CN113135991A - 一种制备索玛鲁肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备索玛鲁肽的方法，该方法包括：按照索玛鲁肽肽序，依次偶联氨基酸或肽片段，得到索玛鲁肽树脂，然后裂解和纯化得到索玛鲁肽。其中包括固相合成含N(保护基)‑Gly的索玛鲁肽S1‑S4片段树脂，经裂解和纯化作为第一个肽片段；合成索玛鲁肽S20带侧链基团的赖氨酸，作为第二个肽片段。本发明采用片段和逐步合成相结合的固相合成法，通过制备含N(保护基)‑Gly的索玛鲁肽S1‑S4全保护肽片段，作为关键起始物料应用于索玛鲁肽固相合成中，显著降低了D‑His消旋杂质、+Gly杂质和分子内环化副反应杂质的产生，降低了粗品纯化的难度，提高了索玛鲁肽的纯度和收率，降低了合成成本，有利于索玛鲁肽的工业化大生产。

Description

一种制备索玛鲁肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种制备索玛鲁肽的方法。
技术背景
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由人肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌，具有降低血糖浓度的功效，被用于II型糖尿病的治疗。然而天然GLP-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解。
索玛鲁肽，英文名称为Semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，用于治疗II型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年12月获得FDA批准上市。索玛鲁肽的Lys侧链经PEG、Glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时N端第2位的Ala突变为Aib后，有效的避免了被DPP-IV酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次，目前该药物的口服剂型也正在研制当中。索玛鲁肽的CAS号为910463-68-2，分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.64g/mol，肽序列为：
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。
目前已报道的索玛鲁肽的制备方法大致分为两类：一类是把含有侧链的Lys作为片段直接接入索玛鲁肽主链完成合成，专利CN104356224A公开了一种采用液相法在Lys的ε-NH2上接上侧链，随后在树脂上逐步缩合氨基酸制备索玛鲁肽的方法。另一类是分别逐个完成索玛鲁肽主链和侧链的偶联，专利CN201511027176公开了在固相逐步合成索玛鲁肽直链肽，合成侧链修饰基团，脱去Lys的保护基，并偶联侧链修饰基团，最终裂解得到该多肽产物。由于索玛鲁肽的序列较长且有较多的疏水氨基酸，采用氨基酸逐步缩合的方法合成时，易形成折叠，导致树脂收缩严重，延长反应时间，进而粗肽中产生较多与产品性质极为接近的杂质，如[D-His]的消旋杂质H-D-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecane-dioic)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；+Gly杂质H-His-Aib-Glu-Gly-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；[D-His]消旋杂质与索玛鲁肽目标肽的理化性质相近，极大增加了索玛鲁肽产品的分离纯化难度，导致产品收率大大降低。因此，迫切需要一种纯度和收率高，合成成本低的索玛鲁肽的合成方法。
发明内容
为了解决现有索玛鲁肽合成过程中所存在的D-His消旋杂质和+Gly杂质难控制，纯度和收率低，不利于工业化生产的问题，本发明提供了一种片段和逐步合成相结合的制备索玛鲁肽的方法。该方法能有效减少D-His消旋杂质、+Gly杂质和分子内环化副反应杂质，提高索玛鲁肽的纯度及收率，有利于索玛鲁肽的大批量生产。
为了实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
一种制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，通过固相合成得到索玛鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到索玛鲁肽粗肽，纯化、冻干后得到索玛鲁肽精肽，其中1～4位采用的是单体R1-His(R2)-Aib-Glu(OR3)-N(R4)-Gly-R5，其结构为：
Figure BDA0002578034040000021
R1是氢或氨基保护基团，
R2是氢或氨基保护基团，
R3是酯的保护基团，
R4选自H、Hmb、Dmb、Tmob，
R5选自羟基、氯、OBt、OSu或OPfp。
作为优选，R1选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt。
作为优选，R2选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt。
作为优选，R3选自tBu、Bzl。
作为优选，R4选自Hmb、Dmb、Tmob。
作为优选，R5选自羟基、OBt、OSu、OPfp。
在一些实施方案中，R1是Boc，R2是Trt，R3是tBu，R4是Hmb，R5是羟基。
作为优选，所述方法还包括5～6位采用的是单体R6-Thr(R7)-Phe-R8，其结构为：
Figure BDA0002578034040000031
R6是氢或氨基保护基团,
R7是氢或羟基保护基团,
R8选自羟基、氯、OBt、OSu或OPfp。
作为优选，R6选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt。
作为优选，R7是tBu或Bzl。
作为优选，R8选自羟基、OBt、OSu、OPfp。
作为优选，R6是Fmoc，R7是tBu，R8是羟基。
申请人意外地发现，在索玛鲁肽的制备中，20位采用单体
Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH，能够使肽中间体被容易地插入SPPS中，能够使氨基端氨基酸更容易与其反应，且能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高利拉鲁肽粗肽收率、纯度。在一些实施方案中，20位采用的是单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH，1～4位采用的是单体Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-OH，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
本发明通过采用片段和逐步合成相结合的固相合成法，制备含(N-保护基)Gly的索玛鲁肽1-4位全保护肽片段，并且将其作为关键起始物料应用于索玛鲁肽固相合成中，极大降低了D-His消旋杂质、+Gly杂质和分子内环化副反应杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了索玛鲁肽的纯度和收率，降低了合成成本,有利于工业化大生产。
附图说明
图1为实施例8合成的索玛鲁肽1-4位肽片段的HPLC色谱图
图2为实施例18制备的索玛鲁肽粗肽的HPLC色谱图
图3为实施例21制备的索玛鲁肽精肽的HPLC色谱图
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表中：
Fmoc 芴甲氧羰基
Fmoc-AA 芴甲氧羰基保护的氨基酸
TBTU 2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯
HOBT 1-羟基苯并三唑
DIEA: N,N-二异丙基乙胺
DIC: N,N-二异丙基碳二亚胺
tBu 叔丁基
BOC 叔丁氧羰基
His 组氨酸
Glu 谷氨酸
Gly 甘氨酸
DMF N,N-二甲基甲酰胺
TFE 三氟乙醇
DCM 二氯甲烷
实施例1替代度为0.80mmol/g Fmoc-N(Hmb)-Gly-CTC树脂的制备
A.将10g替代度为1.20mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入50ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取10.40g Fmoc-N(Hmb)-Gly-OH和3.89HOBT于烧杯中，加入50ml DMF和4.76ml DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，加入50ml DMF,滤除DMF。加入4ml甲醇和4.76ml DIEA，继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇洗3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到12.20g Fmoc-N(Hmb)-Gly-CTC树脂，经检测替代度为0.80mmol/g。
实施例2替代度为1.10mmol/gFmoc-N(Dmb)-Gly-CTC树脂的制备
A.将10g替代度为1.20mmol/g 2-CTC树脂加入反应釜中，加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入50ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取10.73g Fmoc-N(Dmb)-Gly-OH和3.89g HOBT于烧杯中，加入50ml DMF和4.76ml DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应8h。待反应结束后，加入50ml DMF,滤除DMF。加入4ml甲醇和4.76ml DIEA，继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇洗3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到10.75g Fmoc-N(Dmb)-Gly-CTC树脂，经检测替代度为1.10mmol/g。
实施例3替代度为0.90mmol/g Fmoc-N(Tmob)-Gly-CTC树脂
A.将10g替代度为1.20mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入50ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取11.46g Fmoc-N(Tmob)-Gly-OH和3.89g HOBT于烧杯中，加入50ml DMF和4.76ml DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应6h。待反应结束后，加入50ml DMF,滤除DMF。加入4ml甲醇和4.76ml DIEA，继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇洗3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到12.30g Fmoc-N(Tmob)-Gly-CTC树脂，经检测替代度为0.90mmol/g。
实施例4替代度为1.05mmol/g Fmoc-Gly-CTC树脂
A.将10g替代度为1.20mmol/g的2-CTC树脂加入反应釜中，加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入50ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取7.14gFmoc-Gly-OH和3.89g HOBT于烧杯中，加入50ml DMF和4.76ml DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应6h。待反应结束后，加入50ml DMF,滤除DMF。加入4ml甲醇和4.76ml DIEA，继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇洗3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到11.10g Fmoc-Gly-CTC树脂，经检测替代度为1.05mmol/g。
实施例5索玛鲁肽S1-S4位肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-CTC树脂的制备
A.将实施例1中得到的Fmoc-N(Hmb)-Gly-CTC树脂全部倒入反应釜中，用50ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液50ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入50ml DMF，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液50ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入50ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次50ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取8.31g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.96gDIC和2.64gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液50ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入50ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次50ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-CTC树脂。
C.按如上A的去保护方法和B的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH的偶联。最后用二氯甲烷洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-CTC树脂17.50g。
实施例6索玛鲁肽S1-S4位肽树脂Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Dmb)-Gly-CTC树脂的制备
A.将实施例2中得到的Fmoc-N(Dmb)-Gly-CTC树脂全部倒入反应釜中，用50ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液50ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入50ml DMF，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液50ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入50ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次50ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取10.06g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、3.58g DIC和3.20g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液50ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入50ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次50ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Glu(OtBu)-N(Dmb)-Gly-CTC树脂。
C.按如上A的去保护方法和B的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH的偶联。最后用二氯甲烷洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Dmb)-Gly-CTC树脂19.22g。
实施例7索玛鲁肽S1-S4位肽树脂Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-CTC树脂的制备
A.将实施例4中得到的Fmoc-Gly-CTC树脂全部倒入反应釜中，用50ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液50ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入50ml DMF，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液50ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入50ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次50ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取9.92g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、3.53gDIC和3.15gHOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液50ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入50ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次50ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-CTC树脂。
C.按如上A的去保护方法和B的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸，即：Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt)-OH的偶联。最后用二氯甲烷洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-CTC树脂18.92g。实施例8索玛鲁肽S1-S4位肽片段Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-OH的制备1
裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200mL裂解液中加入实施例5所得的全保护肽树脂17.50g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-OH粗品8.50g。全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-OH粗品经纯化后，样品中D-His消旋杂质的含量为0.27％，HPLC色谱图如图1所示
实施例9索玛鲁肽S1-S4位肽片段Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Dmb)-Gly-OH的制备
裂解液配比为TFE:DCM＝1:6(体积比)，于15℃条件下，向100ml裂解液中加入实施例6所得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用50mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的500mL异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚100ml，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Dmb)-Gly-OH粗品5.20g。全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Dmb)-Gly-OH粗品经纯化后，样品中D-His消旋杂质的含量为0.31％，HPLC色谱图同实施例8。
实施例10索玛鲁肽S1-S4位肽片段Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的制备
裂解液配比为TFE:DCM＝1:2(体积比)，于15℃条件下，向400mL裂解液中加入实施例7所得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用200ml的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1.5L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚400mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH粗品5.85g。全保护四肽Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH粗品经纯化后，样品中D-His消旋杂质的含量为0.25％。实施例11全保护S5-S6片段为Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
A.Fmoc-Thr(tBu)-OH活泼酯的制备
将50ml单口瓶放置在低温恒温搅拌反应器中，加入1.99g Fmoc-Thr(tBu)-OH和15ml DCM溶剂，再加入1.10g五氟苯酚。在0℃下搅拌溶解澄清后，滴加溶于5ml DCM中的1.34g DCC溶液。10min滴加完毕后，升温至25℃反应3h。用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，抽滤，加入5ml DCM进行洗涤，合并滤液，旋蒸除去溶剂获得粘稠物体2.70g。
B.Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH的制备
将25ml单口瓶放置低温恒温搅拌反应器中，加入0.76gH-Phe-OH、6mL 0.087g/ml碳酸钠水溶液和12ml(v/v＝1:1)THF/H2O混合溶液，降温至0℃。称取1.36g步骤A获得Fmoc-Thr(tBu)-OH活泼酯溶于6ml THF中，并滴加到单口瓶中。5min滴加完毕后，升温至25℃反应4h。用TLC监测反应(石油醚:乙酸乙酯＝1:1,额外加入2滴醋酸)。反应完成后，加入柠檬酸水溶液调节PH＝5，分别用乙酸乙酯溶剂萃取2次，每次20ml。收集有机相，用柠檬酸水溶液洗涤2次，每次20ml。用20ml饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥后，旋蒸除溶剂获得粘稠固体。加入4ml(v/v＝1:1)石油醚/异丙醚混合溶剂，打浆30min，抽滤获得黄色粘稠物1.15g。
实施例12Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH的制备
A.将150g替代度为1.05mmol/g 2-CTC树脂加入反应釜中，加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入500ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取121.44g Fmoc-AEEA-OH于烧杯中，加入500ml DMF和76.18ml DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入25ml甲醇和250ml DMF的混合溶液，40ml DIEA和250ml DMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到140.20mmol Fmoc-AEEA-CTC树脂，经检测替代度为0.73mmol/g。
D.将步骤C得到的Fmoc-AEEA-CTC树脂全部倒入反应釜中，用500ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF 500ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液500ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入DMF 500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
E.依次称取108.07g Fmoc-AEEA-OH、35.42g DIC和39.59g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液500ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF 500ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次500ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-AEEA-AEEA-CTC树脂。
F.按如上步骤D的去保护方法和步骤E的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联氨基酸Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯。最后用二氯甲烷洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用醇3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到Octadecanedioic-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-CTC树脂255.40g。
G.裂解液配比为TFE:DCM＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向300mL裂解液中加入步骤F中所得的CTC树脂的全保护肽树脂30g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100mL的DCM洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的2L异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚300mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得Octadecanedioic-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-OH粗品11.65g。
H.将步骤G得到的Octadecanedioic-γ-Glu(OtBu)-AEEA-AEEA-OH粗品5g，溶解于10mLDCM中，加入2.2g五氟苯酚。称取2.4g DCC，溶于10mL DCM中，将DCC溶液缓慢滴加到反应溶液中，搅拌反应1.0h，TLC检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥DCM溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中。称取6.08gFmoc-Lys-OH.HCl溶解于乙腈/水(乙腈/水＝1/2)中，加入7.5mL DIEA，搅拌15分钟。将以上的反应溶液缓慢滴加到Fmoc-Lys-OH溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调pH值约为6，加入少量DCM萃取。经纯化得到Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH 2.85g。
实施例13替代度为0.30mmol/g Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
A.将20g替代度为1.0mmol/g Wang树脂加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入100ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取17.84g Fmoc-Gly-OH和9.72g HOBT于烧杯中，加入100ml DMF和9.90mlDIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得Wang树脂中，加入0.36g DMAP，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，加入醋酸酐18.8ml，继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到27.50g Fmoc-Gly-Wang树脂，经检测替代度为0.30mmol/g。
实施例14替代度为0.45mmol/g Fmoc-Gly-CTC树脂的制备
A.将10g替代度为1.05mmol/g的CTC树脂加入反应釜中，加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入50ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入50ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
B.称取9.37gFmoc-Gly-OH和5.11g HOBT于烧杯中，加入50ml DMF和5.21ml DIEA，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤A所得CTC树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除DMF。加入5ml甲醇和50ml DMF的混合溶液，5.73ml DIEA和50ml DMF的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用DMF洗5次，每次50ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次50ml；再用二氯甲烷洗2次，每次50ml；最后用甲醇洗3次，每次50ml，直至树脂充分分散开。
C.将步骤B所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到13.10g Fmoc-Gly-CTC树脂，经检测替代度为0.45mmol/g。
实施例15全保护索玛鲁肽肽树脂的制备1
A.将实施例13中得到的20g Fmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF 100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入100ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次100ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取7.98g Fmoc-Arg(Pbf)-OH、2.32g TBTU和0.98g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入1.00mL DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例12所得Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例11所得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和实施例8所得的Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-OH的偶联。其中，偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Phe-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH时采用COMU/DIEA偶联体系和NMP/DMSO＝1:1的混合溶剂。最后用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂49.50g。
实施例16全保护索玛鲁肽肽树脂的制备2
A.将20g 0.30mmol/g Fmoc-Gly-Wang树脂倒入反应釜中，用100ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF 100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入100ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次100ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取7.98g Fmoc-Arg(Pbf)-OH、2.32g TBTU和0.98g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入1.00mL DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例12所得Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例11所得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和实施例10所得的Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH的偶联。其中，偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Phe-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH时采用COMU/DIEA偶联体系和NMP/DMSO＝1:1的混合溶剂。最后用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂52.36g。
实施例17全保护索玛鲁肽肽树脂的制备3
A.将实施例14中得到的10g Fmoc-Gly-CTC树脂倒入反应釜中，用100ml DCM溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入DMF 100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/DMF溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入100ml DMF，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次100ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用PH试纸检测滤液，结果显示PH在6.5-7.0为合格。
B.依次称取5.99g Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1.74g TBTU和0.74g HOBT于干净的1L烧杯中，加入体积比为1:1的DMF/DCM溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入0.75mL DIEA，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入DMF100ml，混合5min后，抽干。重复用DMF洗涤5次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到Fmoc-Arg-Gly-Wang树脂。
C.按如上步骤A的去保护方法和步骤B的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、实施例12所得Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、实施例11所得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH和实施例9所得的Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Dmb)-Gly-OH的偶联。其中，偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH时采用DIC/Cl-HOBt偶联体系和DMF溶剂；偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH时采用TBTU/HOBt/DIEA偶联体系和DCM溶剂；偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH时采用TBTU/Cl-HOBt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Phe-OH时采用TBTU/HOAt/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ala-OH时采用TBTU/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH时采用PyBop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH时采用PyAop/DIEA偶联体系；偶联Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH时采用COMU/DIEA偶联体系和NMP/DMSO＝1:1的混合溶剂。最后用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂48.35g。
实施例18索玛鲁肽粗品的制备1
裂解液配比为TFA:EDT:DMS:苯甲硫醚:Tis:H2O＝80:4:4:4:4:4(体积比)，于15℃条件下，向100ml裂解液中加入实施例15中所得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用50mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的200mL异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得索玛鲁肽粗品5.10g，HPLC纯度为68.56％，HPLC色谱图如图2所示。
实施例19索玛鲁肽粗品的制备2
裂解液配比为TFA:EDT:DMS:苯甲硫醚:Tis:H2O＝90:2:2:2:2:2(体积比)，于15℃条件下，向100ml裂解液中加入实施例16所得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的200mL异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得索玛鲁肽粗品5.85g，HPLC纯度为61.50％。
实施例20索玛鲁肽粗品的制备3
裂解液配比为TFA:EDT:DMS:苯甲硫醚:Tis:H2O＝90:2:2:2:2:2(体积比)，于15℃条件下，向100ml裂解液中加入实施例17所得的全保护肽树脂10g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的200mL异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200mL，得到白色固体粉末，先用氮气吹干4h后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得索玛鲁肽粗品5.45g，HPLC纯度为73.21％，HPLC色谱图同实施例18。
实施例21索玛鲁肽精肽的制备
将实施例18所得的5.10g的索玛鲁肽粗品溶于稀氨水，再用磷酸调节索玛鲁肽粗品溶液的pH为8.0～8.5，过滤得到索玛鲁肽粗肽溶液。以八烷基键合硅胶为固定相、以氯化铵和乙腈为流动相对索玛鲁肽粗肽溶液进行HPLC线性梯度洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的一次纯化溶液。索玛鲁肽的一次纯化溶液以八烷基键合硅胶为固定相、用磷酸调节pH的磷酸二氢钾水溶液，乙腈与异丙醇混合溶剂为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的二次纯化溶液。索玛鲁肽的二次纯化液以八烷基键合硅胶为固定相、用碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得索玛鲁肽精肽2.36g，HPLC纯度为99.8％，HPLC色谱图如图3所示。
实施例22索玛鲁肽精肽的制备
将实施例19所得的5.85g的索玛鲁肽粗品溶于稀氨水，再用磷酸调节索玛鲁肽粗品溶液的pH为8.0～8.5，过滤得到索玛鲁肽粗肽溶液。以八烷基键合硅胶为固定相、以氯化铵和乙腈为流动相对索玛鲁肽粗肽溶液进行HPLC线性梯度洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的一次纯化溶液。索玛鲁肽的一次纯化溶液以八烷基键合硅胶为固定相、用磷酸调节pH的磷酸二氢钾水溶液，乙腈与异丙醇混合溶剂为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的二次纯化溶液。索玛鲁肽的二次纯化液以八烷基键合硅胶为固定相、用碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得索玛鲁肽精肽2.13g，HPLC纯度为99.8％，HPLC色谱图同实施例22。
实施例23索玛鲁肽精肽的制备
将实施例20所得的5.45g的索玛鲁肽粗品溶于稀氨水，再用磷酸调节索玛鲁肽粗品溶液的pH为8.0～8.5，过滤得到索玛鲁肽粗肽溶液。以八烷基键合硅胶为固定相、以氯化铵和乙腈为流动相对索玛鲁肽粗肽溶液进行HPLC线性梯度洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的一次纯化溶液。索玛鲁肽的一次纯化溶液以八烷基键合硅胶为固定相、用磷酸调节pH的磷酸二氢钾水溶液，乙腈与异丙醇混合溶剂为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的二次纯化溶液。索玛鲁肽的二次纯化液以八烷基键合硅胶为固定相、用碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行HPLC线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得索玛鲁肽精肽2.75g，HPLC纯度为99.8％，HPLC色谱图同实施例22。

Claims (14)

1.一种制备索玛鲁肽的方法，其特征在于，通过固相合成得到索玛鲁肽树脂，经裂解，脱保护，得到索玛鲁肽粗肽，纯化、冻干后得到索玛鲁肽精肽，其中1～4位采用的是单体R1-His(R2)-Aib-Glu(OR3)-N(R4)-Gly-R5，其结构为：
Figure FDA0002578034030000011
R1是氢或氨基保护基团，
R2是氢或氨基保护基团，
R3是酯的保护基团，
R4选自H、Hmb、Dmb、Tmob，
R5选自羟基、氯、OBt、OSu或OPfp。
2.根据权利要求1所述的方法，R1选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt。
3.根据权利要求1所述的方法，R2选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt。
4.根据权利要求1所述的方法，R3选自tBu、Bzl。
5.根据权利要求1所述的方法，R4选自Hmb、Dmb、Tmob。
6.根据权利要求1所述的方法，R5选自羟基、OBt、OSu、OPfp。
7.根据权利要求1所述的方法，R1是Boc，R2是Trt，R3是tBu，R4是Hmb，R5是羟基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括5～6位采用的是单体R6-Thr(R7)-Phe-R8，其结构为：
Figure FDA0002578034030000012
R6是氢或氨基保护基团,
R7是氢或羟基保护基团,
R8选自羟基、氯、OBt、OSu或OPfp。
9.根据权利要求8所述的方法，R6选自Fmoc、Dde、Alloc、Boc、Trt、Dmb、Mmt或Mtt。
10.根据权利要求8所述的方法，R7是tBu或Bzl。
11.根据权利要求8所述的方法，R8选自羟基、OBt、OSu、OPfp。
12.根据权利要求8所述的方法，R6是Fmoc，R7是tBu，R8是羟基。
13.根据权利要求1，8任一项所述的方法，20位采用的是单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH。
14.根据权利要求13所述的方法，20位采用的是单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic)-OH，1～4位采用的是单体Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-N(Hmb)-Gly-OH，5～6位采用的是单体Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH。
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