CN108034004A - 一种索玛鲁肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种索玛鲁肽的合成方法。该方法先固相合成索玛鲁肽序列的第1‑4位氨基酸作为第一片段;固相合成索玛鲁肽序列的第5‑31位氨基酸,脱除20位Lys的侧链保护基团并依次偶联,作为第二片段;片段一与片段二偶联合成全保护索玛鲁肽,经裂解沉淀,得到索玛鲁肽。本发明方法提高了粗肽纯度,极大降低了物料成本和纯化成本,利于进行工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽药物合成领域,特别涉及GLP-1受体激动素一种索玛鲁肽的合成方法。
背景技术
中文名:索玛鲁肽
英文名:Sermaglutide
肽序列为:
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG2-PEG2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
索玛鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的新型长效GLP-1类似物,从氨基酸序列上看,肽序2位为非天然氨基酸氨基异丁酸,肽序20位的Lys侧链氨基经过了PEG、γ-Glu和十八烷二酸的修饰。与利拉鲁肽相比,修饰后的索玛鲁肽亲水性增强,抑制DPP-4酶的水解,延长生物半衰期,长效降低血糖,促进胰岛细胞再生,延长胃排空等多种作用,应用前景广泛。
CN 201511027176的专利文献公开了索玛鲁肽的制备方法,固相逐一合成索玛鲁肽直链肽,合成侧链修饰基团,脱去Lys的保护基,并偶联侧链修饰基团,最终裂解得到该多肽产物。该方法采用氨基酸逐个偶联的方式,随着直链肽的延长,大量的疏水性保护基团加剧了分子间的缔合作用,部分活性基团被包裹其中,直连肽的偶联会异常困难,工艺中产生不易除去的缺陷肽,增加投料和延长时间无法从根本上解决问题。
CN 201610926972的专利文献公开了一种合成索玛鲁肽的固相合成方法,同样采用的是逐一偶联的办法。
因此,本领域迫切需要提供一种索玛鲁肽的合成方法,以解决现有索玛鲁肽合成过程中存在的杂质多,纯度和收率低,成本昂贵,操作步骤繁琐,废液过量的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在的杂质多,纯度和收率低,成本昂贵,操作步骤繁琐,不利于工业化生产的问题,提供一种新的收率高、纯度高的索玛鲁肽的合成方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种索玛鲁肽的合成方法,其特点是,其步骤如下:
(1) 固相合成索玛鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段,
(2) 固相合成索玛鲁肽序列的第5-31位氨基酸,脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu(-PEG-PEG-OH)-OtBu,并作为第二片段;
(3) 第一片段与第二片段液相偶联,合成全保护直链肽;
(4) 经裂解沉淀得到索玛鲁肽。
本发明索玛鲁肽的合成方法中,进一步优选的技术方案是:
步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。
步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。
步骤(1)、(2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为15%~25% v/v(最优选为v/v20%)哌啶/DMF(v/v)溶液。
步骤(1)、 (2)中,第一片段与第二片段全保护裂解试剂为15%~25% v/v TFE/DCM或0.05%~0.15% v/v(优选0.1%)的 TFA/DCM。最优选为v/v20%TFE/DCM。
步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。优选为DCC/HOSu组合。
步骤(4)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4~6:2~4:1~3。最优选为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
本发明所述的索玛鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案的步骤具体如下:
(1)Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备:
取2-CTC树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Gly-OH,DIEA,DMF溶液,搅拌反应;抽干溶剂,加入甲醇/DCM溶液,封闭;DCM与甲醇交替洗涤;真空干燥后,得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂;
(2)多肽片段1的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Glu(otbu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤;真空干燥,得到肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC;
将肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到TFE/DCM中,反应;收集滤液,滤液进行真空旋干;得到Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1;
(3)多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备:
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到DCM溶解,加入DCC,HOSU,冰浴条件下反应,TLC监测原料多肽片段1反应完全消失;反应液用纯水,氯化钠溶液,等体积洗涤,过滤除去不溶物,滤液加入无水硫酸钠干燥;所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯;
(4)多肽片段2的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应,抽干溶剂,加入DMF洗涤4次;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Arg(Pbf)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应;
取四三苯基膦钯,吗啡啉,THF加入到固相反应器中,反应,DMF洗涤,茚检结果呈阳性;
取Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu(-PEG-PEG-OH)-OtBu,HOBt,DIC加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;DCM与甲醇交替洗涤;真空干燥,所得树脂即为肽树脂2;
将肽树脂2加入到TFE/DCM中,反应;收集滤液,滤液进行真空旋干;旋干后固体即为多肽片段2;
(5)全保护肽的制备:
将多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到多肽片段2的DCM溶液中,冰浴条件下反应;反应结束后将反应液旋干,所得产品即为索玛鲁肽的全保护肽;
(6)裂解:
配制裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2,冰浴条件下加入到全保护肽中,恢复至室温继续反应,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥后所得产品即为索玛鲁肽粗肽。
与现有技术相比,本发明方法提高了粗肽纯度,极大降低了物料成本和纯化成本,利于进行工业化放大生产。
附图说明
图1为本发明方法的一种合成路线图;
图2为实施例9合成得到的粗肽色谱图。
具体实施方式
以下参照附图,进一步描述本发明的具体技术方案,以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明,而不构成对其权利的限制。
实施例1,一种索玛鲁肽的合成方法,其步骤如下:
(1) 固相合成索玛鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段;
(2) 固相合成索玛鲁肽序列的第5-31位氨基酸,脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu(-PEG-PEG-OH)-OtBu,并作为第二片段;
(3) 第一片段与第二片段液相偶联,合成全保护直链肽;
(4) 经裂解沉淀得到索玛鲁肽。
实施例2,实施例1所述的索玛鲁肽的合成方法中:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与/或(2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为15% v/v的哌啶/DMF溶液。步骤(1)与/或(2)中,第一片段与第二片段全保护裂解试剂为15% v/v TFE/DCM或0.05% v/v的TFA/DCM。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(4)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4:2:1。
实施例3,实施例1所述的索玛鲁肽的合成方法中:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与/或(2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为25% v/v的哌啶/DMF溶液。步骤(1)与/或(2)中,第一片段与第二片段全保护裂解试剂为25% v/v TFE/DCM或0.15% v/v的TFA/DCM。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(4)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90: 6: 4: 3。
实施例4,实施例1所述的索玛鲁肽的合成方法中:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。步骤(1)与/或(2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为20% v/v的哌啶/DMF溶液。步骤(1)与/或(2)中,第一片段与第二片段全保护裂解试剂为20% v/v TFE/DCM或0.01% v/v的TFA/DCM。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。步骤(4)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
实施例4:Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备
称取2-CTC树脂30.4g(Sub=0.66mmol/g)加入到固相反应器中,加入300mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,加入Fmoc-Gly-OH 17.84g,DIEA 21.0mL,160mLDMF溶液,搅拌反应1.5h。抽干溶剂,加入10%甲醇/DCM溶液160mL,封闭0.5h。DCM与甲醇交替洗涤3次,每次160mL。真空干燥后,得到经紫外分光光度法测定Fmoc-Gly-2-CTC树脂的Sub=0.56mmol/g。
实施例5:多肽片段1的制备
称取Fmoc-Gly-2-CTC树脂17.8g,加入到固相反应器中,加入80mL DCM
溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,分别加入2次80mL v/v 20%哌啶/DMF溶液,反应5min和15min。抽干溶剂,加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Glu(otbu)-OH 12.8g,HOBt 4.86g,DIC 5.6mL,加入DMF80mL溶解,冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次80mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤3次,每次180mL,真空干燥,得到肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC。
将肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到250mL v/v 20%TFE/DCM中,反应1h。收集滤液,滤液进行真空旋干。DCM旋蒸3次,每次加入200 mL。Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1。
实施例6:多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到200mL DCM溶解,加入DCC 23.0g,HOSU12.0g,冰浴条件下反应3h,TLC监测原料多肽片段1反应完全消失。反应液用纯水,氯化钠溶液,等体积洗涤3次,过滤除去不溶物,滤液加入无水硫酸钠干燥。所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯。
实施例7:多肽片段2的制备
称取Fmoc-Gly-2-CTC树脂17.8g,加入到固相反应器中,加入80mL DCM
溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,分别加入2次80mL 20%哌啶/DMF(v/v)溶液,反应5min和15min。抽干溶剂,加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 19.5g,HOBt 4.86g,DIC 5.6mL,加入DMF 80mL溶解,冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次80mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应。
称取四三苯基膦钯11.6g,吗啡啉1mL,100ml THF加入到固相反应器中,反应3h,DMF洗涤3次,每次加入100mL,茚检结果呈阳性。
称取Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu(-PEG-PEG-OH)-OtBu 24.5g,HOBt4.86g,DIC 5.6mL加入DMF 80mL溶解,冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应3h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次80mL。
抽干溶剂,分别加入2次80mL 20%哌啶/DMF(v/v)溶液,反应5min和15min。抽干溶剂,加入DMF 80mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。DCM与甲醇交替洗涤3次,每次80mL,真空干燥,所得树脂即为肽树脂2。
将肽树脂2加入到500mL v/v 20%TFE/DCM中,反应1h。收集滤液,滤液进行真空旋干。DCM旋蒸3次,每次加入400 mL。旋干后固体即为多肽片段2。
实施例8:全保护肽的制备
将100mL的多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到150ml多肽片段2的150mLDCM溶液中,冰浴条件下反应3h。反应结束后将反应液旋干,所得产品即为索玛鲁肽的全保护肽。
实施例9:裂解
配制500mL裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2,冰浴条件下加入到全保护肽中,0.5h后恢复至室温继续反应2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次,每次加入乙醚3 L。干燥后所得产品即为索玛鲁肽粗肽,粗肽得到45g,粗肽经对照品定量为36.6g,总收率89%,纯度90.2%。
以上的合成方法路线参照图1,合成得到的粗肽色谱图参照图2。
Claims (9)
1.一种索玛鲁肽的合成方法,其特征在于,其步骤如下:
(1) 固相合成索玛鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段;
(2) 固相合成索玛鲁肽序列的第5-31位氨基酸,脱除20位Lys 的侧链保护基团并偶联Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu(-PEG-PEG-OH)-OtBu,并作为第二片段;
(3) 第一片段与第二片段液相偶联,合成全保护直链肽;
(4) 经裂解沉淀得到索玛鲁肽。
2.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(1)中,第一片段与第二片段所用的树脂为2- CTC树脂。
3.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(2)中,第二片段中20位Lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的Alloc。
4.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(1)与/或(2)中,合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂为15%~25% v/v的哌啶/DMF溶液。
5.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(1)与/或(2)中,第一片段与第二片段全保护裂解试剂为15%~25% v/v TFE/DCM或0.05%~0.15% v/v的 TFA/DCM。
6.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为DCC/HOSu组合或EDC·HCl/HOSU组合。
7.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(4)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4~6:2~4:1~3。
8.根据权利要求7所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:步骤(4)采用的裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。
9.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法,其特征在于,其步骤具体如下:
(1)Fmoc-Gly-2-CTC树脂的制备:
取2-CTC树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Gly-OH,DIEA,DMF溶液,搅拌反应;抽干溶剂,加入甲醇/DCM溶液,封闭;DCM与甲醇交替洗涤;真空干燥后,得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂;
(2)多肽片段1的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Glu(otbu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤;真空干燥,得到肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC;
将肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到TFE/DCM中,反应;收集滤液,滤液进行真空旋干;得到Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-OH即为多肽片段1;
(3)多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备:
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到DCM溶解,加入DCC,HOSU,冰浴条件下反应,TLC监测原料多肽片段1反应完全消失;反应液用纯水,氯化钠溶液,等体积洗涤,过滤除去不溶物,滤液加入无水硫酸钠干燥;所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯;
(4)多肽片段2的制备:
取Fmoc-Gly-2-CTC树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应,抽干溶剂,加入DMF洗涤4次;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Arg(Pbf)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应;
取四三苯基膦钯,吗啡啉,THF加入到固相反应器中,反应,DMF洗涤,茚检结果呈阳性;
取Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu(-PEG-PEG-OH)-OtBu,HOBt,DIC加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;DCM与甲醇交替洗涤;真空干燥,所得树脂即为肽树脂2;
将肽树脂2加入到TFE/DCM中,反应;收集滤液,滤液进行真空旋干;旋干后固体即为多肽片段2;
(5)全保护肽的制备:
将多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的DCM溶液加入到多肽片段2的DCM溶液中,冰浴条件下反应;反应结束后将反应液旋干,所得产品即为索玛鲁肽的全保护肽;
(6)裂解:
配制裂解试剂为TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2,冰浴条件下加入到全保护肽中,恢复至室温继续反应,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥后所得产品即为索玛鲁肽粗肽。
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