CN107903317A - 一种利拉鲁肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利拉鲁肽的合成方法，其步骤是：固相合成利拉鲁肽序列的第1‑4位氨基酸作为第一片段；固相合成利拉鲁肽序列的第5‑31位氨基酸，脱除20位Lys的侧链保护基团并偶联Pal‑γ‑Glu，作为第二片段；第一片段与第二片段偶联，合成全保护利拉鲁肽，经裂解沉淀，得到利拉鲁肽。本发明合成方法提高了粗肽纯度，极大降低了物料成本和纯化成本，利于进行工业化放大生产。

Description

一种利拉鲁肽的合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽药物合成领域，特别涉及GLP-1受体激动素一种利拉鲁肽的合成方法。
背景技术
利拉鲁肽，英文名：Liraglutide。
肽序列为：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的第一个长效GLP-1类似物，与人胰高糖素样肽-1（GLP-1）同源性达97%。利拉鲁肽具有降低血糖，促进胰岛细胞再生，轻微延长胃排空等多种作用，应用前景广泛。
CN 103304660的专利文献公开了一种利拉鲁肽的合成方法，固相合成N端保护的利拉鲁肽直链肽，然后合成十六烷基衍生物，脱保护除去末端保护，得到目标多肽。该方法采用氨基酸逐个偶联的方式，随着直链肽的延长，大量的疏水性保护基团加剧了分子间的缔合作用，部分活性基团被包裹其中，工艺中产生不易除去的缺陷肽，增加投料和延长时间无法根本上解决问题。
CN 102875665的专利文献公开了一种合成利拉鲁肽的方法，将利拉鲁肽分成5个片段，先合成第 1 至第 4氨基酸、第 5 至第 10 氨基酸、第 11 至第 16 氨基酸、第17至第 24 氨基酸以及第25 至第 31氨基酸，然后5个多肽片段对接合成利拉鲁肽，缩短合成周期。虽然该方法可以同时偶联5个片段，但是5个片段均需要大量的树脂，大大提高了生产成本，并且多次的裂解在产业化增加大量的操作步骤，同时也产生过多的废液。
因此，本领域迫切需要提供一种利拉鲁肽的合成方法，以解决现有利拉鲁肽合成过程中存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，提供一种新的、利拉鲁肽的合成方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种利拉鲁肽的合成方法，其特点是，其步骤如下：
(1) 固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段，
(2) 固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸，脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Pal-γ-Glu-Otbu，作为第二片段；
(3) 第一片段与第二片段液相偶联，合成全保护利拉鲁肽，经裂解沉淀，得到利拉鲁肽。
步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂优选为2- CTC树脂。
步骤(2)中，第二片段中20位Lys的侧链保护基团优选为催化氢化脱除的Alloc。
步骤(1) (2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂优选为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种；所用的反应溶剂优选为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂优选为v/v20%哌啶/DMF溶液。
步骤(1) (2)中，第一片段与第二片段全保护裂解试剂优选为v/v15%～25%（最优选20%）TFE/DCM或v/v0.05%～0.15%（最优选0.1%）TFA/DCM。最优选为v/v15%～25%（最优选20%）TFE/DCM。
步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂优选为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。最优选为DCC/HOSu组合
步骤(3)采用的裂解试剂优选为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4～6:2～4:1～3，最优选为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT＝90:5:3:2。
本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其进一步优选的技术方案步骤如下（下述技术方案中，各原料的量可以按照需要适当取用）：
（1）Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备：
2-CTC树脂加入到固相反应器中，加入适量 DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH，DIEA，DMF溶液，搅拌反应；抽干溶剂，加入甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤若干次；真空干燥后，得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂；
（2）多肽片段1的制备：
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检结果呈阳性；
取Fmoc-Glu(otbu)-OH，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化，将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥，得到肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC；
将肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到TFE/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得到Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1；
（3）多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备：
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到DCM溶解，加入DCC，HOSU，冰浴条件下反应，TLC监测原料多肽片段1反应完全消失；反应液用纯水、饱和氯化钠溶液洗涤，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥；所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯；
（4）多肽片段2的制备：
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检结果呈阳性；
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH ，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应；
取四三苯基膦钯，吗啡啉，THF加入到固相反应器中，反应，DMF洗涤，茚检结果呈阳性；
取PPal-γ-Glu-Otbu，HOBt，DIC加入DMF溶解，冰浴活化5min；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应，抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检结果呈阳性，DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥，所得树脂即为肽树脂2；
将肽树脂2加入到TFE/DCM中，反应，收集滤液，滤液进行真空旋干旋干后固体即为多肽片段2；
（5）全保护肽的制备：
将多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到多肽片段2的DCM溶液中，冰浴条件下反应，反应结束后将反应液旋干，所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽；
（6）裂解：
配制裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，恢复至室温继续反应，反应结束后，加入无水乙醚沉淀，离心沉淀；干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽。
与现有技术相比，本发明方法的优点是：本发明合成过程中所存在的杂质少，纯度和收率高，操作步骤简单，废液少，有利于工业化大生产，且成本低。
附图说明
图1为本发明方法的一种合成路线图；
图2为实施例10合成得到的粗肽色谱图。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种利拉鲁肽的合成方法，其步骤如下：
(1) 固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段，
(2) 固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸，脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Pal-γ-Glu-Otbu，作为第二片段；
(3) 第一片段与第二片段液相偶联，合成全保护利拉鲁肽，经裂解沉淀，得到利拉鲁肽。
实施例2，实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中：步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中，第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与/或 (2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种；所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂为v/v15%哌啶/DMF溶液。步骤(1)与/或 (2)中，第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v15%%TFE/DCM或v/v0.05%TFA/DCM。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4:2:1。
实施例3，实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中：步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中，第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与/或 (2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种；所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂为v/v25%哌啶/DMF溶液。步骤(1)与/或 (2)中，第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v25%TFE/DCM或v/v0.15%TFA/DCM。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:6:4:3。
实施例4，实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中：步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中，第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与 (2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种；所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂为v/v20%哌啶/DMF溶液。
步骤(1)与(2)中，第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v20%TFE/DCM或v/v0.1%TFA/DCM。
步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
实施例5：Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂30.4g(Sub=0.66mmol/g)加入到固相反应器中，加入300mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH 17.84g，DIEA 21.0mL，160mLDMF溶液，搅拌反应1.5h。抽干溶剂，加入10%甲醇/DCM溶液160mL，封闭0.5h。DCM与甲醇交替洗涤3次，每次160mL。真空干燥后，得到经紫外分光光度法测定Fmoc-Gly-2-CTC树脂的Sub=0.56mmol/g。
实施例6：多肽片段1的制备
称取Fmoc-Gly-2-CTC树脂17.8g，加入到固相反应器中，加入80mL DCM
溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，分别加入2次80mL v/v 20%哌啶/DMF溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Glu(otbu)-OH 12.8g，HOBt 4.86g，DIC 5.6mL，加入DMF80mL溶解，冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入DMF洗涤3次，每次80mL。
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤3次，每次180mL，真空干燥，得到肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC。
将肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到250mL v/v 20%TFE/DCM中，反应1h。收集滤液，滤液进行真空旋干。DCM旋蒸3次，每次加入200 mL。Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1。
实施例7：多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到200mL DCM溶解，加入DCC 23.0g，HOSU12.0g，冰浴条件下反应3h，TLC监测原料多肽片段1反应完全消失。反应液用纯水，饱和氯化钠溶液，等体积各洗涤3次，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥。所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯。
实施例8：多肽片段2的制备
称取Fmoc-Gly-2-CTC树脂17.8g，加入到固相反应器中，加入80mL DCM
溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，分别加入2次80mL v/v 20%哌啶/DMF溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 19.5g，HOBt 4.86g，DIC 5.6mL，加入DMF 80mL溶解，冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入DMF洗涤3次，每次80mL。
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应。
称取四三苯基膦钯11.6g，吗啡啉1mL，100ml THF加入到固相反应器中，反应3h，DMF洗涤3次，每次加入100mL，茚检结果呈阳性。
称取PPal-γ-Glu-Otbu 13.3g，HOBt 4.86g，DIC 5.6mL加入DMF 80mL溶解，冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应3h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入DMF洗涤3次，每次80mL。
抽干溶剂，分别加入2次80mL v/v 20%哌啶/DMF溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。DCM与甲醇交替洗涤3次，每次80mL，真空干燥，所得树脂即为肽树脂2。
将肽树脂2加入到500mL v/v 20%TFE/DCM中，反应1h。收集滤液，滤液进行真空旋干。DCM旋蒸3次，每次加入400 mL。旋干后固体即为多肽片段2。
实施例9：全保护肽的制备
将100mL的多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到150ml多肽片段2的150mLDCM溶液中，冰浴条件下反应3h。反应结束后将反应液旋干，所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽。
实施例10：裂解
配制500mL裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.5h后恢复至室温继续反应2.5h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次，每次加入乙醚3 L。干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽，粗肽得到41g，粗肽经对照品定量为33.8g，总收率90%，纯度92.0%。
上述的合成路线参照图1，合成得到的粗肽色谱图参照图2。

Claims (9)

1.一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于，其步骤如下：
(1) 固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段，
(2) 固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸，脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Pal-γ-Glu-Otbu，作为第二片段；
(3) 第一片段与第二片段液相偶联，合成全保护利拉鲁肽，经裂解沉淀，得到利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。
3.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。
4.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(1)与/或 (2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种；所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂为v/v15%～25%哌啶/DMF溶液。
5.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(1)与/或 (2)中，第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v15%～25%TFE/DCM或v/v0.05%～0.15%TFA/DCM。
6.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。
7.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4～6:2～4:1～3。
8.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(3)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
9.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于，其具体步骤如下：
（1）Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备：
2-CTC树脂加入到固相反应器中，加入适量 DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH，DIEA，DMF溶液，搅拌反应；抽干溶剂，加入甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤若干次；真空干燥后，得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂；
（2）多肽片段1的制备：
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检结果呈阳性；
取Fmoc-Glu(otbu)-OH，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化，将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥，得到肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC；
将肽树脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到TFE/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得到Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1；
（3）多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备：
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到DCM溶解，加入DCC，HOSU，冰浴条件下反应，TLC监测原料多肽片段1反应完全消失；反应液用纯水、饱和氯化钠溶液洗涤，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥；所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯；
（4）多肽片段2的制备：
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检结果呈阳性；
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH ，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应；
取四三苯基膦钯，吗啡啉，THF加入到固相反应器中，反应，DMF洗涤，茚检结果呈阳性；
取PPal-γ-Glu-Otbu，HOBt，DIC加入DMF溶解，冰浴活化5min；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应，抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检结果呈阳性，DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥，所得树脂即为肽树脂2；
将肽树脂2加入到TFE/DCM中，反应，收集滤液，滤液进行真空旋干；旋干后固体即为多肽片段2；
（5）全保护肽的制备：
将多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到多肽片段2的DCM溶液中，冰浴条件下反应，反应结束后将反应液旋干，所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽；
（6）裂解：
配制裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，恢复至室温继续反应，反应结束后，加入无水乙醚沉淀，离心沉淀；干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽。
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