CN109180801A - 一种合成索玛鲁肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明采用固相化学的方法制备索玛鲁肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。该方法首次采用Fmoc‑Lys(N‑ε‑ADO‑ADO‑(γ‑Glu(N‑α‑X)‑OtBu)‑OH参与固相合成索玛鲁肽(其中谷氨酸α氨基保护基X为Alloc、Mmt、Mtt、Dde或ivDde),然后脱掉保护基，在固相上脂肪酸化；同时针对索玛鲁肽工艺产生的缺1个Ala杂质肽；接18位和19位时采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH,避免这一纯化过程中难以除去杂质的生成；为避免产生±Gly的工艺杂质，引入Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH和Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly–OH两个二肽作为单体参与合成；通过引入这四个个片段肽参与索玛鲁肽的固相合成，提高了粗肽纯度，降低了纯化难度，降低了生产成本。

Description

一种合成索玛鲁肽的方法
技术领域
本发明属多肽合成领域，特别涉及一种固相制备索玛鲁肽的方法。
技术背景
索玛鲁肽(Semeglutide)，商品名Ozempic，由丹麦诺和诺德公司研发，于2017年12月05日在美国上市，现正在中国进行临床试验，很快将进入中国市场。Ozempic被指定为饮食和运动的辅助手段，以改善2型糖尿病患者的血糖控制。
索玛鲁肽也是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有94％的序列同源性，是诺和诺德开发的第二代脂肪链修饰GLP-1类似物，与第一代脂肪链修饰GLP-1类似物利拉鲁肽相比，其半衰期更长，剂量更低。索玛鲁肽保持了利拉鲁肽良好的安全性和降糖有效性，且减轻体重效果优于前两者。
利拉鲁肽为脂肪酸链修饰技术的第一代GLP-1类似物，修饰位点为26位赖氨酸：采用了γ谷氨酸连接子，16碳脂肪酸链，序列34位突变为精氨酸(同源性97％)。索玛鲁肽在此基础上进行了系统优化，修饰位点仍为26位赖氨酸：采用谷氨酸-2PEG为连接子，18碳二羧酸脂肪酸链，序列上34位突变为赖氨酸，8位丙氨酸突变为非天然氨基酸Aib，避免被DPP-IV酶切失活。
索玛鲁肽化学表述为Aib8,Arg34Lys26-[N-ε-ODA-ODA-(γ-Glu(N-α-18-十八烷酸-1-酰基))]-GLP-1(7-37)分子式为C187H291N45O59，相对分子质量为4113.58，CAS号为910463-68-2，序列信息如下：
目前，诺和诺德公司主要通过基因重组技术，利用酵母生产索玛鲁肽主链Arg34-GLP-19-37，然后连接上His-Aib；但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34-GLP-19-37，还需要利用化学手段和His-Aib反应，生成索玛鲁肽主链Aib8,Arg34-GLP-17-37；然后在Lys26的侧链氨基上接上长效修饰基团。由于Aib8,Arg34-GLP-17-37的侧链及N端氨基均未保护，存在多个活性位点，所以此过程会产生较多杂质，损失较大。
现有技术中，提供了合成索玛鲁肽(Semeglutide)的Fmoc化学固相合成方法。US8129343和US8536122中采用Mmt、Mtt、ivDde和Dde保护Lys26的侧链氨基，在主链完成偶联后，再脱掉侧链保护基，顺序偶联侧链长效修饰基团；CN106928344采用Alloc保护Lys26的侧链氨基，在主链完成偶联后，再利用Pd(PPh3)4脱掉保护基，顺序偶联侧链长效修饰基团；而CN106478806则采用Dde-Lys(Fmoc)-OH为合成单体，先顺序偶联完成Lys26的侧链长效修饰基团，然后再脱掉Lys26的α氨基保护基Dde，完成主链的偶联；在上述合成方法中均存在侧链修饰步骤繁多，工艺复杂，粗品的纯化难度较大等困难。
专利CN108059666则采用Alloc-Lys(Fmoc)-OH为合成单体，以CTC树脂为固相载体，用固相法合成得到单体Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-OH,然后再作为单体固相合成得到索玛鲁肽，此办法单体的合成费用较高，导致总体合成难度增加，生产成本高。
本发明人用现有的合成方法，制备索玛鲁肽，发现纯度和收率均不高，不适于工业规模生产。为此，本发明人对索玛鲁肽的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种索玛鲁肽的固相合成方法。本发明降低了合成难度，提高了粗肽纯度，从而降低了纯化难度，提高了收率，降低了生产成本，有利于规模化工业生产。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种固相制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用Wang树脂或CTC树脂为固相载体，用Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH与之偶联反应制备Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂，再按序列依次偶联连接保护氨基酸，得到侧链全保护的索玛鲁肽(未脂肪酸化)肽树脂：
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
(b)采用脱保护试剂脱掉20位Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu侧链谷氨酸α氨基保护基X；
(c)通过固相合成法，在谷氨酸α氨基偶联十八烷二酸(Octadecanedioic Acid),得到侧链保护的索玛鲁肽肽树脂：
Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-OctadecanedioicAcid)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
(d)索玛鲁肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得索玛鲁肽精肽。
优选的，步骤(a)的具体操作步骤为：所述固相载体为替代度为0.1-0.6mmol/g的Wang树脂或CTC树脂；所述Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂脱除Fmoc保护后，以2-5倍的投料比加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点，反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护的利拉鲁肽(未脂肪酸化)肽树脂：Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。更进一步优选的，步骤(a)中，所述制备的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂替代度为0.1-0.6mmol/g，优选0.1-0.3mmol/g；所述脱保护试剂优选为20％哌啶的DMF溶液(体积比)；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
优选的，所述步骤(a)中，偶联Lys(N-ε-ODA-ODA-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)所采用的单体为Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-OH；其中谷氨酸α氨基保护基X为Alloc、Mmt、Mtt、Dde或ivDde中的一种；步骤(a)中所述接7位His和8位Aib，采用保护氨基酸单体是Boc-His(Trt)-Aib-OH；步骤(a)中所述接9位Glu和10位Gly，采用保护氨基酸单体是Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH，同法接21位Glu和22位Gly；步骤(a)中所述接24位Ala和25位Ala所采用保护氨基酸是Fmoc-Ala-Ala-OH；步骤(a)中所述接34位Arg和35位Gly,采用保护氨基酸单体是Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。
优选的，所述步骤(b)中，若谷氨酸α氨基保护基X为Alloc，则脱除保护基Alloc的试剂采用0.1-0.4倍合成规模用量的Pd(PPh3)4和10-30倍合成规模用量的苯基硅烷(或吗啡啉),在固相条件下脱除10-90分钟；若谷氨酸α氨基保护基X为Mmt或Mtt，则脱除保护基Mmt或Mtt的试剂为1％TFA/5％TIS/DCM；若谷氨酸α氨基保护基X为ivDde或Dde，则脱除保护基ivDde或Dde的试剂为水合肼的DMF溶液，水合肼溶液用量为3-4倍树脂体积，水合肼溶液体积配比为水合肼/DMF＝1/15-20。
优选的，所述步骤(c)中,所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
优选的，所述步骤(d)中,裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种；更为优选的裂解试剂配比为：TFA/苯甲硫醚/水/TIS＝90/2.5/5.0/2.5。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明首次采用单体Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-OH(其中谷氨酸α氨基保护基X为Alloc、Mmt、Mtt、Dde或ivDde中的一种)、Boc-His(Trt)-Aib-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH参与固相合成利拉鲁肽，简化了固相合成索玛鲁肽的步骤，提高了粗肽纯度和收率，简化了纯化过程，降低了生产成本。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CTC树脂 2-氯三苯甲基氯树脂
Wang Resins 王树脂
tBu 叔丁基
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
Trt 三苯甲基
Mmt 4-甲氧基三苯基
Mtt 甲基三苯甲基
Alloc (2-丙烯氧基)羰基
ivDde (4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基
Dde 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧化环已亚基)乙基
ADO 8-氨基-3,6-二氧杂辛酸
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
TIS 三异丙基硅烷
实施例1：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resins的合成
将载体Wang树脂500.0g(sub＝0.42mmol/g)置于合成柱中，用2400mL DMF洗涤两次，加入2400mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH/DIC/HOBT的混合DCM溶液[称取282.4g(400mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH和64.8g(480mmol)HOBT置于氨基酸活化瓶，加入2000mL体积比例为1∶1的DMF和DCM混合溶液搅拌溶解，低温(0℃)下加入76.4ml(480mmol)DIC,活化5分钟，反应10min后加入4.8g(4mmol)DMAP；反应2h，抽掉反应液，用2400mL DMF洗涤两次，加入封端试剂2400mL(480ml乙酸酐和408ml吡啶溶解于1512mLDMF中)反应2h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤2次，真空干燥后得Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resins 609.9g；取样测替代度为0.26mmol/g。
实施例2：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resins的合成
称取CTC树脂50.0g(sub＝0.40mmol/g)置于合成柱中，用240mL DMF洗涤两次,加入240mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有14.10g(20mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的DCM/DMF(3/1,体积比)溶液150ml，搅拌后加入DIPEA 6.6ml(40mmol)，鼓N2反应60min，抽掉反应液，加入DCM/CH3OH/DIPEA(体积比17：2：1)混合溶液300ml封端3次，每次10min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥得Fmoc-Gly-CTC Resins 62.06g。测替代度为0.29mmol/g.
实施例3：索玛鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例1替代度为0.26mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resins69.23g(合成规模18mmol)置于合成柱中，加入1000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，800mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液1000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH25.41g(36mmol)、HOBT5.35g(39.6mmol)和DIC 6.3ml(39.6mmol)的DMF溶液500ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-ivDde)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到侧链未脂肪酸化的索玛鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO(γ-Glu(N-α-ivDde)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang resins；
脱侧链保护基：分别加入1000ml水合肼/DMF(1/15)混合溶液处理上述树脂3次，每次脱保护时间为5min；脱保护后，用1000ml DMF洗涤树脂6次，取样进行Kaiser试剂检测，树脂显蓝色。
脂肪酸化：称取16.96g(54mmol)1,18-octadecanedioic acid和8.02g(59.4mmol)HOBT于溶解瓶中，加入500mlDMF溶解，待完全溶解后放入冰水浴下静置10min,加入9.2ml(59.4mmol)DIC,混合均匀后，冰水浴下活化10min；将活化后溶液加入上述反应柱中，均匀搅拌反应；Kaiser试剂检测反应进程，树脂检测无色后，终止偶联反应；肽树脂制备完后，用1000ml DMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂162.6g。
实施例4：利拉鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例1替代度为0.26mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resins69.23g(合成规模18mmol)置于合成柱中，加入1000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，800mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液1000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH25.41g(36mmol)、HOBT5.35g(39.6mmol)和DIC 6.3ml(39.6mmol)的DMF溶液500ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-Alloc)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到侧链未脂肪酸化的索玛鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO(γ-Glu(N-α-Alloc)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang resins；
脱侧链保护基：上述肽树脂分别加入1000ml DCM洗涤4次，然后加入1000ml DCM,均匀搅拌树脂下缓慢加入27ml苯基硅烷，反应3min后，加入5.64g Pd(PPh3)4,室温下反应50min，抽干反应液，水合肼/DMF(1/15)混合溶液处理上述树脂3次，每次脱保护时间为5min；脱保护后，1000ml DCM洗涤6次；取样进行Kaiser试剂检测，树脂显蓝色。
脂肪酸化：称取16.96g(54mmol)1,18-octadecanedioic acid和8.02g(59.4mmol)HOBT于溶解瓶中，加入500mlDMF溶解，待完全溶解后放入冰水浴下静置10min,加入9.2ml(59.4mmol)DIC,混合均匀后，冰水浴下活化10min；将活化后溶液加入上述反应柱中，均匀搅拌反应；Kaiser试剂检测反应进程，树脂检测无色后，终止偶联反应；肽树脂制备完后，用1000ml DMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂163.2g。
实施例5：利拉鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例1替代度为0.26mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resins69.23g(合成规模18mmol)置于合成柱中，加入1000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，800mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液1000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH25.41g(36mmol)、HOBT5.35g(39.6mmol)和DIC 6.3ml(39.6mmol)的DMF溶液500ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-Mmt)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到侧链未脂肪酸化的索玛鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO(γ-Glu(N-α-Mmt)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang resins；
脱侧链保护基：上述肽树脂分别加入1000ml DCM洗涤4次，然后加入1000ml TFA/TIS/DCM(5/5/90)混合溶液处理上述树脂3次,每次20min；脱保护后，1000ml DCM洗涤6次；取样进行Kaiser试剂检测，树脂显蓝色。
脂肪酸化：称取16.96g(54mmol)1,18-octadecanedioic acid和8.02g(59.4mmol)HOBT于溶解瓶中，加入500mlDMF溶解，待完全溶解后放入冰水浴下静置10min,加入9.2ml(59.4mmol)DIC,混合均匀后，冰水浴下活化10min；将活化后溶液加入上述反应柱中，均匀搅拌反应；Kaiser试剂检测反应进程，树脂检测无色后，终止偶联反应；肽树脂制备完后，用1000ml DMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂160.6g。
实施例6：利拉鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例1替代度为0.25mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resins69.23g(合成规模18mmol)置于合成柱中，加入1000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，800mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液1000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH25.41g(36mmol)、HOBT5.35g(39.6mmol)和DIC 6.3ml(39.6mmol)的DMF溶液500ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-Mtt)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到侧链未脂肪酸化的索玛鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO(γ-Glu(N-α-Mtt)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang resins；
脱侧链保护基：上述肽树脂分别加入1000ml DCM洗涤4次，然后加入1000ml TFA/TIS/DCM(5/5/90)混合溶液处理上述树脂3次,每次20min；脱保护后，1000ml DCM洗涤6次；取样进行Kaiser试剂检测，树脂显蓝色。
脂肪酸化：称取16.96g(54mmol)1,18-octadecanedioic acid和8.02g(59.4mmol)HOBT于溶解瓶中，加入500mlDMF溶解，待完全溶解后放入冰水浴下静置10min,加入9.2ml(59.4mmol)DIC,混合均匀后，冰水浴下活化10min；将活化后溶液加入上述反应柱中，均匀搅拌反应；Kaiser试剂检测反应进程，树脂检测无色后，终止偶联反应；肽树脂制备完后，用1000ml DMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂161.8g。
实施例7：利拉鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例1替代度为0.26mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resins69.23g(合成规模18mmol)置于合成柱中，加入1000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，800mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液1000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH25.41g(36mmol)、HOBT5.35g(39.6mmol)和DIC 6.3ml(39.6mmol)的DMF溶液500ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-Dde)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到侧链未脂肪酸化的索玛鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO(γ-Glu(N-α-Dde)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang resins；
脱侧链保护基：分别加入1000ml水合肼/DMF(1/15)混合溶液处理上述树脂3次，每次脱保护时间为5min；脱保护后，用500ml DMF洗涤树脂6次，取样进行Kaiser试剂检测，树脂显蓝色。
脂肪酸化：称取16.96g(54mmol)1,18-octadecanedioic acid和8.02g(59.4mmol)HOBT于溶解瓶中，加入500mlDMF溶解，待完全溶解后放入冰水浴下静置10min,加入9.2ml(59.4mmol)DIC,混合均匀后，冰水浴下活化10min；将活化后溶液加入上述反应柱中，均匀搅拌反应；Kaiser试剂检测反应进程，树脂检测无色后，终止偶联反应；肽树脂制备完后，用1000ml DMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂161.8g。
实施例8：准确称取实施例1替代度为0.29mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTCResins 62.02g(合成规模18mmol)置于合成柱中，加入600ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，600ml DMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH 25.41g(36mmol)、HOBT5.35g(39.6mmol)和DIC 6.3ml(39.6mmol)的DMF溶液500ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-Dde)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到侧链未脂肪酸化的索玛鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO(γ-Glu(N-α-Dde)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang resins；
脱侧链保护基：分别加入1000ml水合肼/DMF(1/15)混合溶液处理上述树脂3次，每次脱保护时间为5min；脱保护后，用1000ml DMF洗涤树脂6次，取样进行Kaiser试剂检测，树脂显蓝色。
脂肪酸化：称取16.96g(54mmol)1,18-octadecanedioic acid和8.02g(59.4mmol)HOBT于溶解瓶中，加入500mlDMF溶解，待完全溶解后放入冰水浴下静置10min,加入9.2ml(59.4mmol)DIC,混合均匀后，冰水浴下活化10min；将活化后溶液加入上述反应柱中，均匀搅拌反应；Kaiser试剂检测反应进程，树脂检测无色后，终止偶联反应；肽树脂制备完后，用1000ml DMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂156.8g。
实施例9：索玛鲁肽肽树脂的裂解
将实施例3得到的索玛鲁肽肽树脂，加入到冷冻的1600ml裂解液(体积配比为TFA/TIS/H20＝95/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1000ml,倒入10L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽72.5g,粗肽收率97.7％，纯度71.6％。
实施例10：索玛鲁肽肽树脂的裂解
将实施例4得到的索玛鲁肽肽树脂，加入到冷冻的1600ml裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20＝92.5/2.5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1000ml,倒入10L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽71.8g,粗肽收率96.8％，纯度70.2％。
实施例11：索玛鲁肽肽树脂的裂解
将实施例5得到的索玛鲁肽肽树脂，加入到冷冻的1800ml裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/EDT/H20＝90/2.5/2.5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1000ml,倒入10L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽72.6g,粗肽收率97.8％，纯度70.8％。
实施例12：索玛鲁肽肽树脂的裂解
将实施例6得到的索玛鲁肽肽树脂，加入到冷冻的1600ml裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20＝90/2.5/2.5/5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1000ml,倒入10L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽71.3g,粗肽收率96.1％，纯度69.8％。
实施例13：索玛鲁肽肽树脂的裂解
将实施例7得到的索玛鲁肽肽树脂，加入到冷冻的1600ml裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20＝90/2.5/2.5/5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，50mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至500ml,倒入5L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽73.4g,粗肽收率98.9％，纯度72.3％。
实施例14：索玛鲁肽肽树脂的裂解
将实施例8得到的索玛鲁肽肽树脂，加入到冷冻的1600ml裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20＝90/2.5/2.5/5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，50mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至500ml,倒入5L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽63.4g,粗肽收率85.4％，纯度72.6％。
实施例15：索玛鲁肽粗肽的纯化
将实施例9所得粗肽50.0g用200ml醋酸溶解,待完全溶解后，加水稀释至4000ml；溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mm C18制备柱，流动相为0.1％醋酸/水-0.1％醋酸/乙腈体系，上样量为25g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽23.9g，总收率46.7％，纯度99.1％以上，单杂均小于0.1％.
实施例16：索玛鲁肽粗肽的纯化
将实施例10所得粗肽50.0g用200ml醋酸溶解,待完全溶解后，加水稀释至4000ml；溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mm C8制备柱，流动相为0.1％醋酸/水-0.1％醋酸/乙腈体系，上样量为25g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽24.6g，总收率47.6％，纯度99.0％以上，单杂均小于0.1％。

Claims (9)

1.一种固相化学制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用Wang树脂或CTC树脂为固相载体，用Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH与之偶联反应制备Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂，再按序列依次偶联连接保护氨基酸，得到侧链全保护的索玛鲁肽(未脂肪酸化)肽树脂：
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
(b)采用脱保护试剂脱掉20位Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu侧链谷氨酸α氨基保护基X；
(c)通过固相合成法，在谷氨酸α氨基偶联十八烷二酸(OctadecanedioicAcid),得到侧链保护的索玛鲁肽肽树脂：
Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-OctadecanedioicAcid)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
(d)索玛鲁肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得索玛鲁肽精肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(a)中所述固相载体Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂或Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂的替代度为0.1-0.4mmol/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(a)中所述接20位赖氨酸所采用保护氨基酸为Fmoc-Lys(N-ε-ADO-ADO-(γ-Glu(N-α-X)-OtBu)-OH，其中谷氨酸α氨基保护基X为Alloc、Mmt、Mtt、Dde或ivDde中的一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(a)中所述接7位His和8位Aib，采用保护氨基酸单体是Boc-His(Trt)-Aib-OH；步骤(a)中所述接24位Ala和25位Ala所采用保护氨基酸单体是Fmoc-Ala-Ala-OH；骤(a)中所述接9位Glu和10位Gly，采用保护氨基酸单体是Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH，同法接21位Glu和22位Gly；步骤(a)中所述接34位Arg和35位Gly,采用保护氨基酸单体是Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(b)中所述：若谷氨酸α氨基保护基X为Alloc，则脱除保护基Alloc的试剂采用0.1-0.4倍合成规模用量的Pd(PPh3)4和10-30倍合成规模用量的苯基硅烷或吗啡啉，在固相条件下脱除10-90分钟。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(b)中所述：若谷氨酸α氨基保护基为Mmt或Mtt，则脱除保护基Mmt或Mtt的试剂为1％TFA/5％TIS/DCM。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(b)中所述：若谷氨酸α氨基保护基X为Dde或ivDde，则脱除保护基Dde或ivDde的试剂为水合肼的DMF溶液，水合肼溶液用量为3-4倍树脂体积，水合肼溶液体积配比为水合肼/DMF＝1/15-20。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(d)中裂解试剂为加入1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种。
9.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：
步骤(d)中所述裂解试剂配比为TFA/苯甲硫醚/水/TIS＝90/2.5/5.0/2.5。
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