CN115991742A

CN115991742A - 替尔泊肽的固相合成方法

Info

Publication number: CN115991742A
Application number: CN202211648825.5A
Authority: CN
Inventors: 顾春扬; 张璐; 杨斌霞
Original assignee: Suzhou Tianma Pharma Group Tianji Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Suzhou Tianma Pharma Group Tianji Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-12-20
Filing date: 2022-12-20
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了一种替尔泊肽的固相合成方法，属于多肽合成技术领域。本发明通过将片段22‑29裂解全保护肽然后以固相合成的方法连接到片段30‑39肽树脂上，合成片段22‑39肽树脂，这样可以通过用DMF洗涤，废弃液相的方法来排除杂质对后续反应的影响。然后逐个偶联至15位，得到片段15‑39肽树脂。将片段1‑14裂解全保护肽后以固相合成的方法连接到片段15‑39，合成替尔泊肽肽树脂。最后用三氟乙酸切割树脂得到替尔泊肽粗肽。本发明合成方法简单，合成成本大大降低，并且能够有效减少支链原料的消耗。得到的粗肽纯度为64.87％，相较于液相对接的方法，纯度较高，杂质易去除。

Description

替尔泊肽的固相合成方法

技术领域

本发明涉及一种替尔泊肽的固相合成方法，属于多肽制备技术领域。

背景技术

替尔泊肽(Tirzepatide)肽序列为：

H-Tyr¹-Aib²-Glu³-Gly⁴-Thr⁵-Phe⁶-Thr⁷-Ser⁸-Asp⁹-Tyr¹⁰-Ser¹¹-Ile¹²-Aib¹³-Leu¹⁴-Asp¹⁵-Lys¹⁶-Il e¹⁷-Ala¹⁸-Gln¹⁹-Lys²⁰(AEEA-AEEA-γ-Glu-eicosanedioicacid)-Ala²¹-Phe²²-Val²³-Gln²⁴-Trp²⁵-Leu²⁶-Ile²⁷-Ala²⁸-Gly²⁹-Gly³⁰-Pro³¹-Ser³²-Ser³³-Gly³⁴-Ala³⁵-Pro³⁶-Pro³⁷-Pro³⁸-Ser³⁹-NH₂

2022年5月13日，FDA宣布批准礼来研发的注射降糖药物Tirzepatide(商品名：Mounjaro)，用于在饮食控制和运动基础上，改善成人2型糖尿病患者的血糖控制。Tirzepatide是一款葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体双重激动剂，可通过双重作用机制激活参与血糖控制的激素受体--GIP和GLP-1两种肠促胰素受体。它通过每周一次皮下注射给药，达到控制血糖目标。Mounjaro是FDA批准的第一个也是唯一一个GIP/GLP受体激动剂，其将2种促胰岛素的作用整合支一个单分子中，是近十年以来获批上市的首个新一类降糖药。

期临床研究显示，Tirzepatide在显著改善2型糖尿病患者的血糖水平时，还能够降低患者体重。6个月数据显示，Tirzepatide能将2型糖尿病HbA1c水平平均降低2.4％，体重减重11.3kg(12.7％)。Tirzepatide在保持疗效的同时，降低了患者胃肠道不良事件发生率。具体数据为HbA1c水平降低2％，体重减轻5.7kg。双效GIP和GLP-1受体激动剂tirzepatide(LY3298176)随机、平行、开放标签、52周III期SURPASS-4(NCT03730662)临床试验的顶线结果数据显示，在心血管(CV)风险升高的2型糖尿病成人患者中，与滴定甘精胰岛素相比，全部3种剂量tirzepatide在降低血糖和体重方面均显示出优越性：治疗52周，采用疗效估量(efficacy estimand)统计学分析方法，最高剂量tirzepatide(15mg，每周1次)将血糖水平(A1C)从基线降低2.58％、将体重从基线降低11.7公斤(25.8磅，13.0％)，而滴定甘精胰岛素将A1C从基线降低1.44％、体重较基线增加1.9公斤(4.2磅，2.2％)。在这一患者群体中，tirzepatide的总体安全性与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂类别一致。胃肠道副作用是最常见的不良反应，通常发生在剂量递增期，然后随着时间的推移而减少。Tirzepatide除对2型糖尿病和肥胖症疗效显著外，对非酒精性脂肪性肝炎也显示出一定的治疗潜力。

Michael O.Frederick等人在《Organic Process Research&Development》上发表的《kilogram-scale GMP Manufacture of Tirzepatide Using a Hybrid SPPS/LPPSApproach with Continuous Manufacturing》文中提到了一种固相和液相混合的合成方法，流程如图1所示。首先用固相合成法合成片段1-14，15-21，22-29，30-39四个片段。然后先将片段30-39与22-29以液相的形式对接，合成片段22-39。然后片段22-39与15-21以液相的形式对接，合成片段15-39。最后与片段1-14以液相的形式对接合成完成替尔泊肽粗品。

但是现有固液混合法中液相对接费时费力，片段之间杂质难以去除分离，影响下一步对接。从而影响整个产品的纯度收率。现有方法中片段15-21中有一个较长的支链，这个支链合成成本很大，如果把它做成片段，物料需求量将成倍扩大。

发明内容

为了解决原技术中因为各片段液相对接可能导致的出现杂质难以去除分离，影响下一步对接的情况。本发明通过将片段22-29裂解全保护肽后以固相合成的方法连接到片段30-39肽树脂上，合成片段22-39肽树脂，这样可以通过用DMF洗涤，废弃液相的方法来排除杂质对后续反应的影响。然后将21位至15位氨基酸逐个偶联至片段22-39肽树脂，得到片段15-39肽树脂。将片段1-14裂解全保护肽后以固相合成的方法连接到片段15-39，合成替尔泊肽肽树脂。最后切割树脂得到替尔泊肽粗肽。

本发明的第一个目的是提供一种替尔泊肽的固相合成方法，包括如下步骤：

(1)在Rink Amide-AM Resin上通过固相合成法依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-(30-39AA)-Amide-AM Resin；

(2)在2-CTC Resin上通过固相合成方法依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH，得到Fmoc-(22-29AA)-CTC Resin，裂解全保护肽得到Fmoc-(22-29AA)-OH片段；

(3)将步骤(1)制得的Fmoc-(30-39AA)-Amide-AM Resin脱除Fmoc保护，然后与Fmoc-(22-29AA)-OH片段以固相合成法偶联对接，得到Fmoc-(22-39AA)-Amide-AM Resin；

(4)在步骤(3)制得的Fmoc-(22-39AA)-Amide-AM Resin上通过固相合成法依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Tirzepatide侧链，得到Fmoc-(15-39AA)-Amide-AM Resin；

(5)在2-CTC Resin上通过固相合成方法依次偶联Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-Tyr(tBu)-OH，得到Boc-(1-15AA)-CTC Resin，裂解全保护肽得到Boc-(1-15AA)-OH片段；

(6)将步骤(4)制得的Fmoc-(15-39AA)-Amide-AM Resin脱除Fmoc保护，然后与Boc-(1-15AA)-OH片段以固相合成法偶联对接，得到Tirzepatide肽树脂，裂解得到Tirzepatide粗肽。

进一步地，在合成过程中，脱除Fmoc保护是采用哌啶：DMF＝1：3～5的脱保护试剂进行脱除。

进一步地，在步骤(2)和步骤(5)中，裂解全保护肽所采用的裂解液为四氟乙烯TFE与二氯甲烷DCM按照体积比1:3～5配制而成。

进一步地，在步骤(6)中，裂解Tirzepatide肽树脂的裂解液为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷Tis和水按体积比95：2～3：2～3配制而成。

进一步地，在偶联时，在碱性催化体系中，采用缩合剂进行偶联。

进一步地，所述的缩合剂为HOBt。

进一步地，所述的碱性催化体系为N，N-二甲基甲酰胺、N,N-二异丙基碳二亚胺中的一种或两种组合。

进一步地，所述的偶联的时间为1.5～2.5小时。

进一步地，所述的裂解的时间为2～4小时。

进一步地，所述方法还包括替尔泊肽的纯化、转盐、冻干步骤。

本发明的有益效果是：

本发明通过将片段22-29裂解全保护肽然后以固相合成的方法连接到片段30-39肽树脂上，合成片段22-39肽树脂，这样可以通过用DMF洗涤，废弃液相的方法来排除杂质对后续反应的影响。然后逐个偶联至15位，得到片段15-39肽树脂。将片段1-14裂解全保护肽后以固相合成的方法连接到片段15-39，合成替尔泊肽肽树脂。最后用三氟乙酸切割树脂得到替尔泊肽粗肽。本发明合成方法简单，合成成本大大降低，并且能够有效减少支链原料的消耗。得到的粗肽纯度为64.87％，相较于液相对接的方法，纯度较高，杂质易去除。

附图说明：

图1为固液相合成Tirzepatide流程图

图2为固相合成Tirzepatide流程图；

图3为Fmoc-(30-39AA)-Amide-AM Resin裂解后HPLC分析；

图4为Fmoc-(30-39AA)-Amide-AM Resin裂解后MS分析，[M+1H]⁺＝852.6M＝851.6；

图5为Fmoc-(22-29AA)-OH去除保护基后的HPLC分析；

图6为Fmoc-(22-29AA)-OH去除保护基后的MS分析，[M-1H]^-＝931.8[M-2H]^2-＝465.4M＝932.8；

图7为Fmoc-(22-39AA)-Amide-AM Resin裂解后HPLC分析；

图8为Fmoc-(22-39AA)-Amide-AM Resin裂解后MS分析，[M+1H]⁺＝1768.2[M+2H]²⁺＝884.5M＝1767.2；

图9为Fmoc-(15-39AA)-Amide-AM Resin裂解后HPLC分析；

图10为Fmoc-(15-39AA)-Amide-AM Resin裂解后MS分析，[M+2H]²⁺＝1634.3[M+3H]³⁺＝1089.5M＝3265.8；

图11为Boc-(1-14AA)-OH去除保护基后的HPLC分析；

图12为Boc-(1-14AA)-OH去除保护基后的MS分析，[M+1H]⁺＝1566.1[M+2H]²⁺＝783.7M＝1565.1；

图13为Tirzepatide粗肽HPLC分析；

图14为Tirzepatide粗肽MS分析，[M-3H]^3-＝1603.7[M-4H]^4-＝1202.6[M-5H]^5-＝961.9M＝4813.45。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本工艺中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。

茚三酮检测：取少许树脂置于小玻璃试管中，依次加入试剂a：5％茚三酮的无水乙醇溶液(w/v)、b：苯酚：无水乙醇溶液(4:1，w/v)、c：吡啶各2滴，105℃加热5分钟即成。若溶液及树脂呈蓝色或深蓝色或棕色则茚三酮检测为阳性；若溶液澄清，树脂透明无色则茚三酮检测为阴性。

在文中出现的缩写代表的意义如下所示：

表1本发明相关名词解释

实施例1：Fmoc-(30-39AA)-Amide-AM Resin固相合成

称取50mmol Rink Amide-AM Resin倒入4L反应釜中，(所需树脂重量(g)＝合成规模(mmol)/Sub(mmol/g))，加入1L DMF溶胀30min，抽干。加入DMF 1L洗涤1min。

加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽1次20min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次1L洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。

称取57.51g Fmoc-Ser(tBu)-OH、20.27g HOBt至烧杯中，再加入1L DMF和23.3mLDIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次1L洗涤1min。

重复上述偶联操作依次加入Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH进行偶联。

加入无水甲醇收缩2次，每次15min，真空干燥15h以上，得到Fmoc-(30-39AA)-Amide-AM Resin待用。

实施例2：Fmoc-(22-29AA)-OH(片段22-29)合成

称取70mmol 2-CTC Resin倒入4L反应釜中，(所需树脂重量(g)＝合成规模(mmol)/Sub(mmol/g))，加入1L DMF溶胀30min，抽干。加入DMF 1L洗涤1min。

称取39.91gFmoc-Gly-OH于烧杯中，加入1LDMF和44.4mlDIEA，氮气吹拂搅拌反应4h。加入DMF洗涤3次，每次1L洗涤1min。加入封闭液(二氯甲烷：无水甲醇：DIEA＝17：2：1)(体积比)1L，封闭树脂两次，每次15min。封闭结束后用DMF洗涤5次。

称取29.39g Fmoc-Ala-OH、15.31g HOBt至烧杯中，再加入1L DMF和17.5mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次1L洗涤1min。

重复上述偶联操作依次加入Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH进行偶联。

加入无水甲醇收缩2次，每次15min，真空干燥15h以上。

将干燥完的树脂加入配制好的全保护肽1L裂解液(TFE：DCM＝1：4)(体积比)中反应3h。过滤，滤液旋蒸干燥，得到Fmoc-(22-29AA)-OH。

实施例3：Fmoc-(22-39AA)-Amide-AM Resin固相合成

称取20mmol实施例1中得到的Fmoc-(30-39AA)-Amide-AM Resin倒入2L反应柱中，(所需树脂重量(g)＝合成规模(mmol)/Sub(mmol/g))，加入1L DMF溶胀30min，抽干。加入DMF 500mL洗涤1min。

加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽1次20min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次500mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。

称取48.5g实施例2中得到的Fmoc-(22-29AA)-OH(片段22-29)、8.11g HOBt至烧杯中，再加入500L DMF和9.3mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次500mL洗涤1min，得到Fmoc-(22-39AA)-Amide-AMResin。

实施例4：Fmoc-(15-39AA)-Amide-AM Resin固相合成

将实施例3中的Fmoc-(22-39AA)-Amide-AM Resin加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽1次20min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次500mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。

称取18.7g Fmoc-Ala-OH、8.11g HOBt至烧杯中，再加入500L DMF和9.3mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次500mL洗涤1min。

重复上述偶联操作依次加入Tirzepatide侧链、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH进行偶联。

加入无水甲醇收缩2次，每次15min，真空干燥15h以上，得到Fmoc-(15-39AA)-Amide-AM Resin。

实施例5：Boc-(1-14AA)-OH(片段1-14)固相合成

称取45.19gFmoc-Leu-OH于烧杯中，加入1LDMF和42.26mlDIEA，氮气吹拂搅拌反应4h。加入DMF洗涤3次，每次1L洗涤1min。加入封闭液(二氯甲烷：无水甲醇：DIEA＝17：2：1)(体积比)1L，封闭树脂两次，每次15min。封闭结束后用DMF洗涤5次。

称取51.05g Fmoc-Aib-OH、25.44g HOBt至烧杯中，再加入1L DMF和29.1mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次1L洗涤1min。

重复上述偶联操作依次加入Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-Tyr(tBu)-OH进行偶联。

加入无水甲醇收缩2次，每次15min，真空干燥15h以上。

将干燥完的树脂加入配制好的全保护肽1L裂解液(TFE：DCM＝1：4)(体积比)中反应3h。过滤，滤液旋蒸干燥，得到Boc-(1-14AA)-OH。

实施例6：Tirzepatide肽树脂固相合成

称取5mmol实施例4中得到的Fmoc-(15-39AA)-Amide-AM Resin(所需树脂重量(g)＝合成规模(mmol)/Sub(mmol/g))。加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽1次20min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。

称取16.01g实施例5中得到的Boc-(1-14AA)-OH(片段1-14)、1.62g HOBt至烧杯中，再加入100mLDMF和1.9mLDIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。

加入无水甲醇收缩2次，每次15min，真空干燥15h以上，得到Tirzepatide肽树脂。

实施例7：裂解得到Tirzepatide粗肽

以TFA：Tis：水＝95：2.5：2.5的比例配制裂解液，加入实施例6得到的Tirzepatide肽树脂，搅拌反应3h。过滤后滤液加入到甲基叔丁基醚中搅拌30min，离心，用甲基叔丁基醚洗涤粗肽3次，所得湿品真空干燥15h以上，得到Tirzepatide粗肽。Tirzepatide粗肽的HPLC如图13所示，纯度达到64.87％，有利于后期纯化。

15mmol样品混匀碾碎，放入10L量杯中，加入1.5L乙腈，搅拌超声，再加水至7.5L(溶解浓度约为2mmol/L)，搅拌超声，待样品全部溶解后过滤。将溶解后的样品分两针用创新15厘米制备型高效液相色谱仪聚合物为制备柱进行纯化，0.1％TFA为流动相，收集主峰纯度大于80％。再将收集到的主峰用汉邦15厘米制备型高效液相色谱仪kromasil C18制备柱进行纯化，流动相为50mmol/L NH₄HCO₃，收集纯度大于98％的样品，将收集到的纯度大于98％的样品用0.05％TFA进行转盐，将主峰全部收集，再进行旋蒸冻干。得到的纯品中，单杂小于0.9％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种替尔泊肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在合成过程中，脱除Fmoc保护是采用哌啶：DMF＝1：3～5的脱保护试剂进行脱除。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)和步骤(5)中，裂解全保护肽所采用的裂解液为四氟乙醇TFE与二氯甲烷DCM按照体积比1:3～5配制而成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)中，裂解Tirzepatide肽树脂的裂解液为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷Tis和水按体积比95：2～3：2～3配制而成。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在偶联时，在碱性催化体系中，采用缩合剂进行偶联。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的缩合剂为HOBt。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的碱性催化体系为N，N-二甲基甲酰胺、N,N-二异丙基碳二亚胺中的一种或两种组合。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的偶联的时间为1.5～2.5小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的裂解的时间为2～4小时。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括替尔泊肽的纯化纯化、转盐、冻干步骤。