CN108059666B - 一种固液结合制备索玛鲁肽的方法 - Google Patents

一种固液结合制备索玛鲁肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，解决了现有技术合成长序列多肽过程中合成周期长、纯化难度大、产率低的技术问题。本发明提供一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，首先采用固相合成方法将Lys以Alloc‑Lys(Fmoc)‑OH形式与树脂缩合，脱除侧链ε‑NH2上的Fmoc保护基、进行连接侧链，经裂解得到Alloc‑Lys(PEG‑PEG‑γ‑Glu(OtBu)‑Monobutyl octadecanate)‑OH，同时采用液相合成方法同时合成10个二肽或三肽或四肽片段；再以树脂为载体进行所合成的肽片段和单个氨基酸的缩合反应，该过程减少了15步固相缩合反应，减少了缺失肽杂质的生成，提高了产品纯度和收率；同时有效的避免了杂质[+Gly]‑索玛鲁肽和[+Ala]‑索玛鲁肽的产生，大大降低了纯化难度。本发明广泛应用于多肽药物制备技术领域。

Description

一种固液结合制备索玛鲁肽的方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备技术领域，特别涉及一种固液结合制备索玛鲁肽的方法。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由人肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌，具有降低血糖浓度的功效，被用于II型糖尿病的治疗。然而天然GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解。
索玛鲁肽，英文名称为Semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，用于治疗II型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年10月18日被FDA建议批准上市。索玛鲁肽的Lys侧链经PEG、Glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时N端第2位的Ala突变为Aib后，有效的避免了被DPP-IV酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次，目前该药物的口服剂型也正在研制当中。
索玛鲁肽的CAS号为910463-68-2，分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.64g/mol，其结构如下
专利CN103848910B公开了一种首先在树脂上逐个缩合31个氨基酸，随后在Lys的ε-NH2上接上侧链，制备索玛鲁肽的方法。专利CN104356224A公开了一种采用液相法在Lys的ε-NH2上接上侧链，随后在树脂上逐个缩合氨基酸制备索玛鲁肽的方法。专利CN105753964A公开了一种采用固相法在Lys的ε-NH2上接上侧链，随后在树脂上逐个缩合氨基酸制备索玛鲁肽的方法。专利CN106749613A公开了一种采用16+6+9片段缩合制备索玛鲁肽的方法。专利CN106478806A公开了一种在树脂上逐个缩合氨基酸，当缩合至Lys时脱除Lysε-NH2上的保护基、连接侧链，然后再逐个缩合其它氨基酸制备索玛鲁肽的方法。
由于索玛鲁肽是由一个含有31个氨基酸的主链和一个长侧链构成的长肽，所以上述制备方法存在以下不足：采用逐个氨基酸缩合的方法合成索玛鲁肽，合成周期长、效率低，随着肽链的延长容易产生缺失肽，产物纯度降低；同时索玛鲁肽中含有3个Gly、4个Ala和2个Arg残基，由于Gly和Ala自身的结构特点，使其在缩合过程中容易重复偶联，产生[+Gly]和[+Ala]的杂质；Arg属于困难氨基酸，在缩合过程中偶联效率低，容易产生[-Arg]的缺失肽，这些杂质与目标肽的性质相近，增加产品分离纯化的难度，导致产品得率低。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术的不足，依据索玛鲁肽自身结构特点，提供一种合成长序列多肽过程中合成周期短、纯化过程简易、产率高的固液结合制备索玛鲁肽的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，包括步骤如下：
1)缩合反应Ⅰ：将Alloc-Lys(Fmoc)-OH与树脂进行缩合，得Alloc-Lys(Fmoc)-树脂，并封闭；
2)缩合反应Ⅱ：脱除步骤1)制得的Alloc-Lys(Fmoc)-树脂上Lys侧链的Fmoc保护基后，依次缩合Fmoc-PEG-OH、Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，得Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-CTC树脂的肽树脂Ⅱ；
3)裂解步骤2)制得的肽树脂Ⅱ，得Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-OH；
4)采用液相合成法合成10个二肽或三肽或四肽片段，具体为Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-Aib-OH；
5)缩合反应Ⅲ：在缩合体系Ⅲ中，按照索玛鲁肽的序列依次对步骤3)和步骤4)制得的肽片段、以及氨基酸与树脂进行缩合，依次缩合的肽片段和氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH、Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-His(Trt)-Aib-OH，得索玛鲁肽肽树脂；索玛鲁肽全保护肽树脂为：His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(OtBu)-Phe-Thr(OtBu)-Ser-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
6)裂解步骤5)制得的索玛鲁肽肽树脂，同时脱除侧链保护基，得到索玛鲁肽粗肽；
7)对步骤6)制得的索玛鲁肽粗肽进行纯化、冻干，得索玛鲁肽纯品多肽。
优选的，步骤1)中树脂为：替代度为0.1～1.0mmol/g的CTC树脂；缩合反应Ⅰ为：将Alloc-Lys(Fmoc)-OH、DIEA和树脂的摩尔质量比为2～5:6:1混合后，在10～30℃条件下反应1～5h；封闭方法为：将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应20～60min。
优选的，步骤2)中缩合反应Ⅱ具体为：
a)脱除Fmoc保护基：向树脂中加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤树脂pH至7；第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱保护的树脂；
b)活化：在10～30℃条件下，将保护氨基酸Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯与缩合体系Ⅱ混合活化5～10min；
c)缩合：将步骤b)制得的活化氨基酸Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯加至步骤a)脱保护的树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯与缩合体系Ⅱ、Fmoc树脂的摩尔质量比为2～5:2～5:1。
优选的，缩合体系Ⅱ为：A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或TMP，D为DIC。优选的，裂解步骤3)得到的肽树脂的方法为：将体积比为8:1:1的DCM-TFE-乙酸溶液加至Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-CTC树脂中，裂解2～5h，抽滤，将滤液蒸干，得到Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH。
优选的，步骤4)中，
Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH合成方法：a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-OSu；b)将Fmoc-Arg(Pbf)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH；
Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH合成方法：a)将Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Trp(Boc)-OSu；b)将Fmoc-Trp(Boc)-OSu和H-Leu-OH在碱催化下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH；c)Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu；d)将Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu和H-Val-OH在碱催化下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH；
Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH合成方法：a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH；c)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OSu；d)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OSu和H-Phe-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH；e)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OSu；f)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH；
Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH合成方法：a)将Fmoc-Gln(Trt)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Gln(Trt)-OSu；b)将Fmoc-Gln(Trt)-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生成Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH；c)将Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OSu；d)将Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH；
Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH合成方法：a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-OH；
Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH合成方法：a)将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Tyr(tBu)-OSu；b)将Fmoc-Tyr(tBu)-OSu和H-Leu-OH在碱催化下生成Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH合成方法：a)将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu；c)将Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Val-OH在碱催化下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH；
Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH合成方法：a)将Fmoc-Thr(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Thr(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Thr(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在碱催化下生成Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH；
Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH合成方法：a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH；
Fmoc-His(Trt)-Aib-OH的合成方法为：a)将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-His(Trt)-OSu；b)将Fmoc-His(Trt)-OSu和H-Aib-OH在碱催化下生成Fmoc-His(Trt)-Aib-OH。
优选的，步骤5)中，缩合反应Ⅲ具体步骤如下：
a)树脂溶胀；
b)树脂脱保护：脱除Alloc保护基和脱除Fmoc保护基后，得脱保护树脂；脱除Alloc保护基方法为：在10～30℃条件下加入苯基硅烷与Pd(PPh3)4的摩尔质量比为10:0.2的DCM溶液进行2次脱Alloc保护，每次反应时间为30min，得脱Alloc保护的树脂；脱除Fmoc保护基方法为：脱除Lys侧链Fmoc保护基：向树脂中加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤树脂pH至7，第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱Fmoc保护的树脂；
c)氨基酸活化：氨基酸或肽片段和缩合体系Ⅲ混合均匀，活化5～10min后，得活化氨基酸；
d)缩合反应：将步骤c)制得的活化氨基酸加至步骤b)脱保护的树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
全保护氨基酸、缩合体系Ⅲ与树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；缩合体系Ⅲ为：C或A+D+E或A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC，E为DMAP；
e)封闭：
树脂为：替代度为0.2～0.6mmol/g的CTC树脂或Wang树脂；
CTC树脂的封闭方法为：将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应20～60min；
Wang树脂的封闭方法为：将吡啶-乙酸酐溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应12～24h。
优选的，步骤6)中裂解步骤5)制得的索玛鲁肽树脂，同时脱除侧链保护基的方法为：向步骤5)制得的索玛鲁肽树脂中加入10倍体积的裂解试剂，在10～30℃条件下反应2～5h后，抽滤，将滤液加至10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤，真空干燥得到索玛鲁肽粗肽；所述裂解试剂为体积份数比为TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5。
优选的，步骤7)中，索玛鲁肽粗肽纯化方法为：采用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化，第一步纯化：流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，第二步纯化对纯品转盐：流动相A相为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；第一步纯化和第二步纯化均为梯度洗脱，梯度洗脱条件为：洗脱时间为60min，洗脱梯度为B相10％～60％，流速为80ml/min，紫外检测波长220nm。
优选的，碱为：Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、二乙胺、三乙胺其中任何一种。
本发明的有益效果：
(1)本发明同时将Gly、Ala和Arg残基以肽片段Glu-Gly、Gln-Ala-Ala、Glu-Phe-Ile-Ala、Arg-Gly的形式接入，有效的避免了杂质[+Gly]-索玛鲁肽、[+Ala]-索玛鲁肽和缺失肽杂质[-Arg]-索玛鲁肽的产生，降低纯化难度，提高了产品纯度和收率。本发明采用固相合成和液相合成相结合的方法，操作简单，减少了15步固相缩合反应，大大提高了合成效率，有效的降低杂质生成。
(2)本发明在肽片段合成过程中，最大限度的采用游离氨基酸、减少了价格高昂的保护氨基酸使用，降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的原料，如无特殊规定，均为常规的市售产品。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表中：
实施例1
Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH的制备：
1)树脂的溶胀：取100g替代度为0.5mmol/g的CTC树脂，加入700ml DCM或DMF将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Alloc-Lys(Fmoc)-树脂的制备：a)将Alloc-Lys(Fmoc)-OH、DIEA和树脂按照摩尔质量比为3:6:1的比例进行混合，在25℃条件下反应2h，得到Alloc-Lys(Fmoc)-树脂；b)将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应30min，对树脂进行封闭。
3)Fmoc保护基的脱除：在25℃条件下加入20％PIP-DMF溶液进行两次脱除Fmoc保护：第一次脱除Fmoc保护和第二次脱除Fmoc保护，再用DMF洗涤树脂pH至7，抽干溶剂；第一次脱除Fmoc保护反应时间为5min，第二次脱除Fmoc保护反应时间为10min。
4)Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯的活化：分别将150mmol Fmoc-PEG-OH、150mmol Fmoc-PEG-OH、150mmol Fmoc-Glu(OH)-OtBu以及150mmol十八烷二酸单叔丁酯与150mmolHOBT用适量的DMF溶解，加入150mmol DIC，在25℃条件下反应5min。
5)Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-树脂的制备：将活化后的Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯依次与脱除Fmoc保护基的树脂缩合，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-CTC树脂149.7g。
茚三酮显色方法为：取少量树脂至于试管中，甲醇洗涤两次；在试管中分别加入体积分数85％苯酚-乙醇溶液、吡啶和质量分数5％茚三酮-乙醇溶液各两滴，于120℃条件下加热3min后，用DMF洗涤两次，观察树脂颜色。
6)Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-CTC树脂的裂解：将体积比为8:1:1的DCM-TFE-乙酸溶液加至Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-CTC树脂中，裂解2h，抽滤，将滤液蒸干，经重结晶得Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH。
实施例2
二肽、三肽及四肽片段的液相合成：
1)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的制备：
a)Fmoc-Arg(Pbf)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Arg(Pbf)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-OSu。
b)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成：将0.15mol H-Gly-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。
2)Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH的制备：
a)Fmoc-Trp(Boc)-OSu的合成：将0.4mol Fmoc-Trp(Boc)-OH和0.48mol HOSu溶于0.8LTHF，至于冰水浴；将0.48mol DCC溶于0.4L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Trp(Boc)-OSu。
b)Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH的合成：将0.45mol H-Leu-OH和0.45mol Na2CO3溶于0.6L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.3mol Fmoc-Trp(Boc)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH。
c)Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu的合成：将步骤b)制得的0.2mol Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH和0.24mol HOSu溶于0.4L THF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu。
d)Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH的合成：将0.15mol H-Val-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤c)制得的0.1molFmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH。
3)Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH的制备：
a)Fmoc-Glu(OtBu)-OSu的合成：将0.6mol Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.72mol HOSu溶于1.2LTHF，至于冰水浴；将0.72mol DCC溶于0.6LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-OSu。
b)Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH的合成：将0.75mol H-Phe-OH和0.75mol Na2CO3溶于1.0L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.5molFmoc-Glu(OtBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH。
c)Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OSu的合成：将步骤b)制得的0.4mol Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH和0.48mol HOSu溶于0.8L THF，至于冰水浴；将0.48mol DCC溶于0.4LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OSu。
d)Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH的合成：将0.45mol H-Phe-OH和0.45mol Na2CO3溶于0.6L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.3mol Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH。
e)Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OSu的合成：将步骤d)制得的0.2mol Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH和0.24mol HOSu溶于0.4L THF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OSu。
f)Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH的合成：将0.15mol H-Ala-OH和0.15molNa2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤e)制得的0.1mol Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH。
4)Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH的制备：
a)Fmoc-Gln(Trt)-OSu的合成：将0.4mol Fmoc-Gln(Trt)-OH和0.48mol HOSu溶于0.8LTHF，至于冰水浴；将0.48mol DCC溶于0.4L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Gln(Trt)-OSu。
b)Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH的合成：将0.45mol H-Ala-OH和0.45mol Na2CO3溶于0.6L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.3mol Fmoc-Gln(Trt)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH。
c)Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OSu的合成：将步骤b)制得的0.2mol Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OSu。
d)Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH的合成：将0.15mol H-Ala-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤c)制得的0.1mol Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH。
5)Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备：
a)Fmoc-Glu(OtBu)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-OSu。
b)Fmoc-Glu(OtBu)-OH的合成：将0.15mol H-Gly-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.1mol Fmoc-Glu(OtBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
6)Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH的制备：
a)Fmoc-Tyr(tBu)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Tyr(tBu)-OSu。
b)Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH的合成：将0.15mol H-Leu-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.1mol Fmoc-Tyr(tBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH。
7)Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH的制备：
a)Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Asp(OtBu)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Asp(OtBu)-OSu。
b)Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH的合成：将0.15mol H-Gly-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.1mol Fmoc-Asp(OtBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH。
8)Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH的制备：
a)Fmoc-Thr(OtBu)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Thr(OtBu)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2LTHF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Thr(OtBu)-OSu。
b)Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH的合成：将0.15mol H-Phe-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.1mol Fmoc-Thr(OtBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH。
9)Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备：
a)Fmoc-Glu(OtBu)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-Glu(OtBu)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-OSu。
b)Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH的合成：将0.15mol H-Gly-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.1mol Fmoc-Glu(OtBu)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
10)Fmoc-His(Trt)-Aib-OH的制备：
a)Fmoc-His(Trt)-OSu的合成：将0.2mol Fmoc-His(Trt)-OH和0.24mol HOSu溶于0.4LTHF，至于冰水浴；将0.24mol DCC溶于0.2L THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，滴加完毕后继续反应1h，随后将温度升至25℃继续反应3h；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干；加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-His(Trt)-OSu。
b)Fmoc-His(Trt)-Aib-OH的合成：将0.15mol H-Aib-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L 50％THF-H2O溶液，得混合溶液；将步骤a)制得的0.1mol Fmoc-His(Trt)-OSu溶于THF中，并滴加至上一步的混合溶液中，在25℃反应过夜，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，加乙酸乙酯将固体溶解、进行重结晶，得到Fmoc-His(Trt)-Aib-OH。
实施例3
索玛鲁肽肽树脂的制备：
1)树脂的溶胀：取25g替代度为0.4mmol/g的CTC树脂，加入200ml DCM或DMF将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂的制备：a)将Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、DIEA和树脂按照摩尔质量比值为3:6:1的比例进行混合，在25℃条件下反应2h，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；b)将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应30min，对树脂进行封闭，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
3)Fmoc保护基的脱除：向树脂中加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤树脂pH至7；所述第一次脱Fmoc保护时间为5min，所述第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱Fmoc保护的树脂。
4)Alloc保护基的脱除：在25℃条件下加入苯基硅烷与Pd(PPh3)4的摩尔质量比为10:0.2的DCM溶液进行2次脱Alloc保护基，每次反应时间为30min，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
5)氨基酸、肽片段的活化：分别将Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH、Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-His(Trt)-Aib-OH各30mmol与30mmol HOBT用适量的DMF溶解，加入30mmol DIC，在25℃条件下反应5min。
5)氨基酸、肽片段与Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂的缩合：将活化后的Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH、Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-His(Trt)-Aib-OH依次加至脱除Fmoc保护基的树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(OtBu)-Phe-Thr(OtBu)-Ser-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctade canate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-CTC树脂。
实施例4
索玛鲁肽肽树脂的裂解：
向实施例3制得的肽树脂中加入10倍体积的裂解试剂，裂解试剂为体积份数比为TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.52.5:2.5，在25℃条件下反应3h，抽滤，将滤液加至10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次，真空干燥，得索玛鲁肽粗肽。
实施例5
索玛鲁肽粗肽的纯化：
用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化，第一步纯化：流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液；第二步纯化对纯品转盐：流动相A相为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；两步纯化均为梯度洗脱：洗脱梯度为B相10％～60％，C18制备柱(50×250mm，10μm)，洗脱时间为60min，流速为80ml/min，紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到索玛鲁肽纯品。经检测索玛鲁肽纯品纯度99.4％，总收率34.3％。
改变实施例3步骤2)中树脂为Wang树脂时，其中步骤a)方法为：将Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、HOBT、DIC、DMAP和树脂按照摩尔质量比值为3:3:3:0.2:1的比例进行混合，在25℃条件下反应12h，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；步骤b)方法为：将吡啶-乙酸酐溶液加至树脂中，在25℃条件下反应12h，对树脂进行封闭，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；改变树脂种类替代度为0.2～0.6mmol/g的Wang树脂或CTC树脂；改变树脂替代度；改变原料的投料比例为：保护氨基酸、缩合体系与Fmoc树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；改变反应溶剂、改变反应温度10～30℃、反应时间；改变缩合体系：缩合体系Ⅱ为：A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC；缩合体系Ⅲ为：C或A+D+E或A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC，E为DMAP；以及碱为：Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、二乙胺、三乙胺其中任何一种等，均可实现一种合成长序列多肽过程中合成周期短、纯化过程简易、产率高的固液结合制备索玛鲁肽的方法。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 润辉生物技术（威海）有限公司
<120> 一种固液结合制备索玛鲁肽的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Aib
<400> 1
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30

Claims (10)

1.一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，包括步骤如下：
1)缩合反应Ⅰ：将Alloc-Lys(Fmoc)-OH与树脂进行缩合，得Alloc-Lys(Fmoc)-树脂，并封闭；
2)缩合反应Ⅱ：脱除步骤1)制得的Alloc-Lys(Fmoc)-树脂上Lys侧链的Fmoc保护基后，在缩合体系Ⅱ中，依次缩合Fmoc-PEG-OH、Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，得Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-CTC树脂的肽树脂Ⅱ；
3)裂解步骤2)制得的肽树脂Ⅱ，得Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-OH；
4)采用液相合成法合成10个二肽或三肽或四肽片段，具体为Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-Aib-OH；
5)缩合反应Ⅲ：在缩合体系Ⅲ中，按照索玛鲁肽的序列依次对步骤3)和步骤4)制得的肽片段、以及氨基酸与树脂进行缩合，依次缩合的肽片段和氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH、Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-His(Trt)-Aib-OH，得索玛鲁肽肽树脂；所述的索玛鲁肽全保护肽树脂为：
His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(OtBu)-Phe-Thr(OtBu)-Ser-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyloctadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
6)裂解步骤5)制得的索玛鲁肽肽树脂，同时脱除侧链保护基，得到索玛鲁肽粗肽；
7)对步骤6)制得的索玛鲁肽粗肽进行纯化、冻干，得索玛鲁肽纯品多肽。
2.根据权利要求1所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，步骤1)中所述树脂为：替代度为0.1～1.0mmol/g的CTC树脂；所述缩合反应Ⅰ为：将Alloc-Lys(Fmoc)-OH、DIEA和树脂的摩尔质量比为2～5:6:1混合后，在10～30℃条件下反应1～5h；所述封闭方法为：将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应20～60min。
3.根据权利要求1所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，步骤2)中所述缩合反应Ⅱ具体为：
a)脱除Fmoc保护基：向树脂中加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤树脂pH至7；所述第一次脱Fmoc保护时间为5min，所述第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱保护的树脂；
b)活化：在10～30℃条件下，将Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯与缩合体系Ⅱ混合活化5～10min；
c)缩合：将步骤b)制得的活化后的Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯加至步骤a)脱保护的树脂中，在10～30℃条件下进行缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
所述Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯与缩合体系Ⅱ、Fmoc树脂的摩尔质量比为2～5:2～5:1。
4.根据权利要求3所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，所述缩合体系Ⅱ为：A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC。
5.根据权利要求1所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，裂解步骤3)得到的肽树脂的方法为：将体积比为8:1:1的DCM-TFE-乙酸溶液加至Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-CTC树脂中，裂解2～5h，抽滤，将滤液蒸干，得到Alloc-Lys(PEG-PEG-γ-Glu(OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH。
6.根据权利要求1所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，步骤4)中，
所述Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH合成方法：a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-OSu；b)将Fmoc-Arg(Pbf)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH；
所述Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH合成方法：a)将Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Trp(Boc)-OSu；b)将Fmoc-Trp(Boc)-OSu和H-Leu-OH在碱催化下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH；c)Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu；d)将Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu和H-Val-OH在碱催化下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-OH；
所述Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH合成方法：a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH；c)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OSu；d)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OSu和H-Phe-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH；e)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OSu；f)将Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH；
所述Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH合成方法：a)将Fmoc-Gln(Trt)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Gln(Trt)-OSu；b)将Fmoc-Gln(Trt)-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生成Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH；c)将Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OSu；d)将Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH；
所述Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH合成方法：a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-OH；
所述Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH合成方法：a)将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Tyr(tBu)-OSu；b)将Fmoc-Tyr(tBu)-OSu和H-Leu-OH在碱催化下生成Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OH；
所述Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH合成方法：a)将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu；c)将Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Val-OH在碱催化下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OH；
所述Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH合成方法：a)将Fmoc-Thr(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Thr(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Thr(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在碱催化下生成Fmoc-Thr(OtBu)-Phe-OH；
所述Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH合成方法：a)将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu；b)将Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH；
所述Fmoc-His(Trt)-Aib-OH的合成方法为：a)将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-His(Trt)-OSu；b)将Fmoc-His(Trt)-OSu和H-Aib-OH在碱催化下生成Fmoc-His(Trt)-Aib-OH。
7.根据权利要求1所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，步骤5)中，所述缩合反应Ⅲ具体步骤如下：
a)树脂溶胀；
b)树脂脱保护：脱除Alloc保护基和脱除Fmoc保护基后，得脱保护树脂；所述脱除Alloc保护基方法为：在10～30℃条件下加入苯基硅烷与Pd(PPh3)4的摩尔质量比为10:0.2的DCM溶液进行2次脱Alloc保护，每次反应时间为30min，得脱Alloc保护的树脂；所述脱除Fmoc保护基方法为：脱除Fmoc保护基：向树脂中加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤树脂pH至7；所述第一次脱Fmoc保护时间为5min，所述第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱Fmoc保护的树脂；
c)氨基酸活化：氨基酸或肽片段和缩合体系Ⅲ混合均匀，活化5～10min后，得活化氨基酸；
d)缩合反应：将步骤c)制得的活化氨基酸加至步骤b)脱保护的树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
所述全保护氨基酸、缩合体系Ⅲ与树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；所述缩合体系Ⅲ为：C或A+D+E或A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEA或TMP，D为DIC，E为DMAP；
e)封闭：
所述树脂为：替代度为0.2～0.6mmol/g的CTC树脂或Wang树脂；
所述CTC树脂的封闭方法为：将MeOH、DMF和DIEA的混合溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应20～60min；
所述Wang树脂的封闭方法为：将吡啶-乙酸酐溶液加至树脂中，在10～30℃条件下反应12～24h。
8.根据权利要求1所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，步骤6)中，所述裂解步骤5)制得的索玛鲁肽树脂，同时脱除侧链保护基的方法为：向步骤5)制得的索玛鲁肽树脂中加入10倍体积的裂解试剂，在10～30℃条件下反应2～5h后，抽滤，将滤液加至10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤，真空干燥，得索玛鲁肽粗肽；所述裂解试剂为体积份数比为TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5。
9.根据权利要求1所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，步骤7)中，所述索玛鲁肽粗肽纯化方法为：采用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化，所述第一步纯化：流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，所述第二步纯化对纯品转盐：流动相A相为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；所述第一步纯化和第二步纯化均为梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：洗脱时间为60min，洗脱梯度为B相10％～60％，流速为80ml/min，紫外检测波长220nm。
10.根据权利要求6所述的一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，所述的碱为：Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、二乙胺、三乙胺其中任何一种。
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Denomination of invention: A method for preparing somaluptide by solid-liquid combination

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Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Weihai Wendeng sub branch

Pledgor: REALI TIDE BIOLOGICAL TECHNOLOGY (WEIHAI) Co.,Ltd.

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