杂质(Endo-Gly impurities)。
在另一个实施方式中，本公开也提供用于纯化胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，所述方法包括：
a)使用包含碳酸氢铵和乙腈的pH为8.5至9.5的流动相对所述粗GLP1受体激动剂或其类似物进行第一次HPLC纯化；
b)收集并合并来自步骤(a)的汇集部分，并使用包含三氟乙酸和乙腈的洗脱流动相以30％B至45％B的线性梯度进行第二次HPLC纯化；
c)使用包含氢氧化铵、乙腈、乙酸铵和纯化水的流动相，对步骤(b)中由第二次HPLC纯化获得的部分进行第三次HPLC纯化；
d)浓缩步骤(c)中由第三次HPLC纯化获得的部分并进行冷冻干燥，以提供纯化的glp-1受体激动剂或其类似物。
本公开提供了用于提供具有实质纯度的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，此类方法可在工业水平上扩展。
尽管前文描述了本公开的各种实施方式，但是可以在不脱离本公开基本范围的情况下设计本公开的其他和进一步实施方式。本发明的范围由以下权利要求确定。本发明不限于所描述的实施方式、版本或示例，包括这些实施方式、版本或示例是为了使本领域普通技术人员能够在结合本领域普通技术人员可用的信息和知识时制造和使用本发明。
实施例
本发明通过以下实施例的形式做进一步说明。然而，应当理解，以下实施例仅是说明性的，不应视为对本发明范围的限制。
缩写：
Boc : 叔丁氧基羰基
DCM : 二氯甲烷
DIC : N,N′-二异丙基碳二亚胺
DIPEA : 二异丙基乙胺
DMF : 二甲基甲酰胺
DODT : 2,2′-(乙二基双氧代)双乙硫醇
Fmoc : 9-芴甲氧羰基
HBTU : 苯并三唑四甲基脲六氟磷酸盐
HOBt : N-羟基苯并三唑
HPLC : 高效液相色谱法
MTBE : 甲基叔丁基醚
OBt : O-苯并三唑
OtBu : 叔丁基酯
tBu : 叔丁基
TFA : 三氟乙酸
Trt : 三苯甲基
2-CTC : 2-氯三苯甲基氯
HCl : 盐酸
NaHCO3 : 碳酸氢钠
Na2SO4 : 硫酸钠
TLC : 薄层色谱法
LiOH : 氢氧化锂
mL : 毫升
g : 克
℃ : 摄氏度
h : 小时
min : 分钟
IPA : 异丙醇
vol : 体积
RT : 室温
Mmol : 毫摩尔
w/v : 重量/体积
TIPS : 三异丙基硅烷
A° : 埃
HPLC : 高效液相色谱法
实施例1
合成利拉鲁肽
步骤1：制备片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH(1)
向溶解于100mL DMF中的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1a)(20mmol，12.96g)、HBTU(30mmol，11.38g)和HOBT(30mmol，4.6g)的混合物中，添加DIPEA(40mmol，7.0mL)。于室温搅拌混合物5分钟后，添加甘氨酸甲酯盐酸盐或甘氨酸乙酯盐酸盐(1b)(40mmol，5.6g)。反应再搅拌2至3小时。通过TLC监测反应进程。然后，通过添加60mL水使反应猝灭并用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用0.5N HCl水溶液、5％NaHCO3水溶液、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并使用快速柱色谱纯化，以得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OMe或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OEt(1c)(12.5g，86％)。
于0℃向Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OMe或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OEt(1c)(12.5g)在THF-水(4:1)(200mL)的溶液中，用10分钟的时间以小部分添加LiOH·H2O(1.58g，38mmol)在40mL水中的溶液。于0℃再搅拌40分钟后，通过添加2.5％(重量/体积)的柠檬酸溶液将反应混合物调节至pH为3至4，并使用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并使用快速柱色谱纯化，以得到片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH(1)，为白色固体(8.5g，71％)。
步骤2：制备片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH(2)
向溶解在100mL DMF的Fmoc-Glu(OtBu)-OH(2a)(20mmol，8.5g)、HBTU(30mmol，11.38g)和HOBt(30mmol，4.6g)的混合物中，添加DIPEA(40mmol，7.0mL)。于室温搅拌混合物5分钟后，添加HCl.Gly-OMe或HCl.Gly-OEt(1b)(40mmol，5.6g)。反应再搅拌2至3小时。通过TLC监测反应进程。然后，通过添加60mL水使反应猝灭并用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用0.5N HCl水溶液、5％NaHCO3水溶液、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并使用快速柱色谱纯化，以得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OMe或Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OEt(2b)(8.0g，89％)。
于0℃向Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OMe或Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OEt(2b)(8.0g)在THF-水(4:1)(200mL)的溶液中，用10分钟的时间小部分添加LiOH·H2O(1.58g，38mmol)在40mL水中的溶液。于0℃再搅拌40分钟后，通过添加2.5％(重量/体积)的柠檬酸溶液将反应混合物调节至pH为3至4，并使用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并使用快速柱色谱纯化，以得到Fmoc-Glu(tBu)-Gly-OH(2)(5.6g，70％)。
步骤3：在树脂上锚定片段(1)
将树脂(50g，取代＝1.0mmol/g树脂)装入肽合成瓶中，并用二氯甲烷(500mL，10体积)洗涤两次。在不搅拌的条件下将树脂悬浮在二氯甲烷(DCM)(500mL，10vol)中30分钟。在树脂中添加Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH(1)(2.0当量)、DIPEA(3.0当量)和DMF(500mL，10体积)的澄清混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌2.0小时。然后排空反应物并用DMF(3x10体积)和DCM(3x10体积)洗涤树脂。在树脂中添加10％DIPEA在甲醇中的混合物。悬浮液搅拌30分钟并排空。树脂用DMF(5x10体积)洗涤。得到Fmoc树脂片段(3)。
步骤4：制备脱保护片段(4)
在Fmoc树脂片段(3)中添加20％哌啶在DMF lot-1(10体积)中的澄清混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌10分钟。排空溶剂，在树脂中添加20％哌啶在DMF lot-2(10体积)中的澄清混合物。在25℃至30℃搅拌悬浮液10分钟。将溶剂排空，树脂用DMF(2x10体积)和IPA(1x10体积)以及DMF(2x10体积)洗涤。Kaiser颜色试验证实Fmoc脱保护的完成，获得了经脱保护的片段(4)。
步骤5：制备片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-CTC(5)
使Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH(1)(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物偶联至经脱保护的片段(4)。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌2小时。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
步骤6：顺序偶联其他Fmoc保护的氨基酸(6)
将Fmoc-保护的氨基酸[Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH](2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物添加至树脂中。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在45℃至55℃温和搅拌20至45分钟。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
对于上述所有氨基酸片段脱保护，遵循与步骤4相同的Fmoc脱保护过程。
步骤7：制备N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-1-亚基)乙基](Dde)脱保护的树脂片段(7)
在树脂片段(6)中添加3％水合肼在DMF lot-1(10体积)中的澄清混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌10分钟。将溶剂排空，树脂中添加3％水合肼在DMF lot-2(10体积)中的澄清混合物。在25℃至30℃搅拌悬浮液10分钟。将溶剂排空，树脂用DMF(2x10体积)和IPA(1x10体积)以及DMF(2x10体积)洗涤。Kaiser颜色试验证实Dde脱保护的完成。
步骤8：偶联Fmoc-Glu-OtBu和棕榈酸
步骤(8a)：偶联Fmoc-Glu-OtBu
将Fmoc-Glu-OtBu(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物添加至树脂中。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在45℃至55℃温和搅拌30分钟。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
步骤(8b)：Fmoc-脱保护
在树脂中添加20％哌啶在DMF lot-1(10体积)中的澄清混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌10分钟。排空溶剂，在树脂中添加20％哌啶在DMFlot-2(10体积)中的澄清混合物。在25℃至30℃搅拌悬浮液10分钟。将溶剂排空，树脂用DMF(2x10体积)和IPA(1x10体积)以及DMF(2x10体积)洗涤。Kaiser颜色试验证实Fmoc脱保护的完成。
步骤(8c)：偶联棕榈酸
将棕榈酸(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物添加至树脂中。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在45℃至55℃温和搅拌30分钟。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
步骤9：制备粗利拉鲁肽(9)
将2-CTC树脂结合的经保护片段(8)装入肽合成瓶中。在不搅拌的条件下将树脂悬浮在二氯甲烷(DCM)(10vol)中10分钟。在树脂中添加TFA:TIPS:DODT:水(8.5:0.5:0.5:0.5体积)的混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌3.0小时。树脂通过烧结漏斗过滤。将滤液添加到0℃至10℃的MTBE预冷混合物中。添加完成后，在0℃至35℃搅拌反应混合物1.0小时以沉淀灰白色固体。然后通过Buckner漏斗过滤沉淀固体，并用MTBE洗涤。然后在35℃至40℃的真空烘箱中干燥该抽干的固体，直至恒重。
步骤10：纯化粗利拉鲁肽
步骤(10a)：纯化-1
将全局脱保护后获得的3.6g粗D-利拉鲁肽(9)溶解在300mL缓冲液A中，使用约0.5mL氢氧化铵溶液将pH调节为8.5至9.5，并按照以下参数进行纯化：
i)柱规格：250x50mm SS
ii)介质规格：C-18(第三代)，10μ，100A°或C-18(第三代)，10μ，120A°
iii)流动相A：0.01M碳酸氢铵，流动相B：乙腈，
iv)材料洗脱的梯度程序：30B％至45％B流率：50ml/min至120ml/min(150cm/Hr线性流率至360cm/Hr线性流率)
v)汇集标准：汇集具有的UPLC纯度≥85％和单个最大杂质≤3％的部分用于纯化2。
vi)汇集具有的UPLC纯度≤85％且≥60％的部分用于进一步纯化。
步骤(10b)：纯化-2
用等量纯化水进一步稀释来自纯化-1的肽含量为900mg的汇集部分，并按照以下参数进行进一步纯化：
i)柱规格：250x50mm SS
ii)介质规格：C-18(第三代)，10μ，100A°或C-18(第三代)，10μ，120A
iii)流动相A：水中0.1％TFA，流动相B：乙腈，
iv)材料洗脱的梯度程序：30B％至45％B，流率：50ml/min至120ml/min(150cm/Hr线性流率至360cm/Hr线性流率)
v)汇集标准：汇集具有的HPLC纯度≥96％和单个最大杂质≤0.5％的部分用于纯化3。
vi)汇集具有的UPLC纯度≤96％且≥85％的部分用于进一步纯化。
步骤(10c)：纯化-3
用等量纯化水进一步稀释来自纯化-2的肽含量为1200mg的汇集部分，并按照以下参数进行再纯化：
i)柱规格：250x50mm SS
ii)介质规格：C-18(第三代)，10μ，100A°或C-18(第三代)，10μ，120A
iii)流动相A：水中0.05M碳酸氢铵，流动相B：乙腈，流动相C：水中3％乙酸铵，流动相D：纯水
iv)材料洗脱的梯度程序：20B％至35％B，流率：50ml/min至120ml/min(150cm/Hr线性流率至360cm/Hr线性流率)
v)汇集标准：汇集具有的HPLC纯度≥98％和单个最大杂质≤0.3％的部分用于浓缩。
vi)再纯化后汇集HPLC纯度≤98％且≥96％的部分。
vii)将来自纯化-3的汇集部分浓缩并进行冷冻干燥，以获得纯利拉鲁肽(I)，为灰白色至白色粉末。
viii)所得利拉鲁肽的HPLC纯度不低于99.0％，分离收率在9％至12％之间。
实施例2
合成D-利拉鲁肽
按以下过程合成D-利拉鲁肽。
步骤1至步骤10：遵循与实施例1中所述用于合成利拉鲁肽的相同过程制备D-利拉鲁肽，不同之处在于步骤-6中使用的片段Fmoc-Ala-OH替换为Fmoc-D-Ala-OH。
实施例3
合成索马鲁肽
按以下过程合成索马鲁肽。
步骤1至步骤7：使用实施例1中所述用于合成利拉鲁肽的过程制备片段1至8。
步骤8：偶联Fmoc-PEG2-CH2-COOH、Fmoc-PEG2-CH2-COOH、Fmoc-Glu-OtBu和18-tBu-18-氧代十八烷酸
按照以下方案逐步进行偶联：
步骤(8a)：偶联Fmoc-PEG2-CH2-COOH
将Fmoc-PEG2-CH2-COOH(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物添加至树脂中。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在45℃至55℃温和搅拌30分钟。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
步骤(8b)：Fmoc-脱保护
在树脂中添加20％哌啶在DMF lot-1(10体积)中的澄清混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌10分钟。排空溶剂，在树脂中添加20％哌啶在DMFlot-2(10体积)中的澄清混合物。在25℃至30℃搅拌悬浮液10分钟。将溶剂排空，树脂用DMF(2x10体积)和IPA(1x10体积)以及DMF(2x10体积)洗涤。Kaiser颜色试验证实Fmoc脱保护的完成。
步骤(8c)：偶联Fmoc-PEG2-CH2-COOH
将Fmoc-PEG2-CH2-COOH(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物添加至树脂中。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在45℃至55℃温和搅拌30分钟。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
步骤(8d)：Fmoc-脱保护
在树脂中添加20％哌啶在DMF lot-1(10体积)中的澄清混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌10分钟。排空溶剂，在树脂中添加20％哌啶在DMFlot-2(10体积)中的澄清混合物。在25℃至30℃搅拌悬浮液10分钟。将溶剂排空，树脂用DMF(2x10体积)和IPA(1x10体积)以及DMF(2x10体积)洗涤。Kaiser颜色试验证实Fmoc脱保护的完成。
步骤(8e)：偶联Fmoc-Glu-OtBu
将Fmoc-Glu-OtBu(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物添加至树脂中。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在45℃至55℃温和搅拌30分钟。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
步骤(8f)：Fmoc-脱保护
在树脂中添加20％哌啶在DMF lot-1(10体积)中的澄清混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌10分钟。排空溶剂，在树脂中添加20％哌啶在DMFlot-2(10体积)中的澄清混合物。在25℃至30℃搅拌悬浮液10分钟。将溶剂排空，树脂用DMF(2x10体积)和IPA(1x10体积)以及DMF(2x10体积)洗涤。Kaiser颜色试验证实Fmoc脱保护的完成。
步骤(8g)：偶联18-tBu-18-氧代十八烷酸
将18-tBu-18-氧代十八烷酸(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)在DMF(10体积)中的澄清混合物添加至树脂中。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在45℃至55℃温和搅拌30分钟。通过Kaiser颜色试验监测反应进程。反应完成后，将反应溶剂排空，树脂用DMF(4x10体积)洗涤。
步骤9：制备粗索马鲁肽(9)
将2-CTC树脂结合的经保护片段(8)装入肽合成瓶中。在不搅拌的条件下将树脂悬浮在二氯甲烷(DCM)(10vol)中10分钟。在树脂中添加TFA:TIPS:DODT:水(8.5:0.5:0.5:0.5体积)的混合物。在氮气鼓泡下轻轻搅拌悬浮液，并在25℃至30℃温和搅拌3.0小时。树脂通过烧结漏斗过滤。将滤液添加到0℃至10℃的MTBE预冷混合物中。添加完成后，在0℃至35℃搅拌反应混合物1.0小时以沉淀灰白色固体索马鲁肽。然后通过Buckner漏斗过滤沉淀固体，并用MTBE洗涤。然后在35℃至40℃的真空烘箱中干燥该抽干的固体，直至恒重。
实施例4
合成D-索马鲁肽
按照以下过程合成索马鲁肽。
步骤1至步骤10：遵循与实施例3中所述用于合成索马鲁肽的相同过程制备D-索马鲁肽，不同之处在于步骤-6中使用的片段Fmoc-Ala-OH替换为Fmoc-D-Ala-OH。
上述实施例仅是说明性的，不应视为对本发明范围的限制。对所公开实施方式的各种改变和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。可以在不脱离本发明范围的情况下进行这样的改变和修改。
本发明的有利效果
本公开提供了适于制备不同胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物的合成方案，所述类似物包括利拉鲁肽、D-利拉鲁肽、索马鲁肽和D-索马鲁肽。
本公开提供了用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物的方法，其可为经济上可行的方案。
本公开提供了用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及其类似物的方法，其可为工业上可扩展的方案。
本公开提供了用于制备基本上纯的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及类似物的方法。
本公开提供了用于制备胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂及类似物的方法，其中两个二肽片段，即Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的使用有助于减少相应的糖苷内切杂质。
Claims (14)
1.一种用于制备(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上，并对其进行封端，和；
b)使经锚定的片段进行顺序偶联的多个循环；
其中，
多个循环包括：
c)选择性脱保护氨基基团，并在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的C-末端偶联至该经锚定且脱保护的片段的N-末端，
-选择性脱保护氨基基团，并在偶联剂的存在下使所得片段偶联至下一个N-保护的氨基酸的C-末端，
-重复所述偶联步骤以获得所需线性胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或其类似物的氨基酸序列，所述序列包括
所需线性胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或类似物的氨基酸序列；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu长链脂肪酸偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的肽的N-末端与长链脂肪酸偶联；以及从所述树脂上切下所述肽以获得所需的线性粗胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂；和
e)任选地纯化所述粗胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂。
2.一种用于制备利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的二肽片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段的N-末端；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有利拉鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后使步骤(f)的肽片段与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的N-末端肽与棕榈酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗利拉鲁肽；
i)任选地纯化所述粗利拉鲁肽。
3.一种用于制备利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护步骤(a)的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得线性粗利拉鲁肽；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后使步骤(c)的肽片段与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至树脂的N-末端肽与棕榈酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗利拉鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗利拉鲁肽。
4.一种用于制备D-利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的二肽片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有D-利拉鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的所述肽的N-末端与棕榈酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-利拉鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗D-利拉鲁肽。
5.一种用于制备D-利拉鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下顺序偶联选自片段二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH的氨基酸片段以获得线性粗D-利拉鲁肽氨基酸序列；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并使连接至所述树脂的所述肽的N-末端与棕榈酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-利拉鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗D-利拉鲁肽。
6.一种用于制备索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有索马鲁肽序列的相应氨基酸的肽序列；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗索马鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗索马鲁肽。
7.一种用于制备索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
j)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
k)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
l)在偶联剂的存在下进行以下顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得具有索马鲁肽的氨基酸序列的线性粗肽；
m)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
n)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗索马鲁肽；和
o)任选地纯化所述粗索马鲁肽。
8.一种用于制备D-索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使另一个二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的羧基末端偶联至步骤(b)的片段；
d)选择性脱保护步骤(c)的片段的氨基基团；
e)在偶联剂的存在下使下一个N-保护的氨基酸的羧基末端偶联至步骤(d)的片段；
f)重复步骤d)和e)以形成具有D-索马鲁肽相应氨基酸序列的肽；
g)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
h)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-索马鲁肽；和
i)任选地纯化所述粗D-索马鲁肽。
9.一种用于制备D-索马鲁肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)进行以下片段的顺序偶联：二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH；二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH偶联至氨基酸片段Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH，以获得具有D-索马鲁肽氨基酸序列的线性粗肽；
d)移除赖氨酸侧链保护基，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列，Fmoc-Glu-OtBu偶联，之后进行Fmoc脱保护，并与氧代十八烷酸偶联；
e)从所述树脂上切下所述肽以获得线性粗D-索马鲁肽；和
f)任选地纯化所述粗D-索马鲁肽。
10.一种用于制备二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使甘氨酸烷基酯偶联至步骤(b)的片段；
d)从所述树脂上切下步骤(c)中获得的二肽片段；
e)任选地纯化所述粗二肽片段Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。
11.一种用于制备二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH锚定到树脂上并对其进行封端；
b)选择性脱保护经锚定的片段的氨基基团；
c)在偶联剂的存在下使甘氨酸烷基酯偶联至步骤(b)的片段；
d)从所述树脂上切下步骤(c)中获得的二肽片段；
e)任选地纯化所述粗二肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
12.如前述权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述偶联剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三唑四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、苯并三唑-l-基-氧基-三(二甲氨基)-鏻六氟磷酸盐(BOP)和O-(7-氮杂苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)。
13.如前述权利要求1至11中任一项所述的方法，其中用于偶联反应的溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶、乙酸酐、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯乙烷、1,4-二氧六环、2-甲基四氢呋喃、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙酸乙酯、乙腈和丙酮。
14.一种用于纯化前述权利要求任一项的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或其类似物的方法，所述方法包括：
a)使用包含碳酸氢铵和乙腈的pH为8.5至9.5的流动相对所述粗GLP1受体激动剂或其类似物进行第一次HPLC纯化；
b)收集并合并来自步骤(a)的汇集部分，并使用包含三氟乙酸和乙腈的洗脱流动相以30％B至45％B的线性梯度进行第二次HPLC纯化；
c)使用包含氢氧化铵、乙腈、乙酸铵和纯化水的流动相，对由步骤(b)中第二次HPLC纯化获得的部分进行第三次HPLC纯化；
d)浓缩由步骤(c)中第三次HPLC纯化获得的部分并进行冷冻干燥，以提供纯化的glp-1受体激动剂或其类似物。
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