KR20110070870A - (Ａｉｂ8,35)ｈＧＬＰ-1(7-36)-ＮＨ₂의 합성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고상 Fmoc 화학 반응을 포함하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2), 즉, His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2 (서열번호 2)의 대규모 합성 방법에 관한 것이다.

Description

(Ａｉｂ8,35)ｈＧＬＰ-1(7-36)-ＮＨ₂의 합성 방법{PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2}
본 발명은, 고상 Fmoc 화학 반응을 포함하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2), 즉, His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2 (서열번호 2)의 새로운 대규모 합성 방법에 관한 것이다.
글루카곤 유사 펩타이드-1 (7-36) 아미드 (GLP-1) (서열번호 1)는 글루카곤 전구체인 프리프로글루카곤의 조직 특이적인 번역후 가공을 통해 장의 L-세포에서 합성되며, 음식물 섭취에 반응하여 순환계로 분비된다. GLP-1의 치료학적 잠재성은 GLP-1을 1회 피하 투여하였을 때 인슐린 비의존형 당뇨병(NIDDM) 환자들에서 식후 당 수치가 완전하게 정상화된다는 결과에 따라 제안되었다 (Gutniak, M. K., et al ., 1994, Diabetes Care, 14:1039-44). 이러한 효과는 인슐인 분비 증가와 글루카곤 분비 감소, 이들 2가지에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 그러나, GLP-1은 대사적으로 불안정하여, 생체내 혈장 반감기가 1-2분에 불과하다. 또한, 외부에서 투여되는 GLP-1 역시 빨리 분해된다 (Deacon, C. F., et al ., 1995, Diabetes, 44:1126-1131).
(Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)는 PCT 공개번호 WO 00/34331에 천연 GLP-1 보다 활성형이고 및/또는 대사적으로 보다 안정적인 것으로 기술되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그러나, WO 00/34331의 18-19페이지에 제공된 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 관련 내용은, 이 문헌에서 사용하는 MBHA(4-메틸벤즈하이드릴아민) 수지는 펩타이드의 절단에 하이드로플루오르산을 이용하기 때문에, 상업적인 규모로 펩타이드를 합성하는데에는 적합하지 않다. 이렇듯 매우 부식성이 높은 물질의 대량 사용과 관련된 안전성 문제 외에도, 이를 사용할 수 있는 특수 장비도 필요할 것이다. 일반적으로, 하이드로플루오르산을 이용한 절단법에는 안전성 보장과 상업적인 규모로의 대량화를 위해 엄청난 투자가 요구된다. 이와 같이, (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 효율적인 대규모 제조 방법에 대한 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 단계적인 고상 Fmoc-화학 반응을 포함하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 새로운 합성 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은,
(a) (Aib8 ,35)hGLP-1(8-35)-NH2 (서열번호 8)에서 C-말단으로부터 N-말단까지의, Fmoc-아미노산들을 측쇄 보호된 Arg 수지에 순차적으로 커플링하고, 상기 Fmoc 기는 각각의 순차적인 커플링 단계 후에 N-말단으로부터 제거하여, 측쇄-보호된, Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 4)를 수득하는 단계;
(b) 상기 측쇄-보호된 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 4)를 측쇄-보호된 Boc-His-OH와 커플링하여, 측쇄-보호된 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 5)를 수득하는 단계;
(c) 상기 측쇄-보호된 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 5)에 절단 칵테일을 처리하여, 상기 측쇄-보호기와 N-말단 보호기를 제거함으로써, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 조생성물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하여, 정제된 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2_를 수득하는 단계를 포함하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법을 제공한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 단계 (a) 전에 선행되는, 하기 단계들을 추가로 포함한다:
(a-1) 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 Fmoc-보호된 수지를 탈보호화하여, 수지로부터 Fmoc 기를 제거하는 단계;
(a-2) 상기 수지 상에 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH를 부착시켜, 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지를 수득하는 단계; 및
(a-3) 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지로부터 Fmoc 기를 제거하여, 측쇄-보호된 Arg 수지를 수득하는 단계.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 하기와 같은 특징을 가진다:
단계 (a-2)에서 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH이며;
상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지는 Fmoc-Arg(Pbf) 수지이며;
상기 측쇄-보호된 Arg 수지는 측쇄 보호된 Arg(Pbf) 수지이며;
식 (Aib8 ,35)hGLP-1(8-35)-NH2 (서열번호 8)에서 C-말단으로부터 N-말단까지의 상기 Fmoc-아미노산들은, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 및 Fmoc-Aib-OH이며;
상기 측쇄-보호된 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 4)는 Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf) 수지 (서열번호 6)이며;
상기 측쇄-보호된 Boc-His-OH는 Boc-His(Trt)-OH이며;
상기 측쇄-보호된 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 5)는 Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf) 수지 (서열번호 7)이며;
상기 절단 칵테일은 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일, TFA/페놀/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/EDT 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/1-도데칸티올 절단 칵테일, TFA/DTT/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀 절단 칵테일, TFA/페놀/메탄설폰산 절단 칵테일, TFA/티오아니솔/EDT/아니솔 절단 칵테일, TFA/TES 절단 칵테일, TFA/물 절단 칵테일, TFA/DCM/인돌 절단 칵테일, 및 TFA/TIPS 절단 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 펩타이드를 만들 수 있는 상기 수지가 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지, 및 Sieber 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는,
상기 절단 칵테일이 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일, 및 TFA/물 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
펩타이드 아미드를 만들 수 있는 상기 수지가 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, 및 PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 수지가 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 단계 (d)가 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(d-1) 여과하여 수지를 제거함으로써, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 수득하는 단계;
(d-2) 상기 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 농축하는 단계;
(d-3) 상기 농축한 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물로부터 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 석출하는 단계;
(d-4) 상기 석출된 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)을 암모늄 아세테이트 완충액 중에 슬러리화하여, N-O 시프트 반전(shift reversal)을 수행하는 단계;
(d-5) 상기 슬러리의 pH를 조절하여, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 용액을 수득하는 단계; 및
(d-6) (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하는 단계.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 N-O 시프트 반전이 상기 석출된 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 약염기성 매질에 둔 다음 pH를 약 3 - 3.7로 다시 낮춤으로써 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 수지로부터의 Fmoc 기의 제거가 DMF 중의 피페리딘을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 DMF 중의 피페리딘의 농도가 약 25% (v/v)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들이 TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA, 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는,
(Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)에서 C-말단으로부터 시작되는 처음 29개의 아미노산 잔기들이 TBTU/HOBt 또는 TBTU/HBTU/DIEA 중 어느 하나의 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되며;
N-말단의 히스티딘이 HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HBTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA, 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는,
(Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)에서 C-말단으로부터 시작되는 처음 29개의 아미노산 잔기들을 커플링하는데 사용되는 상기 커플링 시약의 조합이 TBTU/HOBt이고;
N-말단의 히스티딘을 커플링하는데 사용되는 상기 커플링 시약의 조합이 HATU/DIEA인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는,
(Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)에서 C-말단으로부터 시작되는 처음 29개의 아미노산 잔기들은, 약 5배 부피의 DMF 중에서, 각각의 Fmoc-아미노산 약 3.0 당량, TBTU 약 2.94 당량, HOBt 약 2.94 당량 및 DIEA 약 4.5 당량을 이용하여 커플링되며;
N-말단의 히스티딘은, 약 5배 부피의 DMF 중에서, 3.4 당량의 Boc-His(Trt)-OH, 약 4.08 당량의 HATU 및 약 9.0 당량의 DIEA를 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 제1항에 따른 (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법을 제공한다:
(a) (Aib8 ,35)hGLP-1(7-35)-NH2 (서열번호 9)에서 C-말단에서 N-말단까지 Fmoc-아미노산들을 측쇄-보호된 Arg 수지에 순차적으로 커플링하고, 각각의 순차적인 커플링 단계 후 N-말단으로부터 Fmoc 기를 제거하여, 측쇄-보호된 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 3)을 수득하는 단계;
(b) 측쇄-보호된 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 3)에 절단 칵테일을 처리하고, 이로부터 측쇄-보호된 기를 제거하여, 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 수득하는 단계;
(c) 상기 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하여, 정제된 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 수득하는 단계.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 단계 (a) 전에 하기 단계들을 더 포함한다:
(a-1) 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 Fmoc-보호된 수지를 탈보호화하여, 수지로부터 Fmoc 기를 제거하는 단계;
(a-2) 상기 수지 상에 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH를 부착시켜, 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지를 수득하는 단계; 및
(a-3) 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지로부터 Fmoc 기를 제거하여, 측쇄-보호된 Arg 수지를 수득하는 단계.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는,
단계 (a-2)에서 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH이며;
상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 및 Fmoc-Arg(Pbf) 수지이며;
상기 측쇄-보호된 Arg 수지는 측쇄 보호된 Arg(Pbf) 수지이며;
식 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-35)-NH2 (서열번호 9)에서 C-말단으로부터 N-말단까지의 상기 Fmoc-아미노산들이 Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Aib-OH 및 Fmoc-His(Trt)-OH이며;
상기 측쇄-보호된 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 3)가 His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf) 수지 (서열번호 10)이며;
상기 절단 칵테일이 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일, TFA/페놀/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/EDT 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/1-도데칸티올 절단 칵테일, TFA/DTT/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀 절단 칵테일, TFA/페놀/메탄설폰산 절단 칵테일, TFA/티오아니솔/EDT/아니솔 절단 칵테일, TFA/TES 절단 칵테일, TFA/물 절단 칵테일, TFA/DCM/인돌 절단 칵테일, 및 TFA/TIPS 절단 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 펩타이드를 만들 수 있는 상기 수지가 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지, 및 Sieber 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는,
상기 절단 칵테일이 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일 및 TFA/물 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
펩타이드 아미드를 만들 수 있는 상기 수지가 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, 및 PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 수지가 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 단계 (c)가 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(c-1) 여과하여 수지를 제거함으로써, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 수득하는 단계;
(c-2) 상기 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 농축하는 단계;
(c-3) 상기 농축한 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물로부터 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 석출하는 단계;
(c-4) 상기 석출된 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 암모늄 아세테이트 완충액 중에 슬러리화하여, N-O 시프트 반전(shift reversal)을 수행하는 단계;
(c-5) 상기 슬러리의 pH를 조절하여, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 용액을 수득하는 단계; 및
(c-6) (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하는 단계.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 N-O 시프트 반전이 상기 석출된 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 약염기성 매질에 둔 다음 pH를 약 3 - 3.7로 다시 낮춤으로써 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 수지에서 Fmoc 기를 제거하는 과정이 DMF 중의 피페리딘을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, 상기 DMF 중의 피페리딘의 농도가 약 25% (v/v)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들이 TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들이 TBTU/HOBt 또는 TBTU/HBTU/DIEA 중 어느 하나의 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들이 TBTU/HOBt의 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전술한 측면에 대한 바람직한 구현예는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들이, 약 3.0 당량의 각각의 Fmoc-아미노산, 약 2.94 당량의 TBTU, 약 2.94 당량의 HOBt 및 약 4.5 당량의 DIEA를 이용하여, 약 5배 부피의 DMF 중에서 커플링되는 것을 특징으로 한다.
본 출원에서는 하기 약어들이 사용된다.
ACN 아세토니트릴
AM 아미노메틸
Boc tert-부틸옥시카르보닐
DCM 디클로로메탄
DIC N, N'-디이소프로필카르보디이미드
DIEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMF 디메틸포름아미드
DTT 디티오트레이톨
EDT 에탄디티올
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HOAt 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
LOD 건조감량
MBHA 4-메틸벤즈하이드릴아민
MTBE 메틸 tert-부틸 에테르
OtBu tert-부틸 에스테르
Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐
PEG 폴리에틸렌 글리콜
TBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
tBu tert-부틸 에테르
TES 트리에틸실란
TFA 트리플루오로아세트산
TIPS 트리이소프로필실란
Trt 트리틸
PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지는, 수지의 구성 요소 비드가 PEG 성분인, Fmoc-Rink 아미드 링커를 구비한 수지이다. PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지에 대한 예로는 NovaPeg, NovaGel 및 AM SURE가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 용어 "절단 칵테일"은 조립한 펩타이드를 수지로부터 분리, 절단하는데 사용되는 시약 혼합물을 지칭한다. 또한, 절단 칵테일은 측쇄 보호기들과 N-말단의 보호기들을 모두 제거하기 위해 제공된다.
본원에서, 파라미터 또는 양에 대해 사용되는 용어 "약"은 파라미터 또는 양이 언급한 파라미터 또는 양의 + 5%를 포함하는 것을 의미한다. 하기 실시예들은 본 발명의 방법을 예시하기 위한 목적으로 기술되며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
·( Aib 8 ,35 ) hGLP -1(7-36)- NH 2 (서열번호 2)의 합성
(Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)는, 압축 공기 모터와 PTFE 교반기가 장착된 35L 유리 반응기(Quark, Vineland, NJ, USA)에서 합성하였다. Fmoc Rink 아미드 MBHA 수지(Merck Biosciences, Darmstadt, Germany)는 0.63 mmol/g의 투입율로 사용하였다. Fmoc 아미노산들은(Synthetech Inc., Albany, OR, USA) 다음과 같은 측쇄 보호된 것을 사용하였다: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Boc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, 및 Fmoc-Tyr(tBu)-OH. 하기 Fmoc 아미노산들은 측쇄 보호가 필요 없었다: Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, 및 Fmoc-Val-OH.
합성은 0.63 몰 규모 (1 kg 투입 수지)로 수행하였다. 처음 29개의 아미노산(N-말단의 히스티딘을 제외한 전체)들은 3.0 당량의 아미노산을 이용하여 커플링하고, 2.94 당량의 TBTU (Fluka, Seelze, Germany), 2.94 당량의 HOBt (Fluka, Seelze, Germany) 및 4.5 당량의 DIEA (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK)로 4.5 L의 DMF 중에서 전활성화하였다. 커플링 시간은 60분이었다. Boc-His(Trt)-OH는 3.4 당량의 아미노산, 4.08 당량의 HATU (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) 및 9 당량의 DIEA를 4.5 L의 DMF 중에서 사용하여 커플링시켰다. 첫 커플링 하기 전과 이후의 각각의 커플링을 수행한 후에, DMF 중에 2 x 10 L의 25% (v/v) 피페리딘을 이용하여, 수지의 탈보호를 수행하였다.
수지 상에서 펩타이드 조립이 완료되면, 수지를 10 L의 메탄올(Labscan, Dublin, Ireland)로 2번 헹구고, 진공 오븐기(Mason Technology, Dublin, Ireland)에서 LOD (건조감량) < 1%로 건조하였다. 수지를 먼저 반응기 안에서 질소로 건조한 다음, 주위 온도 약 22℃, < 50mbar에서 진공 오븐기에 넣어 최종 건조를 수행하였다. 건조 전 과정에는 3일이 소요되었다. 펩티딜-수지 4200 g을 수득하였다.
수지에서 펩타이드를 잘라내고, 6 x 700 g의 서브-롯트(lot)에서, 각각의 서브-롯트에 대해, 170분간 TFA/TIPS/물 (80/14.3/5.7 % v/v) 8.4 L의 절단 칵테일을 이용하여, 측쇄-보호기를 제거하였다. 수지를 0.7 L의 TFA로 헹구고, 여과물을 조합하였다. 절단 칵테일은 회전식 증발기 (Buchi, Flawil, Switzerland)를 이용하여 최초 무게의 14-32%로 농축시키고, 조생성물 펩타이드는 교반중인 MTBE (Labscan, Dublin, Ireland) 13.6-17.5 L에 석출시켰다. 조생성물 펩타이드를 1.5-7.5 L의 MTBE로 추가로 헹구었다.
N-O 시프트의 반전은, 석출된 조생성물 펩타이드를 암모늄 아세테이트 완충액(10 g 펩타이드/100 ml, 10% w/v, 즉, 10 g 펩타이드/100 ml 완충액, pH 8-9)에서 60분간 슬러리화함으로써 수행하였다. 14-18 L의 빙초산을 이용하여 pH를 3.3-3.7로 조절하고, HPLC 순도가 약 50%인 투명한 조생성물 펩타이드 용액을 수득하였다. 이 펩타이드 용액을, 정제하기 전에, 0.45 ㎛ 필터 (Pall Gelman Sciences Inc., New York, NY, USA)를 통과시켰다.
펩타이드는 C18 정지상 (EKA Chemicals AB, Bohus, Sweden)이 충전된, 분취용 역상 HPLC 컬럼 (Novasep, Pompey, France)을 이용하여 정제하였다. 정제는 물 및 아세토니트릴 중의 1% TFA를 이용한 농도 구배 용출 하에 수행하였다.
염 교환 크로마토그래피 단계를 암모늄 아세테이트 및 아세트산 완충액을 이용하여 수행하여, 아세테이트 염을 생성시켰다. 구체적으로, 펩타이드를 HPLC 컬럼에 주입하였다. 펩타이드는 1시간 동안 암모늄 아세테이트 완충액으로 컬럼에서 헹군 다음, 아세트산/아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 컬럼으로부터 용출시켰다.
정제된 펩타이드의 순도는 HPLC 분석에 따라 > 99%였다. 구체적으로, 펩타이드 용액을 회전식 증발기 (최대 온도 40℃)에서 농축하고, 제조되는 용액을 0.45 ㎛ 필터 (Pall Gelman Sciences Inc., New York, NY, USA)를 통과시킨 다음 동결 건조하였다.
마지막 히스티딘을 커플링하기 위한 HATU/DIEA 시스템은, TBTU/HBTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt 또는 HATU/HOBt/DIEA 시스템과 비교하여, 29 mer를 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)로 변환시키는데 더욱 우수하였으며, 그래서 수율이 증가하였다.
또한, Boc-보호된 히스티딘을 사용하면, Fmoc-보호된 히스티딘과 비교하여, 절단 전에 Fmoc를 제거할 필요가 없기 때문에, 수율이 보다 우수하고, 처리 시간을 약간 단축시킬 수 있다. 실험적 연구의 통계 설계는 히스티딘 커플링과 수지에서의 절단 모두에 대해 수행하여, 하기 표에 나타낸 바와 같이 수율을 높이기 위한 최적 조합의 시약 비율과 반응 시간을 선정하였다.
당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이. N-O 시프트는 산성 조건에 노출된 동안에 트레오닌이나 세린 잔기를 포함하는 펩타이드에서 발생되는 아실 시프트이다. 그 결과, 수율을 낮추는 이성체 불순물이 생겨나, 순도에 문제가 될 수 있다. 이러한 N-O 시프트는, 펩타이드를 약염기성 매질(예, pH 8-9)에 둔 다음, pH를 다시 약 3으로 낮춤으로써, 반전시킨다. 이러한 공정은, N-O 시프트 반전을, 완전한 용액-기반의 반전 프로세스에 비해, 규모면에서 유익한 슬러리로서 수행할 수 있게 한다.
표 1: (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 N-말단 히스디틴 잔기의 커플링을 최적화하기 위한, 소규모의 실험 연구 설계(및 이의 수율/순도 결과)
실험 번호 히스티딘 당량 HATU / His 비율 DIEA 당량 반응 시간 수율 (%) 순도 (%) D- His 수준 (%) Des - His 수준 (%)
1 3 0.6 4.5 0.5 18.52 56.52 0.1 0.27
2 6 0.6 4.5 4 23.51 62.76 0.14 0.06
3 3 1.2 4.5 4 26.44 63.43 0.05 0.1
4 6 1.2 4.5 0.5 13.17 31.94 0.07 1.29
5 3 0.6 9 4 25.18 56.47 0.14 0.16
6 6 0.6 9 0.5 21.09 53.89 0.11 0.14
7 3 1.2 9 0.5 21.65 58.93 0.06 0.2
8 6 1.2 9 4 27.50 62.48 0.03 0.11
9 4.5 0.9 6.75 2.25 25.73 58.87 0.08 0.06
10 4.5 0.9 6.75 2.25 26.61 61.1 0.06 0.06
주의: 상기 결과에는, 조생성물 펩타이드에서의 커플링(D- 및 Des-히스티딘)으로 인한 불순물의 수준도 포함되어 있다.
표 2: 최적화된 히스티딘 커플링 조건((3.4 당량의 Boc-His, 4.08 당량의 HATU, 9.0의 당량 DIEA, 및 2.9 시간의 반응 시간)을 이용한 반복적인 소규모 및 대규모의 합성 결과
규모(투입 수지) 수율 (%) 순도 (%) D-His 수준 (%) Des-His 수준 (%)
0.5 g 29.2 57.7 2.5 1.7
0.5 g 30.4 59.4 2.7 3.3
0.5 g 27.8 56.0 3.8 2.7
160 g 27.8 56.01 3.19 1.93
160 g 29.2 52.22 2.40 0.90
주의: 상기 결과에는 조생성물 펩타이드에서의 커플링(D- 및 Des-히스티딘)으로 인한 불순물의 수준도 포함되어 있다.
표 3: 수지로부터 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 절단을 최적화하기 위한 소규모 실험 연구 설계(및 수율/순도 결과)
실험 번호 수지에 대한 칵테일의 부피배 시간 TIPS / H 2 O 비율 수율 (%) 순도 (%)
1 5 0.5 1 3.9 12.6
2 15 0.5 1 14.7 29.4
3 5 4 1 24.1 44.9
4 15 4 1 30.3 52.1
5 5 0.5 4 6.9 25.6
6 15 0.5 4 20.1 47
7 5 4 4 23.9 47.9
8 15 4 4 29.6 56.6
9 10 2.25 2.5 29.1 58.8
10 10 2.25 2.5 29.4 58.9
주의: 상기 실험들에서 TFA가 절단 칵테일의 80%를 구성함
표 4: 절단 최적화 실험: 12 부피배의 절단 칵테일(수지 중량 대비), 80% TFA, 2.8 시간의 반응 시간 및 2.5:1의 TIPS:H2O 비율
투입 수지 규모 수율 (%) 순도 (%)
10g 29.1 51.9
100g 27.8 51.5
100g 27.1 52.7
주의: 상기 결과는 N-O 시프트 반전 후임
상기 표2 및 4에 나타낸 바와 같이, 조생성물 제조 공정(절단 칵테일의 증발 및 MTBE 중에서의 석출이 포함됨)은 수율에 영향을 미치지 않으면서 대량 석출되도록 최적화되었다. 궁극적으로, 대규모 합성(1 kg 투입 수지)을 수행한 다음, 서브-로트를 전달하였으며, 이의 전체 합성 수율은 27%로, 이는 보다 낮은 규모로 수행한 이전 방법의 수율에 비해 약 8% 높았다.
정제 방법을 개발하기 위해, 처음에 사용되는 TFA 농도 구배를 변형시켜, 순도 > 99%로 물질을 수득하는데 요구되는 정제 과정의 수를 최소화하는데 노력을 집중하였으며, 그 결과 정제 수율은 50-60%가 되었다.
기타 구현예들
상기 설명으로부터, 당해 기술 분야의 당업자들은 본 발명의 기본적인 특징들을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상과 범위로부터 이탈하지 않으면서 다양한 용도와 조건에 맞도록 본 발명에 대한 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있다. 따라서, 기타 구현예들도 청구항에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> IPSEN MANUFACTURING IRELAND LIMITED DONG, Zheng Xin LOUGHMAN, Thomas C HURLEY, Fionn JOHNSON, Steven R <120> Process for the Synthesis of (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 <130> 162P/PCT2 <150> US 61/192,939 <151> 2008-09-22 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 2 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> modified with resin <400> 3 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> modified with resin <400> 4 Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) protecting group at N-terminus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> modified with resin <400> 5 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> modified with trityl (Trt) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) sidechain protecting group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> modified with resin <400> 6 Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) protecting group at N-terminus <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> modified with trityl (Trt) sidechain protecting group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> modified with trityl (Trt) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) sidechain protecting group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> modified with 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> modified with resin <400> 7 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> AMIDATION <400> 8 Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 20 25 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> AMIDATION <400> 9 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 20 25 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> modified with trityl (Trt) sidechain protecting group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> modified with tert-butyl ether (tBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> modified with trityl (Trt) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> modified with tert-butyl ester (OtBu) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> modified with tert-butyloxycarbonyl (Boc) sidechain protecting group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa = alpha-aminoisobutyric acid (Aib) <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) sidechain protecting group <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> modified with resin <400> 10 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30

Claims (29)

  1. 단계적인 고상 Fmoc-화학 반응을 포함하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) (Aib8 ,35)hGLP-1(8-35)-NH2 (서열번호 8)의 C-말단에서 N-말단까지의, Fmoc-아미노산들을 측쇄 보호된 Arg 수지에 순차적으로 커플링하고, 상기 Fmoc 기는 각각의 순차적인 커플링 단계 후에 N-말단으로부터 제거하여, 측쇄-보호된, Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 4)를 수득하는 단계;
    (b) 상기 측쇄-보호된 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 4)를 측쇄-보호된 Boc-His-OH와 커플링하여, 측쇄-보호된 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 5)를 수득하는 단계;
    (c) 상기 측쇄-보호된 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 5)에 절단 칵테일을 처리하고, 측쇄-보호기와 N-말단 보호기를 제거함으로써, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 조생성물을 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하여, 정제된 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 수득하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단계 (a) 전에 선행되는, 하기 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법:
    (a-1) 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 Fmoc-보호된 수지를 탈보호화하여, 수지에서 Fmoc 기를 제거하는 단계;
    (a-2) 상기 수지 상에 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH를 부착시켜, 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지를 수득하는 단계; 및
    (a-3) 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지로부터 Fmoc 기를 제거하여, 측쇄-보호된 Arg 수지를 수득하는 단계.
  4. 제3항에 있어서,
    단계 (a-2)에서 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH이며;
    상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지는 Fmoc-Arg(Pbf) 수지이며;
    상기 측쇄-보호된 Arg 수지는 측쇄 보호된 Arg(Pbf) 수지이며;
    식 (Aib8 ,35)hGLP-1(8-35)-NH2 (서열번호 8)의 C-말단에서 N-말단까지의 상기 Fmoc-아미노산들은 Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH 및 Fmoc-Aib-OH이며;
    상기 측쇄-보호된 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 4)는 Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf) 수지 (서열번호 6)이며;
    상기 측쇄-보호된 Boc-His-OH는 Boc-His(Trt)-OH이며;
    상기 측쇄-보호된 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 5)는 Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf) 수지 (서열번호 7)이며;
    상기 절단 칵테일은 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일, TFA/페놀/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/EDT 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/1-도데칸티올 절단 칵테일, TFA/DTT/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀 절단 칵테일, TFA/페놀/메탄설폰산 절단 칵테일, TFA/티오아니솔/EDT/아니솔 절단 칵테일, TFA/TES 절단 칵테일, TFA/물 절단 칵테일, TFA/DCM/인돌 절단 칵테일, 및 TFA/TIPS 절단 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    펩타이드를 만들 수 있는 상기 수지가 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지, 및 Sieber 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 절단 칵테일은 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일, 및 TFA/물 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    펩타이드 아미드를 만들 수 있는 상기 수지는 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, 및 PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 수지는 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지인 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단계 (d)는 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법:
    (d-1) 여과하여 수지를 제거함으로써, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 수득하는 단계;
    (d-2) 상기 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 농축하는 단계;
    (d-3) 상기 농축한 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물로부터 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 석출하는 단계;
    (d-4) 상기 석출된 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)을 암모늄 아세테이트 완충액 중에 슬러리화하여, N-O 시프트 반전(shift reversal)을 수행하는 단계;
    (d-5) 상기 슬러리의 pH를 조절하여, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 용액을 수득하는 단계; 및
    (d-6) (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 N-O 시프트 반전은 상기 석출된 조생성물 (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 약염기성 매질에 둔 다음 pH를 약 3 - 3.7로 다시 낮춤으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 수지로부터 Fmoc 기의 제거는 DMF 중의 피페리딘을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 DMF 중의 피페리딘의 농도는 약 25% (v/v)인 것을 특징으로 하는, (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서,
    (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들은 TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA, 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 C-말단으로부터 시작되는 처음 29개의 아미노산 잔기들은 TBTU/HOBt 또는 TBTU/HBTU/DIEA 중 어느 하나의 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되며;
    N-말단의 히스티딘은 HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HBTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA, 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 C-말단으로부터 시작되는 처음 29개의 아미노산 잔기들을 커플링하는데 사용되는 상기 커플링 시약의 조합은 TBTU/HOBt이고;
    N-말단의 히스티딘을 커플링하는데 사용되는 상기 커플링 시약의 조합은 HATU/DIEA인 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)에서 C-말단으로부터 시작되는 처음 29개의 아미노산 잔기들은, 약 5배 부피의 DMF 중에서, 각 Fmoc-아미노산 약 3.0 당량, TBTU 약 2.94 당량, HOBt 약 2.94 당량 및 DIEA 약 4.5 당량을 이용하여 커플링되며;
    N-말단의 히스티딘은, 약 5배 부피의 DMF 중에서, 3.4 당량의 Boc-His(Trt)-OH, 약 4.08 당량의 HATU 및 약 9.0 당량의 DIEA를 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    (a) (Aib8 ,35)hGLP-1(7-35)-NH2 (서열번호 9)에서 C-말단에서 N-말단까지의 Fmoc-아미노산을 측쇄-보호된 Arg 수지에 순차적으로 커플링하고, 각각의 순차적인 커플링 단계 후 N-말단으로부터 Fmoc 기를 제거하여, 측쇄-보호된 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 3)을 수득하는 단계;
    (b) 측쇄-보호된 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 3)에 절단 칵테일을 처리하고, 이로부터 측쇄-보호된 기를 제거하여, 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 수득하는 단계;
    (c) 상기 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하여, 정제된 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 수득하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단계 (a) 이전에 선행하는, 하기 단계들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법:
    (a-1) 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 Fmoc-보호된 수지를 탈보호화하여, 수지로부터 Fmoc 기를 제거하는 단계;
    (a-2) 상기 수지 상에 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH를 부착시켜, 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지를 수득하는 단계; 및
    (a-3) 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지로부터 Fmoc 기를 제거하여, 측쇄-보호된 Arg 수지를 수득하는 단계.
  18. 제17항에 있어서,
    단계 (a-2)에서 상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg-OH는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH이며;
    상기 측쇄-보호된 Fmoc-Arg 수지는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 및 Fmoc-Arg(Pbf) 수지이며;
    상기 측쇄-보호된 Arg 수지는 측쇄 보호된 Arg(Pbf) 수지이며;
    식 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-35)-NH2 (서열번호 9)에서 C-말단으로부터 N-말단까지의 상기 Fmoc-아미노산들은 Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Aib-OH 및 Fmoc-His(Trt)-OH이며;
    상기 측쇄-보호된 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 수지 (서열번호 3)는 His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf) 수지 (서열번호 10)이며;
    상기 절단 칵테일은 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일, TFA/페놀/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/EDT 절단 칵테일, TFA/페놀/물/티오아니솔/1-도데칸티올 절단 칵테일, TFA/DTT/물/TIPS 절단 칵테일, TFA/페놀 절단 칵테일, TFA/페놀/메탄설폰산 절단 칵테일, TFA/티오아니솔/EDT/아니솔 절단 칵테일, TFA/TES 절단 칵테일, TFA/물 절단 칵테일, TFA/DCM/인돌 절단 칵테일 및 TFA/TIPS 절단 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    펩타이드를 만들 수 있는 상기 수지는 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지, 및 Sieber 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 절단 칵테일은 TFA/TIPS/물 절단 칵테일, TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일 및 TFA/물 칵테일로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    펩타이드 아미드를 만들 수 있는 상기 수지는 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지, Fmoc-Rink 아미드-AM 수지, 및 PEG-기반의 Fmoc-Rink 아미드 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 펩타이드 아미드를 만들 수 있는 수지는 Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지인 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단계 (c)는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법:
    (c-1) 여과하여 수지를 제거함으로써, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 수득하는 단계;
    (c-2) 상기 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물을 농축하는 단계;
    (c-3) 상기 농축한 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)/절단 칵테일 여과물로부터 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 석출하는 단계;
    (c-4) 상기 석출된 조생성물 (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)을 암모늄 아세테이트 완충액 중에 슬러리화하여, N-O 시프트 반전(shift reversal)을 수행하는 단계;
    (c-5) 상기 슬러리의 pH를 조절하여, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 용액을 수득하는 단계; 및
    (c-6) (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 분리 및 정제하는 단계.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 단계 (c-4)에서의 N-O 시프트 반전은 상기 석출된 조생성물 (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)를 약염기성 매질에 둔 다음 pH를 약 3 - 3.7로 다시 낮춤으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 수지에서의 Fmoc 기의 제거는 DMF 중의 피페리딘을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 DMF 중의 피페리딘의 농도는 약 25% (v/v)인 것을 특징으로 하는, (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한항에 있어서,
    (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들은 TBTU/HOBt, TBTU/HBTU/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, TBTU/HOBt/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들은 TBTU/HOBt 또는 TBTU/HBTU/DIEA 중 어느 하나의 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  28. 제27항에 있어서, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들은 TBTU/HOBt의 커플링 시약의 조합을 이용하여 커플링되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 아미노산 잔기들은, 약 3.0 당량의 각각의 Fmoc-아미노산, 약 2.94 당량의 TBTU, 약 2.94 당량의 HOBt 및 약 4.5 당량의 DIEA를 이용하여, 약 5배 부피의 DMF 중에서 커플링되는 것을 특징으로 하는, (Aib8 ,35)hGLP-1(7-36)-NH2 (서열번호 2)의 합성 방법.
KR1020117008496A 2008-09-22 2009-09-22 (Ａｉｂ8,35)ｈＧＬＰ-1(7-36)-ＮＨ₂의 합성 방법 KR20110070870A (ko)

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