CN110028573A - 一种固液结合制备利拉鲁肽的方法 - Google Patents

一种固液结合制备利拉鲁肽的方法 Download PDF

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CN110028573A CN201910401424.1A CN201910401424A CN110028573A CN 110028573 A CN110028573 A CN 110028573A CN 201910401424 A CN201910401424 A CN 201910401424A CN 110028573 A CN110028573 A CN 110028573A
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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，本发明采用固相化学的方法制备利拉鲁肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。该方法首次采用Fmoc‑Ala‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑Pal)‑OtBu)‑OH参与固相合成利拉鲁肽,通过引入此单体参与利拉鲁肽的固相合成，提高了粗肽纯度，降低了纯化难度，降低了生产成本。

Description

一种固液结合制备利拉鲁肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固相和液相结合制备利拉鲁肽的方法。
技术背景
糖尿病是一种常见的慢性疾病，其症状包括尿液分泌过多、常有饥饿感、体重减轻、视力减退等。持续性血糖浓度升高还容易引发心脏、血管、眼睛、肾脏和神经等多种组织器官病变，影响人的身体健康。2017年全球有4.25亿糖尿病患者，在所有国家中，中国糖尿病负担最重，患者人数(1.14亿)占全球近27％。预计2045年，全球糖尿病患者将进一步加重，人数可达7亿。
利拉鲁肽(Liraglutide)，商品名Victoza，由丹麦诺和诺德公司研发，于2010年1月25日在美国上市，2011年3月4日获SFDA批准，进入中国市场。用于成人2型糖尿病患者控制血糖，适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。
利拉鲁肽是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有97％的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与天然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括:使吸收减慢的自联作用；与白蛋白结合；对二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。
利拉鲁肽化学表述为Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基))]-GLP-17-37，分子式为C172H265N43O51，相对分子质量为3751.2，CAS号为204656-20-2，序列信息如下：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu(N-α-Pal)–OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
目前，诺和诺德公司主要通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽；但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34-GLP-17-37，还需要和N-α-十六酰基-Glu(OSu)-OtBu反应，利用化学方法在Lys26接上侧链；由于Arg34-GLP-17-37的侧链均未保护，存在多个活性位点，所以此过程会产生较多杂质，损失较大。
还有报道采用固相化学法制备利拉鲁肽，主要集中在侧链修饰的连接策略上：如专利CN102286092A采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH参与接肽反应，Pd(PPh)3脱Alloc，然后连接侧链；CN103087181A采用Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH参与接肽反应，用1％TFA/5％TIS/DCM脱侧链保护剂，连接侧链；CN103145828A采用Fmoc-Lys(ivDde)-OH参与接肽反应，水合肼脱侧链保护基，然后接侧链反应；CN103980358A采用先液相合成单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)-OtBu)-OH,然后参与接肽反应。
本发明人用现有的合成方法，制备利拉鲁肽，发现纯度和收率均不高，不适于工业规模生产。为此，本发明人对利拉鲁肽的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种固液结合制备利拉鲁肽的方法。本发明采用常规的保护氨
基酸作为起始原料，降低了合成难度，提高了精肽纯度，降低了生产成本，有利于规模化工业生产。
为实现上述发明目的，本发明一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法提供以下的技术方案，包括如下步骤：
一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，包括如下步骤：
(a)Pal-Glu(OSu)-OtBu和H-Lys-OH在硫酸铜存在下偶联生成单体H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。
(b)Fmoc-Ala-OSu和H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH在碱性条件下偶联生成单体Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。
(c)以Wang树脂或CTC树脂为固相载体，采用Fmoc化学保护策略，按照利拉鲁肽肽序，依次与Fmoc保护的氨基酸发生偶联反应，得到利拉鲁肽全保护肽树脂，其中19位Ala和20位Lys采用的是单体Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，得到全保护肽树脂结构如下：
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。
(d)利拉鲁肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得利拉鲁肽精肽：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu(N-α-Pal)–OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，步骤(a)的具体操作步骤为：取1.0～2.0倍合成规模的碱溶解在溶剂中，配成碱性溶液；将赖氨酸溶解于配置好的碱溶液中；搅拌下缓慢加入硫酸铜；搅拌反应，待反应液澄清后，2～8℃下向反应液中加入Pal-Glu(OSu)–OtBu有机溶液，滴加完毕后，升温至25±5℃继续搅拌反应,经析晶、脱铜，得到单体H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。所述碱性溶液合成规模以赖氨酸投料量计。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，步骤(b)的具体操作步骤为：取1.0～2.0倍合成规模的碱溶解在溶剂中，配成碱性溶液；将H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH溶解于配置好的碱溶液中；搅拌反应，待反应液澄清后，2～8℃下向反应液中加入Fmoc-Ala-OSu有机溶液，滴加完毕后，升温25±5℃继续搅拌反应,经蒸馏、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。所述碱性溶液合成规模以赖氨酸投料量计。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，所述的碱可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾的水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；也可以是三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺有机碱的有机溶液；所述的有机溶剂可以是四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，所述步骤(c)中所述固相载体为替代度为0.1～0.6mmol/g的Wang树脂或CTC树脂。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，所述步骤(c)中所述接19位丙氨酸和20位赖氨酸所采用保护氨基酸为Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，所述步骤(c)中所述偶联反应所采用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA中的一种。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，所述步骤(d)中所述裂解用试剂为加入体积比1～5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种。
基于上述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，优选的，所述裂解用试剂配比为TFA:苯甲硫醚:水:TIS＝92.5:2.5:2.5:2.5。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明首次采用单体Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH固相合成利拉鲁肽，简化了固相合成利拉鲁肽的步骤，提高了粗肽纯度和收率，简化了纯化过程，降低了生产成本。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CTC树脂 2-氯三苯甲基氯树脂
WangResins 王树脂
tBu 叔丁基
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
TIS 三异丙基硅烷
Pal 棕榈酸
实施例1：Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH的合成
准确称取赖氨酸876g(6mol)和碳酸氢钠588g(7mol)溶于6L水中，分批加入750g(3mol)五水硫酸铜；加入完毕，搅拌2小时；待溶液澄清，低温下(2-8℃)缓慢加入Pal-Glu(OSu)-OtBu的四氢呋喃溶液(323g，0.6mol)/3L，搅拌反应，TLC监测反应终点；反应完全后，分别加入1L甲醇，搅拌10小时；加入3L水和3L乙酸乙酯，搅拌得蓝色沉淀，过滤、水洗得H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH与铜离子结合的固体。
将上述所得固体溶于3L丙酮中，搅拌均匀后，加入10L10％的Na2CO3水溶液，和870g(6mol)8-羟基喹啉，常温搅拌2小时，蓝色反应物变为绿色；低温下滴加245g(6mol)Fmoc-Ala-OSu的丙酮溶液3L,室温下反应过夜。过滤、洗涤滤饼得棕色反应液，40℃下减压旋蒸直至无大量液体蒸出，10％柠檬酸溶液调pH至3-4，析出白色固体；过滤、洗涤、干燥得白色固体，乙酸乙酯重结晶，得固体339.7g，总收率65.6％。
实施例2：Fmoc-Gly-WangResins的合成
将载体Wang树脂200.0g(sub＝0.40mmol/g)置于合成柱中，用1200mLDMF洗涤两次，加入1200mLDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Gly-OH/DIC/HOBT的混合DCM溶液[称取29.7g(100mmol)Fmoc-Gly-OH和16.2g(120mmol)HOBT置于甘氨酸活化瓶，加入1000mL体积比例为1∶1的DMF和DCM混合溶液搅拌溶解，低温(0℃)下加入19.6ml(120mmol)DIC,活化5分钟]，反应10min后加入2.4g(2mmol)DMAP；反应2h，抽掉反应液，用1200mLDMF洗涤两次，加入封端试剂1200mL(240ml乙酸酐和204ml吡啶溶解于756mlDMF中)反应2h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤2次，真空干燥后得Fmoc-Gly-WangResins213.5g；取样测替代度为0.18mmol/g。
实施例3：Fmoc-Gly-CTCResins的合成
称取CTC树脂50.0g(sub＝0.40mmol/g)置于合成柱中，用240mLDMF洗涤两次,加入240mLDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有2.97g(10mmol)Fmoc-Gly-OH的DCM/DMF(3/1,体积比)溶液150ml，搅拌后加入DIPEA3.3ml(20mmol)，鼓N2反应60min，抽掉反应液，加入DCM/CH3OH/DIPEA(体积比17：2：1)混合溶液300ml封端3次，每次10min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥得Fmoc-Gly-CTCResins52.60g。测替代度为0.15mmol/g.
实施例4：利拉鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例2替代度为0.18mmol/g的Fmoc-Gly-WangResins200g(合成规模36mmol)置于合成柱中，加入2000mlDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，1600mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液2000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用1600mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH46.8g(72mmol)、HOBT10.70g(79.2mmol)和DIC12.6ml(79.2mmol)的DMF溶液1000ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用1600mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Boc)--OH，得到利拉鲁肽肽树脂：
Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wangresins；肽树脂制备完后，用1000mlDMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂381.0g。
实施例5：利拉鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例3替代度为0.15mmol/gFmoc-Gly-CTCResins40.0g(合成规模6.0mmol)置于合成柱中，加入400mlDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，400mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液400ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用400mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入7.78g(12mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1.78g(13.2mmol)HOBT和2.09ml(13.2mmol)DIC的DMF溶液200ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用400mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-ivDde)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Boc)--OH，得到利拉鲁肽肽树脂：
Boc-His(Boc)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-CTCresins；肽树脂制备完后，用500mlDMF、DCM和甲醇分别洗涤2次，真空干燥得肽树脂70.5g。
实施例6：利拉鲁肽肽树脂的裂解
将实施例4得到的380.0g利拉鲁肽肽树脂，加入到冷冻的3800ml裂解液(体积配比为TFA/TIS/H20＝95/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，400mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至2000ml,倒入20L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽133.9g,粗肽收率99.2％，纯度76.8％。
实施例7：利拉鲁肽肽树脂的裂解
将实施例5得到的70.0g利拉鲁肽肽树脂，加入到冷冻的700ml裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20＝90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，50mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至350ml,倒入3.5L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽19.3g,粗肽收率85.6％，纯度77.3％。
实施例8：利拉鲁肽粗肽的纯化
将实施例6所得粗肽130.0g用300ml醋酸溶解,待完全溶解后，加水稀释至10L；溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mmC18制备柱，流动相为0.1％TFA/水-0.1％TFA/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽78.6g,收率60.5％，纯度99.0％以上，单杂均小于0.2％。

Claims (9)

1.一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)Pal-Glu(OSu)-OtBu和H-Lys-OH在硫酸铜存在下偶联生成单体H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH；
(b)Fmoc-Ala-OSu和H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH在碱性条件下偶联生成单体Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH；
(c)以Wang树脂或CTC树脂为固相载体，采用Fmoc化学保护策略，按照利拉鲁肽肽序，依次与Fmoc保护的氨基酸发生偶联反应，得到利拉鲁肽全保护肽树脂，其中19位Ala和20位Lys采用的是单体Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH，得到全保护肽树脂结构如下：
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
(d)利拉鲁肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得利拉鲁肽精肽：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu(N-α-Pal)–OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
2.根据权利要求1所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，
步骤(a)的具体操作步骤为：取1.0～2.0倍合成规模的碱溶解在溶剂中，配成碱性溶液；将赖氨酸(合成规模以赖氨酸投料量计)溶解于配置好的碱溶液中；搅拌下缓慢加入硫酸铜；搅拌反应，待反应液澄清后，2～8℃下向反应液中加入Pal-Glu(OSu)–OtBu有机溶液，滴加完毕后，升温至25±5℃继续搅拌反应,经析晶、脱铜，得到单体H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。
3.根据权利要求1所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，
步骤(b)的具体操作步骤为：取1.0～2.0倍合成规模的碱溶解在溶剂中，配成碱性溶液；将H-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH(合成规模以其投料量计)溶解于配置好的碱溶液中；搅拌反应，待反应液澄清后，2～8℃下向反应液中加入Fmoc-Ala-OSu有机溶液，滴加完毕后，升温25±5℃继续搅拌反应,经蒸馏、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。
4.根据权利要求2或3所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，所述的碱可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾的水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；也可以是三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺有机碱的有机溶液；所述的有机溶剂可以是四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液。
5.根据权利要求1所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，
步骤(c)中所述固相载体为替代度为0.1～0.6mmol/g的Wang树脂或CTC树脂。
6.根据权利要求1所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于：
步骤(c)中所述接19位丙氨酸和20位赖氨酸所采用保护氨基酸为Fmoc-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Pal)-OtBu)-OH。
7.根据权利要求1所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于：
步骤(c)中所述偶联反应所采用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于：
步骤(d)中所述裂解用试剂为加入体积比1～5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的一种固液相结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于：
所述裂解用试剂配比为TFA:苯甲硫醚:水:TIS＝92.5:2.5:2.5:2.5。
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