MX2011002885A - Proceso para la sintesis de (aib8,35)hglp-1(7-36)-nh2. - Google Patents

Proceso para la sintesis de (aib8,35)hglp-1(7-36)-nh2.

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Thomas Ciaran Loughman
Fionn Hurley
Steven R Johnson
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE RELACIONA CON UN PROCESO PARA LA SINTESIS A GRAN ESCALA DE aIb8, 35) Hglp-1(7-36)-nh2(SEQ id no: 2), ES DECIR, His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr- Leu-Glu-Gly-Gln-Alka-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib- Arg-Nh2 (SEQ ID NO:2), el cual incluye técnicas químicas Fmoc en fase sólida.

Description

PROCESO PARA LA SÍNTESIS DE (AIB8, 35) HGLP- 1 (7-36) -NH2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un nuevo proceso para la síntesis a gran escala de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2), es decir, His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2 (SEQ ID NO:2), el cual incluye técnicas químicas Fmoc en fase sólida.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El péptido amida tipo 1 (7-36) similar al glucagón (GLP-l) (SEQ ID NO. 1) , se sintetiza en las células intestinales L por medio de procesamiento postraduccional específico de tejido del precursor preproglucagón y se libera en la circulación como respuesta a la ingesta de alimento. El potencial terapéutico del GLP-1 se planteó después de la observación de que una sola dosis subcutánea de GLP-l podía normalizar por completo los niveles de glucosa posprandial en pacientes con diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM - non-insulin-dependent diabetes mellitus) (Gutniak, M. K. , et al., 1994, Diabetes Care, 14:1039-44). Se pensó que este efecto estaba relacionado con un aumento en la liberación de insulina y con una reducción en la secreción del glucagón. Sin embargo, el GLP-1 es inestable desde el punto de vista metabólico, tiene una vida media plasmática de sólo 1 a 2 minutos in vivo. El GLP-1 administrado en forma exógena también se degrada con rapidez (Deacon, C. F., et al., 1995, Diabetes, 44:1126-1131).
El (Aib8, 35) hGLP-1 ( 7-36 ) -NH2 (SEQ ID N0:2) en la Publicación PCT Núm. WO 00/34331 cuyo contenido se considera, en su totalidad, parte de la presente, se expone como un compuesto más activo y/o más estable en términos metabólicos que el GLP-1 nativo. Sin embargo, la descripción de la síntesis del (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) presentada en las páginas 18-19 del documento WO 00/34331 no es adecuada para la producción a escala comercial del péptido, porque para eliminar la resina BHA (4 -metilbencidrilamina) que se utiliza en la síntesis se requiere ácido fluorhídrico. Además de los aspectos de seguridad en el uso a gran escala de este material excesivamente corrosivo, también se requeriría equipo especial. En general, los esquemas de fragmentación con ácido fluorhídrico requieren de una importante inversión que garantice que son seguros y adaptables a escala industrial. De este modo, existe la necesidad de desarrollar un método a gran escala eficiente para producir (Aib8, 35) hGLP-1 ( 7 -36 ) -NH2 (SEQ ID NO:2).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un nuevo proceso para la síntesis de (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID N0:2), el cual incluye reacciones químicas sucesivas Fmoc en fase sólida.
En un aspecto la presente invención proporciona un proceso para la síntesis de (Aib8, 35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2), que consta de las siguientes etapas: (a) unión o acoplamiento sucesivo de aminoácidos Fmoc, del extremo C al extremo N del (Aib8,35) hGLP-l (8-35) - NH2 (SEQ ID NO: 8), con una resina Arg protegida en la cadena lateral, en donde el grupo Fmoc se elimina del extremo N después de cada etapa de unión sucesiva para obtener una resina Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 4) protegida en la cadena lateral ; (b) unión o acoplamiento del compuesto Boc-His-OH, protegido en la cadena lateral, con la resina Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg protegida en la cadena lateral (SEQ ID NO: 4) para obtener la resina Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg protegida en la cadena lateral (SEQ ID NO : 5 ) ; (c) tratar la resina Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 5) protegida en la cadena lateral con una mezcla de fragmentación (cleavage cocktail) y eliminar los grupos protectores de la cadena lateral y el grupo protector del extremo N para obtener el compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo; y d) aislar y purificar el (Aib8, 35 ) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo para obtener el compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) purificado.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención también comprende las siguientes etapas: (a-1) desproteger una resina protegida con Fmoc capaz de generar un péptido amida y eliminar el grupo Fmoc de la resina; (a-2) fijar en la resina el Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral, para obtener una resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral; y (a- 3) eliminar el grupo Fmoc de la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral y obtener una resina Arg protegida en la cadena lateral; el cual antecede a la etapa (a) .
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza por lo siguiente : el compuesto Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral en la etapa (a-2) es Fmoc-Arg (Pbf) -OH; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Fmoc-Arg (Pbf ) ; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Arg(Pbf) protegida en la cadena lateral; los aminoácidos-Fmoc del extremo C al extremo N de la fórmula (Aib8'35) hGLP-1 (8-35) -NH2 (SEQ ID NO: 8) son Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, y Fmoc-Aib-OH; la resina Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val- Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg protegida en la cadena lateral (SEQ ID NO:4) es la resina Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp(OtBu) -Val-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Gl (OtBu) -Gly-Gln (Trt) -Ala-Ala-Lys (Boc) -Glu(OtBu) -Phe-Ile-Ala-Trp(Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg(Pbf ) (SEQ ID N0:6) protegida en la cadena lateral; el compuesto Boc-His-OH protegido en la cadena lateral es Boc-His (Trt) -OH; la resina Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser- Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO : 5) protegida en la cadena lateral es la resina Boc-His (Trt) -Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr ( tBu) -Ser(tBu) -Asp(OtBu) -Val-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-Gln (Trt) -Ala-Ala- Lys (Boc) -Glu(OtBu) -Phe-Ile-Ala-Tr (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -AÍb-Arg(Pbf) (SEQ ID NO: 7) ; y la mezcla de fragmentación (cleavage cocktail) se selecciona a partir del grupo formado por la mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TIPS/DCM, mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/tioanisol/EDT, mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/tioanisol/1-dodecanotiol , mezcla de fragmentación TFA/DTT/ gua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol, mezcla de fragmentación TFA/fenol/ cido metansulfónico, mezcla de fragmentación TFA/tioanisol/EDT/anisol , mezcla de fragmentación TFA/TES, mezcla de fragmentación TFA/agua, mezcla de fragmentación TFA/DCM/indol y mezcla de fragmentación TFA/TIPS.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la resina capaz de generar un péptido se selecciona a partir del grupo formado por: resina Fmoc-Rink amida-MBHA, resina Fmoc-Rink amida-AM, resina PEG-Fmoc-Rink amida y resina Sieber amida.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención que se caracteriza por lo siguiente : la mezcla de fragmentación se selecciona a partir del grupo formado por mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TTPS/DCM y mezcla de fragmentación TFA/agua; y la resina capaz de generar un péptido amida se selecciona a partir del grupo formado por: resina Fmoc-Rink amida-MBHA, resina Fmoc-Rink amida-AM y resina PEG-Fmoc-Rink amida .
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la resina capaz de generar un péptido amida es la resina Fmoc-Rink amida-MBHA.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la etapa (d) consiste a su vez en los pasos siguientes: (d-1) filtrar para eliminar la resina y obtener el filtrado (Aib8, 35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID N0:2) /mezcla de fragmentación; (d-2) concentrar el filtrado (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación; (d-3) precipitar el compuesto (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo a partir del filtrado (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación concentrado; (d-4) formar una suspensión del precipitado crudo (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH (SEQ ID NO:2)en amortiguador de acetato de amonio para llevar a cabo la reacción inversa al desplazamiento N-O; (d-5) ajustar el pH de la suspensión para obtener una solución de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) ; y (d-6) aislar y purificar el compuesto (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO:2).
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la reacción inversa al desplazamiento N-0 se lleva a cabo manteniendo el precipitado crudo (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) en un medio levemente básico y luego bajando el pH hasta aproximadamente 3 a 3.7.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la eliminación del grupo Fmoc en la resina se lleva a cabo con piperidina en DMF.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la concentración de la piperidina en la DMF es aproximadamente de 25% (v/v) .
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque los residuos de aminoácidos del compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de reactivos de acoplamiento seleccionados a partir del grupo formado por TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA y HCTU/HOBt/DIEA.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención que se caracteriza por lo siguiente : los residuos de los primeros 29 aminoácidos del (Aib8, 35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) a partir del extremo C se unen mediante el uso de una combinación de TBTU/HOBt o TBTU/HBTU/DIEA; y el extremo N de la histidina se une utilizando una combinación de reactivos de acoplamiento seleccionados a partir del grupo formado por HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HBTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA y HCTU/HOBt/DIEA.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza por lo siguiente : la combinación de reactivos de acoplamiento utilizados para unir los primeros residuos de 29 aminoácidos de (Aib8' 35) hGLP-1 ( 7- 36 ) -NH2 (SEQ ID NO: 2) a partir del extremo C es TBTU/HOBt; y la combinación de reactivos de acoplamiento utilizada para unir el extremo N de histidina es HATU/DIEA.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención que se caracteriza por lo siguiente : los residuos de los primeros 29 aminoácidos de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) a partir del extremo C se unen utilizando aproximadamente 3.0 equivalentes de cada aminoácido-Fmoc , aproximadamente 2.94 equivalentes de TBTU, aproximadamente 2.94 equivalentes de HOBt y aproximadamente 4.5 equivalentes de DIEA, en aproximadamente 5 volúmenes en exceso de DMF; y el extremo N de histidina se une utilizando aproximadamente 3.4 equivalentes de Boc-His (Trt) -OH, aproximadamente 4.08 equivalentes de HATU y aproximadamente 9.0 equivalentes de DIEA, en aproximadamente 5 volúmenes en exceso de DMF.
En otro aspecto la presente invención proporciona un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2), según la reivindicación 1, que consta de las siguientes etapas: (a) acoplamiento sucesivo de aminoácidos Fmoc, del extremo C al extremo N del (Aib8, 35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO: 9), con una resina Arg protegida en la cadena lateral, en donde el grupo Fmoc se elimina del extremo N después de cada etapa de acoplamiento sucesivo para obtener una resina His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe- lie-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 3) protegida en la cadena lateral ; (b) tratar la resina His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 3) protegida en la cadena lateral con una mezcla de fragmentación y eliminar los grupos protectores de la cadena lateral para obtener el compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo; y (c) aislar y purificar el (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) - NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo para obtener el compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) purificado.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención también comprende las siguientes etapas: (a-1) desproteger una resina protegida con Fmoc capaz de generar un péptido amida y eliminar el grupo Fmoc de la resina; (a-2) fijar en la resina el Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral, para obtener una resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral; y (a-3) eliminar el grupo Fmoc de la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral y obtener una resina Arg protegida en la cadena lateral; el cual antecede a la etapa (a) .
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención que se caracteriza por lo siguiente : el compuesto Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral de la etapa (a-2) es Fmoc-Arg (Pbf) -OH; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Fmoc-Arg (Pbf ) -OH y Fmoc-Arg (Pbf ) ; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Arg (Pbf) protegida en la cadena lateral; los aminoácidos-Fmoc del extremo C al extremo N de la fórmula (Aib8'35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO: 9) son Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-As (OtBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Aib-OH y Fmoc-His (Trt) -OH; la resina His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO:3) protegida en la cadena lateral es la resina His (Trt) -Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp(OtBu) -Val-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-Gln (Trt) -Ala-Ala- Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Phe-Ile-Ala-Tr (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -AÍb-Arg(Pbf) (SEQ ID NO: 10); y la mezcla de fragmentación {cleavage cocktail) se selecciona a partir del grupo formado por la mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TIPS/DCM, mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/tioanisol/EDT, mezcla de fragmentación TFA/feno1/agua/1ioaniso1/1-dodecanotiol , mezcla de fragmentación TFA/DTT/agua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol, mezcla de fragmentación TFA/fenol/ácido metansulfónico, mezcla de fragmentación TFA/tioanisol/EDT/anisol , mezcla de fragmentación TFA/TES , mezcla de fragmentación TFA/agua, mezcla de fragmentación TFA/DCM/indol y mezcla de fragmentación TFA/TIPS.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la resina con capacidad para generar un péptido se selecciona a partir de 1 grupo formado por: resina Fmoc-Rink amida-MBHA, resina Fmoc-Rink amida-AM, resina PEG-Fmoc-Rink amida y resina Sieber amida.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza por lo siguiente : la mezcla de fragmentación se selecciona a partir del grupo formado por mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TIPS/DCM y mezcla de fragmentación TFA/agua y la resina capaz de generar un péptido amida se selecciona a partir del grupo formado por: resina Fmoc-Rink amida-MBHA, resina Fmoc-Rink amida-AM y resina PEG-Fmoc-Rink amida.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la resina capaz de generar un péptido amida es la resina Fmoc-Rink amida-MBHA.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la etapa (c) consiste a su vez en los pasos siguientes: (c-1) filtración para eliminar la resina y obtener el filtrado (Aib8, 35) hGLP- 1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación; (c-2) concentrar el filtrado (Aib8,35) hGLP- 1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación; (c-3) precipitar el compuesto (Aib8, 35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo a partir del filtrado (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO:2) /mezcla de fragmentación concentrado; (c-4) formar una suspensión del precipitado crudo (Aib8, 35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) en amortiguador de acetato de amonio para llevar a cabo la reacción inversa al desplazamiento N-0; (c-5) ajustar el pH de la suspensión para obtener una solución de (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) ; y (c-6) aislar y purificar el compuesto (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2).
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la reacción inversa al desplazamiento N-0 en la etapa (c-4) se lleva a cabo manteniendo el precipitado crudo (Aib8'35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) en un medio levemente básico y luego bajando el pH hasta aproximadamente 3 a 3.7.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la eliminación del grupo Fmoc en la resina se lleva a cabo con piperidina en DMF.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque la concentración de la piperidina en la DMF es aproximadamente de 25% (v/v) .
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque los residuos de aminoácidos del compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de reactivos de acoplamiento seleccionados a partir del grupo formado por TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA y HCTU/HOBt/DIEA.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque los residuos de aminoácidos de (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de los reactivos de acoplamiento TBTU/HOBt o TBTU/HBTU/DIEA.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque los residuos de aminoácidos de (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de los reactivos de acoplamiento TBTU/HOBt.
Una modalidad preferida del aspecto inmediato anterior de la presente invención se caracteriza porque los residuos de aminoácidos de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) a partir del extremo C se unen utilizando aproximadamente 3.0 equivalentes de cada aminoácido-Fmoc , aproximadamente 2.94 equivalentes de TBTU, aproximadamente 2.94 equivalentes de HOBt y aproximadamente 4.5 equivalentes de DIEA, en aproximadamente 5 volúmenes en exceso de DMF.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la solicitud se emplean las siguientes abreviaturas : ACN acetonitrilo AM aminometilo Boc ter-butiloxicarbonilo DCM diclorometano DIC N, N' -diisopropilcarbodiimida DIEA N, N-diisopropiletilamina DMF dimetilformamida DTT ditiotreitol EDT etanoditiol Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonilo HATU hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-l-il) -1,1,3, 3-tetrametiluronio HBTU hexafluorofosf to de 2- ( lH-benzotriazol-1-il ) -1 , 1 , 3 , 3 - tetrametiluronio HOAt l-hidroxi-7-azabenzotriazol HOBt 1-hidroxibenzotriazol HPLC cromatografía de líquidos de alta resolución LOD pérdida al secado MBHA 4 -metilbencidilamina MTBE éter metil terfc-butílico OtBu éster ter-butílico Pbf 2,2,4,6, 7-pentametildihidrobenzofuran-5 -sulfonilo PEG polietilenglicol TBTU tetrafluoroborato de 2- (lH-benzotriazol-1-il) -1,1,3, 3-tetrametiluronio tBu éter ter-butílico TES trietilsilano TFA ácido trifluoroacético TIPS triisopropilsilano Trt tritilo Una resina PEG-Fmoc-Rink amida es una resina con un enlazante Fmoc-Rink amida en donde las microesferas que constituyen la resina incluyen un componente PEG. Algunos ejemplos no limitativos de las resinas PEG-Fmoc-Rink amida son NovaPeg, NovaGel y AM SURE .
El término "mezcla de fragmentación" en el sentido que se utiliza en la presente se refiere a una mezcla de reactivos utilizada para eliminar o separar el péptido ensamblado de una resina. Por otra parte, la mezcla de fragmentación también sirve para eliminar todos los grupos protectores de cadena lateral y los grupos protectores del extremo N.
El término "aproximadamente" en el sentido que se utiliza en la presente, asociado con parámetros o cantidades, significa que el parámetro o la cantidad está dentro de ± 5% respecto al parámetro o cantidad. El ejemplo siguiente se describe con la finalidad de ilustrar un método de la presente invención y de ninguna manera deberá interpretarse como limitativo de la misma.
• Síntesis de (Aib8'35) h.GLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID N0:2) El compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se sintetizó en un reactor de vidrio de 35 litros (Quark, Vineland, NJ, EE.UU.) equipado con un motor de aire comprimido y un agitador de politetrafluoroetileno (PTFE -polytetrafluoroethylene) . Se usó resina Fmoc Rink amida BHA (Merck Biosciences, Darmstadt, Alemania) en una proporción de 0.63 mmoles/g. Se usaron aminoácidos Fmoc (Synthetech Inc., Albany, OR, EE.UU.) con la siguiente protección en la cadena lateral: Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Asp(OtBu) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Boc-His(Trt)-0H, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Trp (Boc) -OH y Fmoc-Tyr (tBu) -OH . Los siguientes aminoácidos Fmoc no necesitaron protección en la cadena lateral: Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Val-OH.
La síntesis se llevó a cabo en una escala de 0.63 moles (incorporación de 1 kg de resina) . Los primeros 29 aminoácidos (todos excepto el extremo N de la histidina) se acoplaron utilizando 3.0 equivalentes de aminoácido y se preactivaron con 2.94 equivalentes de TBTU (Fluka, Seelze, Alemania), 2.94 equivalentes de HOBt (Fluka, Seelze, Alemania) y 4.5 equivalentes de DIEA (Sigma-Aldrich, Gillingham, U ) en 4.5 litros de DMF. Los tiempos de acoplamiento fueron de 60 minutos. El compuesto Boc-His(Trt)-OH se unió utilizando 3.4 equivalentes de aminoácido, 4.08 equivalentes de HATU (Applied Biosystems, Framingham, MA, EE.UU.) y 9 equivalentes de DIEA en 4.5 litros de DMF. La desprotección de la resina antes del acoplamiento inicial y después de cada acoplamiento sucesivo se realizó utilizando 2 x 10 litros de piperidina al 25% (v/v) (BASF, Alemania) en DMF.
Al término de la fijación del péptido en el resina, la resina se lavó dos veces con 10 litros de metanol (Labscan, Dublin, Irlanda) y se secó hasta un LOD (pérdida al secado) < 1% en una estufa a vacío (Masón Technology, Dublin, Irlanda) . Inicialmente, la resina se secó con nitrógeno en el reactor y el secado final se hizo en estufa a vacío a una temperatura ambiente aproximada de 22°C a < 50 mbar. El proceso de secado completo duró 3 días. Se obtuvieron 4200 g de peptidil-resina .
El péptido se separó de la resina y sus grupos protectores de la cadena lateral se eliminaron en lotes 6 x 700 g utilizando una mezcla de fragmentación de 8.4 litros de TFA/TIPS/agua (80/14.3/5.7% v/v) durante 170 minutos, por cada uno de los lotes. La resina se lavó con 0.7 litros de TFA y los filtrados se combinaron. La mezcla de fragmentación se concentró utilizando un evaporador de rotación (Buchi, Flawil, Suiza) hasta 14 a 32% de su peso original y el péptido crudo se precipitó en un volumen de 13.6 a 17.5 litros de MTBE de agitación (Labscan, Dublin, Irlanda). El péptido crudo se lavó después con 1.5 a 7.5 litros de MTBE.
La reacción inversa al desplazamiento N-0 se llevó a cabo suspendiendo el péptido precipitado crudo en amortiguador de acetato de amonio (10 g de péptido/100 mi, 10% p/v, es decir, 10 g de péptido/100 mi amortiguador, pH 8-9) durante 60 minutos. El pH se llevó a 3.3-3.7 con 14 a 18 litros de ácido acético glacial y se obtuvo una solución transparente que tenía una pureza por HPLC de aproximadamente 50%. La solución del péptido se filtró a través de un filtro de 0.45 µ?t? (Pall Gelman Sciences Inc., New York, Y, EE.UU.) antes de la purificación.
El péptido se purificó en una columna de HPLC preparativa de fase inversa (Novasep, Pompey, Francia) empacada con fase estacionaria Ci8 (EKA Chemicals AB, Bohus, Suecia) . La purificación se realizó en gradiente de elución con 0.1% de TFA en agua y acetonitrilo .
Se llevó a cabo una operación de cromatografía de intercambio salino utilizando amortiguadores de acetato de amonio y ácido acético para formar la sal de acetato. Específicamente, el péptido se cargó en la columna de HPLC. El péptido se lavó en la columna con amortiguador de acetato de amonio durante 1 hora, luego se eluyó de la columna con gradiente de ácido acético/acetonitrilo.
La pureza del péptido purificado fue > 99% según análisis por HPLC. Específicamente, la solución de péptido se concentró en un evaporador de rotación (temperatura máxima de 40°C) y la solución resultante se filtró a través de un filtro de 0.45 µ?? (Pall Gelman Sciences Inc., New York, NY, EE.UU.) y se liofilizó.
El sistema HATU/DIEA para el acoplamiento final de la histidina, en comparación con los sistemas TBTU/HBTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt o HATU/HOBt/DIEA, dio como resultado una mayor conversión de los 29mer a (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) y en consecuencia un mayor rendimiento.
Por otra parte, el uso de histidina protegida con Boc, en comparación con la histidina protegida con Fmoc , dio un mayor rendimiento y permitió una ligera disminución en el tiempo de procesamiento ya que no fue necesario eliminar el Fmoc antes de la fragmentación. El diseño estadístico de los estudios experimentales se realizó tanto para el acoplamiento de la histidina como para su separación o fragmentación a partir de la resina con la finalidad de seleccionar la combinación óptima de la proporción de reactivos y del tiempo de reacción y aumentar el rendimiento, como se muestra en las siguientes tablas.
Como es sabido en la técnica, las reacciones de desplazamiento N-O, son desplazamientos de grupos acilo que se generan en péptidos que contienen residuos de treonina o serina durante la exposición a condiciones ácidas. Esto da como resultado impurezas isoméricas que reducen el rendimiento y que dificultan la purificación. Estas reacciones de desplazamiento N-O, se revierten manteniendo el péptido en un medio levemente básico (por ejemplo, pH 8-9) y luego bajando el pH aproximadamente a 3. El proceso anteriormente mencionado permite que la reacción inversa al desplazamiento N-O se realice en forma de suspensión lo que da una ventaja a escala con respecto a un proceso de inversión en solución completa.
Tabla 1: Diseño en pequeña escala de estudios experimentales (y sus resultados de rendimiento/pureza) dirigidos a optimizar el acoplamiento del extremo N del residuo de histidina del compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) Nota : Los resultados que se muestran incluyen los niveles de impurezas relacionadas con este acoplamiento (D- y Des -histidina ) en el péptido crudo .
Tabla 2: Resultados de repetidas síntesis en pequeña y gran escala en condiciones optimizadas de acoplamiento de histidina (3.4 equiv. Boc-His, 4.08 equiv. HATU, 9.0 equiv. DIEA y tiempo de reacción de 2.9 horas) Nota: Los resultados que se muestran incluyen los niveles de impurezas relacionadas con este acoplamiento (D- y Des-histidina) en el péptido crudo.
Tabla 3: Diseño en pequeña escala de estudios experimentales (y sus resultados de rendimiento/pureza) dirigidos a optimizar la fragmentación o separación del compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) de la resina Exceso Núm . volumétrico de Relación Rendimiento Tiempo Pureza (%) Ex . mezcla respecto TIPS/H20 (%) a resina 1 5 0.5 1 3.9 12.6 2 15 0.5 1 14.7 29.4 3 5 4 1 24.1 44.9 4 15 4 1 30.3 52.1 5 5 0.5 4 6.9 25.6 6 15 0.5 4 20.1 47 Exceso Núm . volumétrico de Relación Rendimiento Tiempo Pureza (%) Exp . mezcla respecto TIPS/H20 (%) a resina 7 5 4 4 23.9 47.9 8 15 4 4 29.6 56.6 9 10 2.25 2.5 29.1 58.8 10 10 2.25 2.5 29.4 58.9 Nota: El TFA constituyó el 80% de la mezcla de fragmentación en los experimentos anteriores.
Tabla 4 : Experimentos de optimización de la separación o fragmentación: 12 volúmenes de mezcla de fragmentación (con relación al peso de la resina), TFA 80%, tiempo de reacción 2.8 horas y relación 2.5:1 de TIPS/H20.
Nota: Los resultados anteriores son posteriores a la la reacción inversa al desplazamiento N-O.
Como se muestra en las Tablas 2 y 4 anteriores, el procesamiento del producto crudo (incorporación de la evaporación de la mezcla de fragmentación y precipitación en MTBE) se optimizó para lograr la precipitación a gran escala sin afectar el rendimiento. Por último, se realizó una síntesis a gran escala (incorporación de 1 kg de resina) que se separó o fragmentó sucesivamente en lotes logrando un rendimiento total en la síntesis de 27%, que representa aproximadamente un 8% de aumento en comparación con los rendimientos de los métodos anteriores a escalas menores .
En el desarrollo del método de purificación, los esfuerzos se enfocaron a modificar el gradiente de TFA usado desde el principio para reducir al mínimo el número de ciclos de purificación para obtener el material con una pureza > 99%, lo cual dio como resultado rendimientos de purificación de 50 a 60%.
OTRAS MODALIDADES A partir de la descripción anterior, el experto en la técnica puede conocer fácilmente las características esenciales de la presente invención y sin desviarse del espíritu y alcance la misma, hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. De este modo, otras modalidades también quedan dentro de las reivindicaciones

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1(7-36) -NH2 (SEQ ID N0:2), el cual incluye etapas sucesivas de reacciones químicas Fmoc en fase sólida.
2. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2), según la reivindicación 1, que consta de las siguientes etapas: (a) acoplamiento sucesivo de aminoácidos Fmoc, del extremo C al extremo N del (Aib8,35) hGLP-1 (8-35) -NH2 (SEQ ID NO: 8), con una resina Arg protegida en la cadena lateral, en donde el grupo Fmoc se elimina del extremo N después de cada etapa de acoplamiento sucesivo para obtener una resina Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 4) protegida en la cadena lateral; (b) unión del compuesto Boc-His-OH protegido en la cadena lateral con la resina Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg protegida en la cadena lateral (SEQ ID NO: 4) ara obtener la resina Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln- la-Ala-Lys-Glu-Phe-lie-Ala-Trp-Leu-Val -Lys-Aib-Arg protegida en la cadena lateral (SEQ ID NO:5); (c) tratar la resina Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala- Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 5) protegida en la cadena lateral con una mezcla de fragmentación y eliminar los grupos protectores de la cadena lateral y el grupo protector del extremo N para obtener el compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo; y (d) aislar y purificar el (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo para obtener el compuesto (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) purificado.
3. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 2, que consta también de las siguientes etapas: (a-1) desproteger una resina protegida con Fmoc capaz de generar un péptido amida para eliminar el grupo Fmoc de la resina; (a-2) fijar en la resina el Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral, para obtener una resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral; y (a-3) eliminar el grupo Fmoc de la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral para obtener una resina Arg protegida en la cadena lateral; el cual antecede a la etapa (a) .
4. Un proceso para la síntesis de (Aib8'35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 3, en donde: el compuesto Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral de la etapa (a-2) es Fmoc-Arg (Pbf) -OH; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Fmoc-Arg (Pbf ) ; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Arg(Pbf) protegida en la cadena lateral; los aminoácidos-Fmoc del extremo C al extremo N de la fórmula (Aib8, 35) hGLP- 1 (8-35) -NH2 (SEQ ID NO: 8) son Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gl (Trt) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH y Fmoc-Aib-OH; la resina Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe- lie-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg protegida en la cadena lateral (SEQ ID NO:4) es la resina Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Val -Ser ( tBu) -Ser (tBu) -Tyr(tBu) -Leu-Glu(OtBu) -Gly-Gln (Trt) -Ala-Ala-Lys (Boc) -Glu(OtBu) -Phe-Ile-Ala-Tr (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg(Pbf ) (SEQ ID NO: 6) protegida en la cadena lateral; el compuesto Boc-His-OH protegido en la cadena lateral es Boc-His (Trt) -OH; la resina Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 5) protegida en la cadena lateral es la resina Boc-His (Trt ) -Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Th (tBu) -Ser(tBu) -Asp(OtBu) -Val-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-Gln (Trt) -Ala-Ala-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Phe-Ile-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg(Pbf) (SEQ ID N0:7); y la mezcla de fragmentación se selecciona a partir del grupo formado por la mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TIPS/DCM, mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/tioanisol/EDT, mezcla de f agmentación TFA/fenol/agua/tioanisol/l-dodecanotiol , mezcla de fragmentación TFA/DTT/agua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol, mezcla de fragmentación TFA/fenol/ácido metansulfónico, mezcla de fragmentación TFA/tioanisol/EDT/anisol , mezcla de fragmentación TFA/TES , mezcla de fragmentación TFA/agua, mezcla de fragmentación TFA/DCM/indol y mezcla de fragmentación TFA/TIPS.
5. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) según la reivindicación 4, en donde la resina capaz de generar un péptido se selecciona a partir del grupo formado por: resina Fmoc-Rink amida-MBHA, resina Fmoc-Rink amida-AM, resina PEG-Fmoc-Rink amida y resina Sieber amida.
6. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 5, en donde : la mezcla de fragmentación se selecciona a partir del grupo formado por mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TIPS/DCM y mezcla de fragmentación TFA/agua; y la resina capaz de generar un péptido amida se selecciona a partir del grupo formado por resina Fmoc-Rink amida-MBHA, resina Fmoc-Rink amida-AM y una resina PEG-Fmoc-Rink amida.
7. Un proceso para la síntesis de (Aib8'35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) según la reivindicación 6, en donde la resina capaz de generar un péptido amida es la resina Fmoc-Rink amida-MBHA.
8. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 7, en donde la etapa (d) consta de los siguientes pasos: (d-1) filtrar para eliminar la resina y obtener el filtrado (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación; (d-2) concentrar el filtrado (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación; (d-3) precipitar el compuesto (Aib8,35) hGLP- 1(7-36) - H2 (SEQ ID NO : 2 ) crudo a partir del filtrado (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación concentrado; (d-4) formar una suspensión del precipitado crudo (Aib8, 35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) en amortiguador de acetato de amonio para llevar a cabo la reacción inversa al desplazamiento N-0 ; (d-5) ajustar el pH de la suspensión para obtener una solución de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO : 2 ) ; y (d-6) aislar y purificar el compuesto (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2).
9. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) según la reivindicación 8, en donde la reacción inversa al desplazamiento N-0 se lleva a cabo manteniendo el precipitado crudo (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) en un medio ligeramente básico y luego bajando el pH aproximadamente a 3 - 3.7.
10. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) según la reivindicación 9, en donde la eliminación del grupo Fmoc de la resina se lleva a cabo con piperidina en DMF.
11. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 10, en donde la concentración de la piperidina en DMF es aproximadamente de 25% (v/v) .
12. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO : 2 ) según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los residuos de aminoácidos de (Aib8, 35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de reactivos de acoplamiento seleccionados a partir del grupo formado por TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA y HCTU/HOBt/DIEA.
13. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 12, en donde : los residuos de los primeros 29 aminoácidos del (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) a partir del extremo C se unen mediante el uso de una combinación de TBTU/HOBt o TBTU/HBTU/DIEA; y el extremo N de la histidina se une utilizando una combinación de reactivos de acoplamiento seleccionados a partir del grupo formado por HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HBTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA y HCTU/HOBt/DIEA.
14. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 13, en donde : la combinación de reactivos de acoplamiento utilizados para unir los primeros residuos de 29 aminoácidos de (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) a partir del extremo C es TBTU/HOBt; y la combinación de reactivos de acoplamiento utilizada para unir el extremo N de histidina es HATU/DIEA.
15. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 14, en donde: los residuos de los primeros 29 aminoácidos de (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) a partir del extremo C se unen utilizando aproximadamente 3.0 equivalentes de cada aminoácido-Fmoc , aproximadamente 2.94 equivalentes de TBTU, aproximadamente 2.94 equivalentes de HOBt y aproximadamente 4.5 equivalentes de DIEA, en aproximadamente 5 volúmenes en exceso de DMF; y el extremo N de histidina se une utilizando aproximadamente 3.4 equivalentes de Boc-His (Trt) -OH, aproximadamente 4.08 equivalentes de HATU y aproximadamente 9.0 equivalentes de DIEA, en aproximadamente 5 volúmenes en exceso de DMF.
16. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 1, que consta de las siguientes etapas: (a) acoplamiento sucesivo de aminoácidos Fmoc, del extremo C al extremo N del (Aib8,35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO: 9), con una resina Arg protegida en la cadena lateral, en donde el grupo Fmoc se elimina del extremo N después de cada etapa de acoplamiento sucesivo para obtener una resina His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe- lie-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 3) protegida en la cadena lateral ; (b) tratar la resina His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO: 3) protegida en la cadena lateral con una mezcla de fragmentación y eliminar los grupos protectores de la cadena lateral para obtener el compuesto (Aib8, 35) hGLP- 1 ( 7 -36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo; y (c) aislar y purificar el (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) crudo para obtener el compuesto (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO:2) purificado.
17. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO:2), según la reivindicación 16, que consta también de las siguientes etapas: (a-1) desproteger una resina protegida con Fmoc capaz de generar un péptido amida y eliminar el grupo Fmoc de la resina; (a-2) fijar en la resina el Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral, para obtener una resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral; y (a- 3) eliminar el grupo Fmoc de la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral para obtener una resina Arg protegida en la cadena lateral; el cual antecede a la etapa (a) .
18. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1(7-36) -NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 17, en donde : el compuesto Fmoc-Arg-OH protegido en la cadena lateral de la etapa (a-2) es Fmoc-Arg (Pbf) -OH; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Fmoc-Arg (Pbf) -OH y Fmoc-Arg ( Pbf ) ; la resina Fmoc-Arg protegida en la cadena lateral es la resina Arg (Pbf) protegida en la cadena lateral; los aminoácidos-Fmoc del extremo C al extremo N de la fórmula (Aib8'35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO: 9) son Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Aib-OH y Fmoc-His (Trt) -OH; la resina His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg (SEQ ID NO:3) protegida en la cadena lateral es la resina His (Trt) -Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr(tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser(tBu) -Asp(OtBu) -Val-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr(tBu) -Leu-Glu (OtBu) -Gly-Gln (Trt) -Ala-Ala-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Phe-Ile-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg(Pbf) (SEQ ID NO:10); y la mezcla de fragmentación se selecciona a partir del grupo formado por la mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TIPS/DCM, mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol/agua/tioanisol/EDT, mezcla- de fragmentación TFA/fenol/agua/tioanisol/l-dodecanotiol , mezcla de fragmentación TFA/DTT/agua/TIPS , mezcla de fragmentación TFA/fenol, mezcla de fragmentación TFA/fenol/ácido metansulfónico, mezcla de fragmentación TFA/tioanisol/EDT/anisol, mezcla de fragmentación TFA/TES , mezcla de fragmentación TFA/agua, mezcla de fragmentación TFA/DCM/indol y mezcla de fragmentación TFA/TIPS.
19. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) según la reivindicación 18, en donde la resina capaz de generar un péptido se selecciona a partir del grupo formado por: resina Fmoc-Rink amida-MBHA, resina Fmoc-Rink amida-AM, resina PEG-Fmoc-Rink amida y resina Sieber amida.
20. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1(7-36) -NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 19, en donde : la mezcla de fragmentación se selecciona a partir del grupo formado por mezcla de fragmentación TFA/TIPS/agua, mezcla de fragmentación TFA/TIPS/DCM y mezcla de fragmentación TFA/agua,- y la resina capaz de generar un péptido amida se selecciona a partir del grupo formado por: resina Fmoc-Rink amida- BHA, resina Fmoc-Rink amida-AM y resina una PEG-Fmoc-Rink amida.
21. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) según la reivindicación 20, en donde la resina capaz de generar un péptido amida es la resina Fmoc-Rink amida-MBHA.
22. Un proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 21, en donde la etapa (c) consta de los siguientes pasos: (c-1) filtrar para eliminar la resina y obtener el filtrado (Aib8, 3 ) hGLP- 1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO:2) /mezcla de fragmentación; (c-2) concentrar el filtrado (Aib8'35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación; (c-3) precipitar el compuesto (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) crudo a partir del filtrado (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 ( SEQ ID NO: 2) /mezcla de fragmentación concentrado; (c-4) formar una suspensión del precipitado crudo (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) en amortiguador de acetato de amonio para llevar a cabo la reacción inversa al desplazamiento N-O; (c-5) ajustar el pH de la suspensión para obtener una solución de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO : 2 ) ; y (c-6) aislar y purificar el compuesto (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO:2).
23. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) según la reivindicación 22, en donde la reacción inversa al desplazamiento N-0 en la etapa (c-4) se realiza manteniendo el precipitado crudo (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) en un medio ligeramente básico y luego bajando el pH aproximadamente a 3 - 3.7.
24. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) según la reivindicación 23, en donde eliminación del grupo Fmoc de la resina se lleva a cabo con piperidina en DMF.
25. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO : 2 ) , según la reivindicación 24, en donde la concentración de la piperidina en D F es aproximadamente de 25% (v/v) .
26. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, en donde los residuos de aminoácidos de (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de reactivos de acoplamiento seleccionados a partir del grupo formado por TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA y HCTU/HOBt/DIEA.
27. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) según la reivindicación 26, en donde los residuos de aminoácidos de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de los reactivos de acoplamiento TBTU/HOBt o TBTU/HBTU/DIEA.
28. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-l(7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2) según la reivindicación la reivindicación 27, en donde los residuos de aminoácidos de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) se unen mediante el uso de una combinación de los reactivos de acoplamiento TBTU/HOBt .
29. El proceso para la síntesis de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2) según la reivindicación 28, en donde los residuos de aminoácidos de (Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO:2) se unen utilizando aproximadamente 3.0 equivalentes de aminoácido-Fmoc, aproximadamente 2.94 equivalentes de TBTU, aproximadamente 2.94 equivalentes de HOBt y aproximadamente 4.5 equivalentes de DIEA, en aproximadamente 5 volúmenes en exceso de DMF.
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