CN111944038A - 一种索玛鲁肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种索玛鲁肽的合成方法，该方法包括：分别合成索玛鲁肽全保护S1‑S2片段、S3‑S6片段，用于合成索玛鲁肽树脂，并经裂解、纯化得到索玛鲁肽。选用Fmoc‑Lys(Dde)‑OH时，大大降低了合成索玛鲁肽粗品的成本。选用S19‑S20多肽片段或S18‑S20多肽片段接入主链，有利于完成索玛鲁肽主链的偶联，大大提高了索玛鲁肽粗品的纯度和收率，降低合成成本。采用二肽加四肽片段偶联的策略大大降低了D‑His消旋杂质、+Gly杂质、D‑Thr杂质、D‑Phe杂质的产生，极大的降低了产品纯化的难度，提高了收率，具有广泛的应用前景。

Description

一种索玛鲁肽的合成方法
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，特别涉及一种索玛鲁肽的固相合成方法。
技术背景
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由人肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌，具有降低血糖浓度的功效，被用于II型糖尿病的治疗。然而天然GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解。
索玛鲁肽，英文名称为Semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，用于治疗II型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年12月获得FDA批准上市。索玛鲁肽的Lys侧链经PEG、Glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时N端第2位的Ala突变为Aib后，有效的避免了被DPP-IV酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次，目前该药物的口服剂型也正在研制当中。索玛鲁肽的CAS号为910463-68-2，分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.64g/mol，肽序列为：
H-1His-2Aib-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH。
目前已报道的索玛鲁肽的制备方法大致分为两类：一类是把含有侧链的Lys作为片段直接接入索玛鲁肽主链完成合成，专利CN104356224A公开了一种采用液相法在Lys的ε-N H2上接上侧链，随后在树脂上逐步缩合氨基酸制备索玛鲁肽的方法。另一类是分别逐个完成索玛鲁肽主链和侧链的偶联，专利CN 201511027176公开了在固相逐步合成索玛鲁肽直链肽，合成侧链修饰基团，脱去Lys的保护基，并偶联侧链修饰基团，最终裂解得到该多肽产物。由于索玛鲁肽的序列较长且有较多的疏水氨基酸，采用氨基酸逐步缩合的方法合成时，易形成折叠，导致树脂收缩严重，延长反应时间，进而粗肽中产生较多与产品性质极为接近的杂质，如D-His的消旋杂质：
H-D-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
+Gly杂质：
H-His-Aib-Glu-Gly-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
D-Thr的消旋杂质：
H-His-Aib-Glu-Gly-D-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
D-Phe的消旋杂质：
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-D-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG-PEG)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；D-His消旋杂质与索玛鲁肽目标肽的理化性质相近，极大增加了索玛鲁肽产品的分离纯化难度，导致产品收率大大降低。因此，迫切需要一种纯度和收率高，成本低的索玛鲁肽的合成方法。
发明内容
为了解决现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，不利于工业化生产的问题，本发明提供了一种收率高、纯度高的索玛鲁肽的合成方法。采用二肽加四肽片段的策略减少D-His消旋杂质、+Gly杂质、D-Phe杂质的的产生，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种索玛鲁肽的合成方法，分别合成索玛鲁肽全保护S1-S2片段和S3-S6片段，用于索玛鲁肽树脂，并经裂解、纯化得到索玛鲁肽。
需要指出的是，在本申请文件中，S1为索玛鲁肽肽序中N端第一位的氨基酸，同理S2、S3、S4、S5、S6、S18、S19、S20分别为N端第2、3、4、5、6、18、19、20位氨基酸。
优选地，所述的全保护S1-S2片段为R1-His(R2)-Aib-OH，全保护S3-S6片段为R3-Glu(R4)-Gly-Thr(R5)-Phe-OH。其中R1选自：Boc或Fmoc；R2选自：Trt或Boc；R3选自Fmoc；R4选自OtBu；R5选自tBu。
作为更优选方案，全保护S1-S2片段为Boc-His(Trt)-Aib-OH，全保护S3-S6片段为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。
采用全保护S1-S2的二肽片段Boc-His(Trt)-Aib-OH能有效减少D-His消旋杂质的产生；采用全保护S3-S6的四肽Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH片段能有效减少+Gly、D-Thr、D-Phe杂质的产生。
优选地，索玛鲁肽的合成采用Fmoc-Lys(Dde)-OH为原料。其中，脱除Fmoc-Lys(Dde)-OH侧链Dde保护基的方法选用盐酸羟胺和咪唑混合的DMF溶液、NH2NH2的DMF溶液。
优先采用盐酸羟胺和咪唑混合的DMF溶液，盐酸羟胺和咪唑的质量比为1～3:1～3，更优选比例为2:1。
水合肼有潜在的基因毒性，在工业上应尽量避免使用，盐酸羟胺和咪唑没有潜在基因毒性的风险。
作为优选方案，索玛鲁肽的合成采用S19-S20片段Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH为原料。
该优选方案能有效减少+Ala工艺杂质的产生，同时能够提高总的合成收率。
优选地，索玛鲁肽的合成采用S18-S20片段Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH为原料。
该优选方案能有效减少+Ala工艺杂质的产生，同时能够提高总的合成收率。
优选地，索玛鲁肽的合成方法为：合成Fmoc-Gly-树脂，通过固相合成法，按索玛鲁肽主链C端至N端肽序，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe–OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到索玛鲁肽主链；脱除Lys20侧链Dde保护基，依次偶联侧链氨基酸序列Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，获得索玛鲁肽全保护肽树脂；经裂解纯化得到索玛鲁肽。
作为另一种优选方案，索玛鲁肽的合成方法为：合成Fmoc-Gly-树脂，通过固相合成法，按索玛鲁肽肽链从C端至N端肽序，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe–OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到索玛鲁肽全保护肽树脂，经裂解纯化得到索玛鲁肽。
作为第三种优选方案，索玛鲁肽的合成方法为：合成Fmoc-Gly-树脂，通过固相合成法，按索玛鲁肽肽链从C端至N端肽序，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe–OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到索玛鲁肽全保护肽树脂，经裂解纯化得到索玛鲁肽。
优选地，索玛鲁肽的合成所用载体树脂选自2-CTC树脂、Wang-树脂。
2-CTC树脂、Wang-树脂在合成工艺过程中相对稳定，不容易发生副反应。价格相对便宜，在合成成本的控制上有优势，适合工业化大规模生产。
作为优选，裂解索玛鲁肽全保护树脂的裂解液为TFA、EDT、DMS、苯甲硫醚、TIS的混合液。
更优选地，TFA、EDT、DMS、苯甲硫醚、TIS的体积比为80～90:1～5:1～5:2～5:2～6:1～5。
更优选地TFA、EDT、DMS、苯甲硫醚、TIS的体积比为90:2:2:2:2:2。
本发明采用片段加逐一缩合法，大大简化了工艺流程步骤，合成周期短，成本低，非常有利于工业化大生产。选用Fmoc-Lys(Dde)-OH时，大大降低了合成索玛鲁肽粗品的成本。选用Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH多肽片段或Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester)-OH多肽片段接入主链，有利于完成索玛鲁肽主链的偶联，大大提高了索玛鲁肽粗品的纯度和收率，降低合成成本，粗品纯度达到70％。采用二肽片段偶联的策略大大降低了D-His消旋杂质的产生，极大的降低了产品纯化的难度，提高了收率，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例18制备的索玛鲁肽粗品HPLC色谱图
图2为实施例21纯化的索玛鲁肽精肽HPLC色谱图
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表中：
Fmoc 芴甲氧羰基
Fmoc-AA 芴甲氧羰基保护的氨基酸
TBTU 2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯
HOBT 1-羟基苯并三唑
DIEA: N,N-二异丙基乙胺
DIC: N,N-二异丙基碳二亚胺
tBu 叔丁基
Boc 叔丁氧羰基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
TFE 三氟乙醇
DCM 二氯甲烷
实施例1全保护S1-S2片段二肽Boc-His(Trt)-Aib-OH的制备
A.Boc-His(Trt)-OH活泼酯的制备
将100ml的单口瓶放置在低温恒温搅拌反应器中，加入2.50g Boc-His(Trt)-OH和25ml DCM溶剂，再加入0.69gHOSU。在0℃下搅拌溶解澄清后，滴加溶于10mlDCM中的1.34gDCC溶液。10min滴加完毕后升温至25℃反应3h。用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，抽滤，加入5mlDCM洗涤，合并滤液并旋蒸除去溶剂获得粘稠物体2.63g。
B.Boc-His(Trt)-Aib-OH的制备
将25ml的单口瓶放置低温恒温搅拌反应器中，加入0.14g H-Aib-OH、1.5mL的0.087g/mL的碳酸钠水溶液和3ml(v/v＝1:1)的THF/H2O混合溶液，降温至0℃。称取0.59g步骤A获得的Boc-His(Trt)-OH活泼酯溶于1.5mlTHF中并滴加到单口瓶中。5min滴加完毕后升温至25℃反应4h，用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，加入柠檬酸水溶液调节PH＝5，分别用EA萃取2次，每次10ml。收集有机相用柠檬酸水溶液洗涤2次，每次20ml。用20ml饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去溶剂获得粘稠固体。加入4ml(v/v＝1:1)的石油醚/异丙醚混合溶剂打浆30min，抽滤获得白色固体0.25g。
实施例2全保护S1-S2片段二肽Fmoc-His(Trt)-Aib-OH的制备
A.Fmoc-His(Trt)-OH活泼酯的制备
将100ml的单口瓶放置在低温恒温搅拌反应器中，加入3.10g Fmoc-His(Trt)-OH和25ml DCM溶剂，再加入1.1g五氟苯酚。在0℃下搅拌溶解澄清后，滴加溶于10mlDCM中的1.34gDCC溶液。10min滴加完毕后升温至25℃反应3h。用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，抽滤，加入5mlDCM洗涤，合并滤液并旋蒸除去溶剂获得粘稠物体3.24g。
B.Fmoc-His(Trt)-Aib-OH的制备
将25ml的单口瓶放置低温恒温搅拌反应器中，加入0.14g H-Aib-OH、1.5mL的0.087g/mL的碳酸钠水溶液和3ml(v/v＝1:1)的THF/H2O混合溶液，降温至0℃。称取0.87g步骤A获得的Fmoc-His(Trt)-OH活泼酯溶于1.5mlTHF中并滴加到单口瓶中。5min滴加完毕后升温至25℃反应4h，用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，加入柠檬酸水溶液调节PH＝5，分别用EA萃取2次，每次10ml。收集有机相用柠檬酸水溶液洗涤2次，每次20ml。用20ml饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去溶剂获得粘稠固体。加入4ml(v/v＝1:1)的石油醚/异丙醚混合溶剂打浆30min，抽滤获得黄色粘稠物0.32g。
实施例3全保护S1-S2片段二肽Fmoc-His(Boc)-Aib-OH的制备
A.Fmoc-His(Boc)-OH活泼酯的制备
将100ml的单口瓶放置在低温恒温搅拌反应器中，加入3.50g Fmoc-His(Boc)-OH和25ml DCM溶剂，再加入1.3g五氟苯酚。在0℃下搅拌溶解澄清后，滴加溶于10mlDCM中的1.34gDCC溶液。10min滴加完毕后升温至25℃反应3h。用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，抽滤，加入5mlDCM洗涤，合并滤液并旋蒸除去溶剂获得粘稠物体3.72g。
B.Fmoc-His(Boc)-Aib-OH的制备
将25ml的单口瓶放置低温恒温搅拌反应器中，加入0.14g H-Aib-OH、1.5mL的0.087g/mL的碳酸钠水溶液和3ml(v/v＝1:1)的THF/H2O混合溶液，降温至0℃。称取0.73g步骤A获得的Fmoc-His(Boc)-OH活泼酯溶于1.5mlTHF中并滴加到单口瓶中。5min滴加完毕后升温至25℃反应4h，用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，加入柠檬酸水溶液调节PH＝5，分别用EA萃取2次，每次10ml。收集有机相用柠檬酸水溶液洗涤2次，每次20ml。用20ml饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去溶剂获得粘稠固体。加入4ml(v/v＝1:1)的石油醚/异丙醚混合溶剂打浆30min，抽滤获得黄色粘稠物0.28g。
实施例4全保护S3-S6片段四肽Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
A.将150g(165mmol)替代度为1.1mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入160ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入160ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入160ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。称取128.20g的Fmoc-Phe-OH于烧杯中，加入160mlDMF和80ml的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入CTC树脂中，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，滤除DMF。加入27ml甲醇和100ml DMF的混合溶液，38ml DIEA和100ml DMF的混合溶液至树脂中,继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次160ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次160ml；再用二氯甲烷洗2次，每次160ml；最后用甲醇洗3次，每次160ml，直至树脂充分分散开。
B.将步骤A中获得的Fmoc-Phe-CTC树脂全部倒入反应釜中，用100ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
C.依次称取131.09g的Fmoc-Thr(tBu)-OH、41.62gDIC和44.56g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-CTC树脂。
D.按如上B的去保护方法和C的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶联。最后用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护四肽Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-CTC树脂305.50g。
E.在15℃条件下，向3L裂解液中加入步骤D中所获得的全保护肽树脂305.50g，裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)。升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用1L的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的5L异丁基醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丁基醚1L洗涤，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH粗品142.54g。
实施例5替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
A.将10g(8mmol)替代度为0.8mmol/g的Wang树脂加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入100ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取7.14g的Fmoc-Gly-OH和3.89g的HOBT于烧杯中，加入100mlDMF和3.97ml的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得Wang树脂中，加入0.15g的DMAP，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，加入醋酸酐7.55ml，继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到13.8g的Fmoc-Gly-Wang树脂，经紫外检测替代度为0.3mmol/g。
实施例6替代度为0.6mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
A.将10g(14mmol)替代度为1.4mmol/g的Wang树脂加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入100ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取12.49g的Fmoc-Gly-OH和6.81g的HOBT于烧杯中，加入100mlDMF和6.95ml的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得Wang树脂中，加入0.26g的DMAP，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，加入醋酸酐13.21ml，继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到12.7g的Fmoc-Gly-Wang树脂，经检测替代度为0.6mmol/g。
实施例7替代度为0.45mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的制备
A.将10g(10mmol)替代度为1.0mmol/g的CTC树脂加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入100ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取8.92g的Fmoc-Gly-OH和4.86g的HOBT于烧杯中，加入100mlDMF和4.96ml的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，滤除DMF。加入4ml甲醇和50ml DMF的混合溶液，5ml DIEA和50ml DMF的混合溶液至树脂中,继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到13.2g的Fmoc-Gly-CTC树脂，经检测替代度为0.45mmol/g。
实施例8采用Fmoc-Lys(Dde)-OH为原料合成索玛鲁肽主链树脂
A.将实施例5中获得的10g Fmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1.16gTBTU和0.49g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.50ml DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例4制备所得的Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH、实施例1制备所得的Boc-His(Trt)-Aib-OH。其中，偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Phe-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Boc-His(Trt)-Aib-OH时采用COMU/DIEA偶联体系和NMP/DMSO＝1:1的混合溶剂。最后用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽主链肽树脂21.9g。
实施例9采用Fmoc-Lys(Dde)-OH为原料合成索玛鲁肽全保护肽树脂
A.将实施例8中获得的索玛鲁肽主链肽树脂15g加入反应釜中，加入150ml二氯甲烷，混合15min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.加入12g盐酸羟胺/6g咪唑的DMF澄清溶液150ml，于20-30℃条件下混合1h后，抽干。加入DMF150ml，混合5min后，抽干。加入DMF150ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次150ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
C.依次称取1.54g Fmoc-AEEA-OH、1.54gTBTU和0.81g HOBT于干净的500mL烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液150ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.66ml DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF150ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次150ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性。
D.按照以上方法继续偶联Fmoc-AEEA-OH后，依次偶联Fmoc-Glu(OH)-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯。在偶联十八烷二酸单叔丁酯时，采用PyBop/DIEA体系，即加入2.50g的PyBop和0.66mL的DIEA，溶剂选用DMF：NMP＝1:1V/V，其余反应条件均不变。偶联完成后用甲醇收缩，完成索玛鲁肽S20位侧链的合成，获得索玛鲁肽全保护肽树脂14.31g。
实施10采用Fmoc-Lys(Dde)-OH为原料合成索玛鲁肽全保护肽树脂
A.将实施例8中获得的索玛鲁肽主链肽树脂10g加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合15min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.加入12g盐酸羟胺/4g咪唑的DMF澄清溶液100ml，于20-30℃条件下混合1h后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
C.依次称取1.03g Fmoc-AEEA-OH、1.03gTBTU和0.54g HOBT于干净的500mL烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.44ml DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性。
D.按照以上方法继续偶联Fmoc-AEEA-OH后，依次偶联Fmoc-Glu(OH)-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯。在偶联十八烷二酸单叔丁酯时，采用PyBop/DIEA体系，即加入1.67g的PyBop和0.44mL的DIEA，溶剂选用DMF：NMP＝1:1V/V，其余反应条件均不变。偶联完成后用甲醇收缩，完成索玛鲁肽S20位侧链的合成，获得索玛鲁肽全保护肽树脂13.85g。
实施例11采用Fmoc-Lys(Dde)-OH为原料合成索玛鲁肽全保护肽树脂
A.将实施例8中获得的索玛鲁肽主链肽树脂10g加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合15min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.加入4g盐酸羟胺/12g咪唑的DMF澄清溶液100ml，于20-30℃条件下混合1h后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
C.依次称取1.03g Fmoc-AEEA-OH、1.03gTBTU和0.54g HOBT于干净的500mL烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.44ml DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性。
D.按照以上方法继续偶联Fmoc-AEEA-OH后，依次偶联Fmoc-Glu(OH)-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯。在偶联十八烷二酸单叔丁酯时，采用PyBop/DIEA体系，即加入1.67g的PyBop和0.44mL的DIEA，溶剂选用DMF：NMP＝1:1V/V，其余反应条件均不变。偶联完成后用甲醇收缩，完成索玛鲁肽S20位侧链的合成，获得索玛鲁肽全保护肽树脂13.55g。
实施例12采用Fmoc-Lys(Dde)-OH为原料合成索玛鲁肽全保护肽树脂
A.将实施例8中获得的索玛鲁肽主链肽树脂10g加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合15min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.加入2％NH2NH2的DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10分钟后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
C.依次称取1.03g Fmoc-AEEA-OH、1.03gTBTU和0.54g HOBT于干净的500mL烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.44ml DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性。
D.按照以上方法继续偶联Fmoc-AEEA-OH后，依次偶联Fmoc-Glu(OH)-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯。在偶联十八烷二酸单叔丁酯时，采用PyBop/DIEA体系，即加入1.67g的PyBop和0.44ml的DIEA，溶剂选用DMF：NMP＝1:1V/V，其余反应条件均不变。偶联完成后用甲醇收缩，完成索玛鲁肽S20位侧链的合成，获得索玛鲁肽全保护肽树脂13.43g。
实施例13：Boc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester)--OH的制备
A.将150g(165mmol)替代度为1.1mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入160ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入160ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入160ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取127.17g的Fmoc-AEEA-OH于烧杯中，加入160mlDMF和80ml的DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，滤除DMF。加入27ml甲醇和100ml DMF的混合溶液，38ml DIEA和100ml DMF的混合溶液至树脂中,继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次160ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次160ml；再用二氯甲烷洗2次，每次160ml；最后用甲醇洗3次，每次160ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，获得Fmoc-AEEA-CTC树脂201.5g。经检测，替代度为0.6mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-AEEA-CTC树脂全部倒入反应釜中，用200ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液200ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF200ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液200ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF200ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次200ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取93.19g的Fmoc-AEEA-OH、45.43mL DIC和39.20gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液200ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF200ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次200ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-AEEA-AEEA-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联氨基酸Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯。最后用二氯甲烷洗5次，每次200ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次200ml；再用二氯甲烷洗2次，每次200ml；最后用醇3次，每次200ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到Octadecanedioic acid mono-tert-butylester-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-CTC树脂291.48g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向3L裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂291.48g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用500mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的3L异丁基醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丁基醚500mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得Octadecanedioic acid mono-tert-butylester-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-OH粗品96.80g。
H.将步骤G得到的Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-OH粗品10g，溶解于20mL DCM中，加入4.4g五氟苯酚。缓慢滴加加入20mL溶解于DCM的DCC溶液，其中含有4.8g DCC。搅拌反应1.0h，TLC检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥DCM溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中。另外，称取12.15g Boc-Lys-OH.HCl溶解于乙腈/水中(乙腈/水＝1/2)，加入15mLDIEA，搅拌15分钟获得Boc-Lys-OH溶液。将以上的反应溶液缓慢滴加到Boc-Lys-OH溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调pH值约为6，加入少量的DCM萃取。经纯化得到Boc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH 3.48g。
实施例14：Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester)-OH的制备
A.将10mL 4M HCl的1,4-二氧六环溶液在冰水浴中冷却，加入实施例12获得的1.30g Boc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester)-OH。反应液升温到室温后反应2小时。旋蒸除去溶剂，用15mL DCM溶解并过滤，用DCM洗涤两次，每次15mL。合并滤液，旋蒸除去溶剂，获得油状粗品，不需要纯化可直接用于下一步反应。
B.将步骤A得到的H-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butylester)-OH粗品溶解于20mL DCM中，加入0.66g五氟苯酚。称取0.74g DCC，溶于20mL DCM中,将DCC溶液缓慢滴加到反应溶液中，搅拌反应1.0h，TLC检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥DCM溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中。另外，称取0.75g Fmoc-Ala-OH.HCl溶解于乙腈/水中(乙腈/水＝1/2)，加入0.50mL DIEA，搅拌15分钟获得Fmoc-Ala-OH溶液。将以上的反应溶液缓慢滴加到Fmoc-Ala-OH溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调pH值约为6，加入少量的DCM萃取。经纯化得到Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester)-OH 1.54g。
实施例15采用Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester)-OH为原料合成索玛鲁全保护肽树脂
A.将10g替代度为0.3mmol/克的Fmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1.16gTBTU和0.49g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.50ml DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、
Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例14所得的Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butylester)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH。其中，偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-His(Trt)-Aib-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH时采用COMU/DIEA偶联体系和NMP/DMSO＝1:1的混合溶剂。最后用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂25.4g。
实施例16Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester)-OH的制备。
A.将10mL 4M HCl的1,4-二氧六环溶液在冰水浴中冷却，加入实施例12获得的1.30g Boc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester)-OH。反应液升温到室温后反应2小时。旋蒸除去溶剂，用15mL DCM溶解并过滤，用DCM洗涤两次，每次15mL。合并滤液，旋蒸除去溶剂，获得油状粗品，不需要纯化可直接用于下一步反应。
B.将步骤A得到的H-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester)-OH粗品溶解于20mL DCM中，加入0.66g五氟苯酚。称取0.74gDCC，溶于20mL DCM中,将DCC溶液缓慢滴加到反应溶液中，搅拌反应1.0h，TLC检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥DCM溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中。另外，称取0.68g Boc-Ala-OH.HCl溶解于乙腈/水中(乙腈/水＝1/2)，加入0.50mL DIEA，搅拌15分钟获得Boc-Ala-OH溶液。将以上的反应溶液缓慢滴加到Boc-Ala-OH溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调pH值约为6，加入少量的DCM萃取。经纯化得到Boc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester)-OH 1.44g。
C.将10mL 4M HCl的1,4-二氧六环溶液在冰水浴中冷却，加入步骤B获得的1.44gBoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butylester)-OH。反应液升温到室温后反应2小时。旋蒸除去溶剂，用15mL DCM溶解并过滤，用DCM洗涤两次，每次15mL。合并滤液，旋蒸除去溶剂，获得油状粗品，不需要纯化可直接用于下一步反应。
D.将步骤C获得的H-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butyl ester)-OH粗品溶解于20mL DCM中，加入0.66g五氟苯酚。称取0.74gDCC，溶于20mL DCM中,将DCC溶液缓慢滴加到反应溶液中，搅拌反应1.0h，TLC检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥DCM溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中。另外，称取0.75g Fmoc-Ala-OH.HCl溶解于乙腈/水中(乙腈/水＝1/2)，加入0.50mL DIEA，搅拌15分钟获得Fmoc-Ala-OH溶液。将以上的反应溶液缓慢滴加到Fmoc-Ala-OH溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调pH值约为6，加入少量的DCM萃取。经纯化得到Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH 1.63g。
实施例17采用Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioicacid mono-tert-butyl ester)-OH为原料合成索玛鲁全保护肽树脂
A.将10g实施例6所得的Fmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取3.89g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1.16gTBTU和0.49g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.50ml DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例16所得的Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acidmono-tert-butylester)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例4中制备所得的Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH、实施例1中制备所得的Boc-His(Trt)-Aib-OH。其中，偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH和Boc-His(Trt)-Aib-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH时采用COMU/DIEA偶联体系和NMP/DMSO＝1:1的混合溶剂。最后用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。获得索玛鲁肽肽树脂25.7g。
实施例18索玛鲁肽的制备
裂解液配比为TFA:EDT:DMS:苯甲硫醚:Tis:H2O＝80:4:4:4:4:4(体积比)，于15℃条件下，向100mL裂解液中加入实施例9中获得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的300mL异丁基醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得索玛鲁肽粗品5.7g，HPLC纯度为63.2％，HPLC色谱图如图1所示。
实施例19索玛鲁肽的制备
裂解液配比为TFA:EDT:DMS:苯甲硫醚:Tis:H2O＝85:5:3:4:2:1(体积比)，于15℃条件下，向100mL裂解液中加入实施例15中获得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的300mL异丁基醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得索玛鲁肽粗品5.0g，HPLC纯度为59.8％，HPLC色谱图与图1相似。
实施例20索玛鲁肽的制备
裂解液配比为TFA:EDT:DMS:苯甲硫醚:Tis:H2O＝90:2:2:2:2:2(体积比)，于15℃条件下，向100mL裂解液中加入实施例17中获得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的300mL异丁基醚中，沉降过夜后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得索玛鲁肽粗品6.8g，HPLC纯度为69.5％，HPLC色谱图与图1相似。
实施例21索玛鲁肽精肽的制备
取实施例18所得的5.50g索玛鲁肽粗品溶于乙腈水溶液，以十八烷基键合硅胶为固定相、以NaClO4盐溶液和乙腈为流动相对索玛鲁肽粗肽溶液进行HPLC梯度洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的一次纯化溶液。索玛鲁肽的一次纯化液以十八烷基键合硅胶为固定相、用TFA水溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得索玛鲁肽精肽2.47g,HPLC纯度为99.7％，HPLC色谱图如图2所示,纯化收率为64.5％。

Claims (14)

1.一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：分别合成索玛鲁肽全保护S1-S2片段、S3-S6片段，用于合成索玛鲁肽树脂，经裂解、纯化得到索玛鲁肽。
2.根据权利要求1所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：所述的全保护S1-S2片段为R1-His(R2)-Aib-OH，全保护S3-S6片段为R3-Glu(R4)-Gly-Thr(R5)-Phe-OH。其中R1选自：Boc或Fmoc；R2选自：Trt或Boc；R3选自Fmoc；R4选自OtBu；R5选自tBu。
3.根据权利要求2所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：所述的全保护S1-S2片段为Boc-His(Trt)-Aib-OH，全保护S3-S6片段为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH。
4.根据权利要求1所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：索玛鲁肽的合成采用Fmoc-Lys(Dde)-OH为原料。
5.根据权利要求1所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：索玛鲁肽的合成采用全保护S19-S20片段Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH为原料。
6.根据权利要求1所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：索玛鲁肽的合成采用全保护S18-S20片段Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH为原料。
7.根据权利要求4所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：Fmoc-Lys(Dde)-OH侧链Dde保护基的脱除液选自盐酸羟胺和咪唑混合的DMF溶液、NH2NH2的DMF溶液。
8.根据权利要求7所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：所述盐酸羟胺和咪唑的质量比为1～3:1～3。
9.根据权利要求3或4所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：索玛鲁肽的合成方法为：合成Fmoc-Gly-树脂，通过固相合成法，按索玛鲁肽主链C端至N端肽序，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到索玛鲁肽主链；脱除Lys20侧链Dde保护基，依次偶联侧链氨基酸序列Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，获得索玛鲁肽全保护肽树脂；经裂解、纯化得到索玛鲁肽。
10.根据权利要求3或5所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：索玛鲁肽的合成方法为：合成Fmoc-Gly-树脂，通过固相合成法，按索玛鲁肽肽链从C端至N端肽序，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe–OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到索玛鲁肽全保护肽树脂，经裂解、纯化得到索玛鲁肽。
11.根据权利要求3或6所述的索玛鲁肽合成方法，其特征在于：索玛鲁肽的合成方法为：合成Fmoc-Gly-树脂，通过固相合成法，按索玛鲁肽肽链从C端至N端肽序，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic acid mono-tert-butyl ester)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe–OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，得到索玛鲁肽全保护肽树脂，经裂解、纯化得到索玛鲁肽。
12.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：所述树脂选自2-CTC树脂、Wang-树脂。
13.根据权利1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：裂解索玛鲁肽全保护树脂的裂解液为TFA、EDT、DMS、苯甲硫醚、TIS的混合液。
14.根据权利要求13所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于：所述TFA、EDT、DMS、苯甲硫醚、TIS的体积比为80～90:1～5:1～5:2～5:2～6:1～5。
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