CN107903317A - 一种利拉鲁肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利拉鲁肽的合成方法,其步骤是:固相合成利拉鲁肽序列的第1‑4位氨基酸作为第一片段;固相合成利拉鲁肽序列的第5‑31位氨基酸,脱除20位Lys的侧链保护基团并偶联Pal‑γ‑Glu,作为第二片段;第一片段与第二片段偶联,合成全保护利拉鲁肽,经裂解沉淀,得到利拉鲁肽。本发明合成方法提高了粗肽纯度,极大降低了物料成本和纯化成本,利于进行工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽药物合成领域,特别涉及GLP-1受体激动素一种利拉鲁肽的合成方法。
背景技术
利拉鲁肽,英文名:Liraglutide。
肽序列为:
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的第一个长效GLP-1类似物,与人胰高糖素样肽-1(GLP-1)同源性达97%。利拉鲁肽具有降低血糖,促进胰岛细胞再生,轻微延长胃排空等多种作用,应用前景广泛。
CN 103304660的专利文献公开了一种利拉鲁肽的合成方法,固相合成N端保护的利拉鲁肽直链肽,然后合成十六烷基衍生物,脱保护除去末端保护,得到目标多肽。该方法采用氨基酸逐个偶联的方式,随着直链肽的延长,大量的疏水性保护基团加剧了分子间的缔合作用,部分活性基团被包裹其中,工艺中产生不易除去的缺陷肽,增加投料和延长时间无法根本上解决问题。
CN 102875665的专利文献公开了一种合成利拉鲁肽的方法,将利拉鲁肽分成5个片段,先合成第 1 至第 4氨基酸、第 5 至第 10 氨基酸、第 11 至第 16 氨基酸、第17至第 24 氨基酸以及第25 至第 31氨基酸,然后5个多肽片段对接合成利拉鲁肽,缩短合成周期。虽然该方法可以同时偶联5个片段,但是5个片段均需要大量的树脂,大大提高了生产成本,并且多次的裂解在产业化增加大量的操作步骤,同时也产生过多的废液。
因此,本领域迫切需要提供一种利拉鲁肽的合成方法,以解决现有利拉鲁肽合成过程中存在的杂质多,纯度和收率低,成本昂贵,操作步骤繁琐,废液过量的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在的杂质多,纯度和收率低,成本昂贵,操作步骤繁琐,废液过量,不利于工业化生产的问题,提供一种新的、利拉鲁肽的合成方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种利拉鲁肽的合成方法,其特点是,其步骤如下:
(1) 固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段,
(2) 固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸,脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Pal-γ-Glu-Otbu,作为第二片段;
(3) 第一片段与第二片段液相偶联,合成全保护利拉鲁肽,经裂解沉淀,得到利拉鲁肽。
步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂优选为2- CTC树脂。
步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团优选为催化氢化脱除的Alloc。
步骤(1) (2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂优选为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂优选为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂优选为v/v20%哌啶/DMF溶液。
步骤(1) (2)中,第一片段与第二片段全保护裂解试剂优选为v/v15%~25%(最优选20%)TFE/DCM或v/v0.05%~0.15%(最优选0.1%)TFA/DCM。最优选为v/v15%~25%(最优选20%)TFE/DCM。
步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂优选为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。最优选为DCC/HOSu组合
步骤(3)采用的裂解试剂优选为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4~6:2~4:1~3,最优选为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案步骤如下(下述技术方案中,各原料的量可以按照需要适当取用):
(1)Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备:
2-CTC树脂加入到固相反应器中,加入适量 DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Gly-OH,DIEA,DMF溶液,搅拌反应;抽干溶剂,加入甲醇/DCM溶液,封闭;DCM与甲醇交替洗涤若干次;真空干燥后,得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂;
(2)多肽片段1的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Glu(otbu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化,将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC;
将肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到TFE/DCM中,反应;收集滤液,滤液进行真空旋干;得到Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1;
(3)多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备:
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到DCM溶解,加入DCC,HOSU,冰浴条件下反应,TLC监测原料多肽片段1反应完全消失;反应液用纯水、饱和氯化钠溶液洗涤,过滤除去不溶物,滤液加入无水硫酸钠干燥;所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯;
(4)多肽片段2的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH ,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应;
取四三苯基膦钯,吗啡啉,THF加入到固相反应器中,反应,DMF洗涤,茚检结果呈阳性;
取PPal-γ-Glu-Otbu,HOBt,DIC加入DMF溶解,冰浴活化5min;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应,抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,所得树脂即为肽树脂2;
将肽树脂2加入到TFE/DCM中,反应,收集滤液,滤液进行真空旋干旋干后固体即为多肽片段2;
(5)全保护肽的制备:
将多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到多肽片段2的DCM溶液中,冰浴条件下反应,反应结束后将反应液旋干,所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽;
(6)裂解:
配制裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2,冰浴条件下加入到全保护肽中,恢复至室温继续反应,反应结束后,加入无水乙醚沉淀,离心沉淀;干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽。
与现有技术相比,本发明方法的优点是:本发明合成过程中所存在的杂质少,纯度和收率高,操作步骤简单,废液少,有利于工业化大生产,且成本低。
附图说明
图1为本发明方法的一种合成路线图;
图2为实施例10合成得到的粗肽色谱图。
具体实施方式
以下参照附图,进一步描述本发明的具体技术方案,以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明,而不构成对其权利的限制。
实施例1,一种利拉鲁肽的合成方法,其步骤如下:
(1) 固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段,
(2) 固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸,脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Pal-γ-Glu-Otbu,作为第二片段;
(3) 第一片段与第二片段液相偶联,合成全保护利拉鲁肽,经裂解沉淀,得到利拉鲁肽。
实施例2,实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与/或 (2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为v/v15%哌啶/DMF溶液。步骤(1)与/或 (2)中,第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v15%%TFE/DCM或v/v0.05%TFA/DCM。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4:2:1。
实施例3,实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与/或 (2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为v/v25%哌啶/DMF溶液。步骤(1)与/或 (2)中,第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v25%TFE/DCM或v/v0.15%TFA/DCM。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:6:4:3。
实施例4,实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与 (2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为v/v20%哌啶/DMF溶液。
步骤(1)与(2)中,第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v20%TFE/DCM或v/v0.1%TFA/DCM。
步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
实施例5:Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂30.4g(Sub=0.66mmol/g)加入到固相反应器中,加入300mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,加入Fmoc-Gly-OH 17.84g,DIEA 21.0mL,160mLDMF溶液,搅拌反应1.5h。抽干溶剂,加入10%甲醇/DCM溶液160mL,封闭0.5h。DCM与甲醇交替洗涤3次,每次160mL。真空干燥后,得到经紫外分光光度法测定Fmoc-Gly-2-CTC树脂的Sub=0.56mmol/g。
实施例6:多肽片段1的制备
称取Fmoc-Gly-2-CTC树脂17.8g,加入到固相反应器中,加入80mL DCM
溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,分别加入2次80mL v/v 20%哌啶/DMF溶液,反应5min和15min。抽干溶剂,加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Glu(otbu)-OH 12.8g,HOBt 4.86g,DIC 5.6mL,加入DMF80mL溶解,冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次80mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤3次,每次180mL,真空干燥,得到肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC。
将肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到250mL v/v 20%TFE/DCM中,反应1h。收集滤液,滤液进行真空旋干。DCM旋蒸3次,每次加入200 mL。Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1。
实施例7:多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到200mL DCM溶解,加入DCC 23.0g,HOSU12.0g,冰浴条件下反应3h,TLC监测原料多肽片段1反应完全消失。反应液用纯水,饱和氯化钠溶液,等体积各洗涤3次,过滤除去不溶物,滤液加入无水硫酸钠干燥。所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯。
实施例8:多肽片段2的制备
称取Fmoc-Gly-2-CTC树脂17.8g,加入到固相反应器中,加入80mL DCM
溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,分别加入2次80mL v/v 20%哌啶/DMF溶液,反应5min和15min。抽干溶剂,加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 19.5g,HOBt 4.86g,DIC 5.6mL,加入DMF 80mL溶解,冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次80mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应。
称取四三苯基膦钯11.6g,吗啡啉1mL,100ml THF加入到固相反应器中,反应3h,DMF洗涤3次,每次加入100mL,茚检结果呈阳性。
称取PPal-γ-Glu-Otbu 13.3g,HOBt 4.86g,DIC 5.6mL加入DMF 80mL溶解,冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应3h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次80mL。
抽干溶剂,分别加入2次80mL v/v 20%哌啶/DMF溶液,反应5min和15min。抽干溶剂,加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。DCM与甲醇交替洗涤3次,每次80mL,真空干燥,所得树脂即为肽树脂2。
将肽树脂2加入到500mL v/v 20%TFE/DCM中,反应1h。收集滤液,滤液进行真空旋干。DCM旋蒸3次,每次加入400 mL。旋干后固体即为多肽片段2。
实施例9:全保护肽的制备
将100mL的多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到150ml多肽片段2的150mLDCM溶液中,冰浴条件下反应3h。反应结束后将反应液旋干,所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽。
实施例10:裂解
配制500mL裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2,冰浴条件下加入到全保护肽中,0.5h后恢复至室温继续反应2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次,每次加入乙醚3 L。干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽,粗肽得到41g,粗肽经对照品定量为33.8g,总收率90%,纯度92.0%。
上述的合成路线参照图1,合成得到的粗肽色谱图参照图2。
Claims (9)
1.一种利拉鲁肽的合成方法,其特征在于,其步骤如下:
(1) 固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段,
(2) 固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸,脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Pal-γ-Glu-Otbu,作为第二片段;
(3) 第一片段与第二片段液相偶联,合成全保护利拉鲁肽,经裂解沉淀,得到利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。
3.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。
4.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(1)与/或 (2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为v/v15%~25%哌啶/DMF溶液。
5.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(1)与/或 (2)中,第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v15%~25%TFE/DCM或v/v0.05%~0.15%TFA/DCM。
6.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。
7.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4~6:2~4:1~3。
8.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
9.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的合成方法,其特征在于,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备:
2-CTC树脂加入到固相反应器中,加入适量 DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Gly-OH,DIEA,DMF溶液,搅拌反应;抽干溶剂,加入甲醇/DCM溶液,封闭;DCM与甲醇交替洗涤若干次;真空干燥后,得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂;
(2)多肽片段1的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Glu(otbu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化,将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC;
将肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到TFE/DCM中,反应;收集滤液,滤液进行真空旋干;得到Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1;
(3)多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备:
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到DCM溶解,加入DCC,HOSU,冰浴条件下反应,TLC监测原料多肽片段1反应完全消失;反应液用纯水、饱和氯化钠溶液洗涤,过滤除去不溶物,滤液加入无水硫酸钠干燥;所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯;
(4)多肽片段2的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH ,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应;
取四三苯基膦钯,吗啡啉,THF加入到固相反应器中,反应,DMF洗涤,茚检结果呈阳性;
取PPal-γ-Glu-Otbu,HOBt,DIC加入DMF溶解,冰浴活化5min;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应,抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,所得树脂即为肽树脂2;
将肽树脂2加入到TFE/DCM中,反应,收集滤液,滤液进行真空旋干;旋干后固体即为多肽片段2;
(5)全保护肽的制备:
将多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到多肽片段2的DCM溶液中,冰浴条件下反应,反应结束后将反应液旋干,所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽;
(6)裂解:
配制裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2,冰浴条件下加入到全保护肽中,恢复至室温继续反应,反应结束后,加入无水乙醚沉淀,离心沉淀;干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽。
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