CN115594754A - 一种特立帕肽的制备方法 - Google Patents
一种特立帕肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115594754A CN115594754A CN202110777224.3A CN202110777224A CN115594754A CN 115594754 A CN115594754 A CN 115594754A CN 202110777224 A CN202110777224 A CN 202110777224A CN 115594754 A CN115594754 A CN 115594754A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fmoc
- resin
- otbu
- trt
- teriparatide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- 229960005460 teriparatide Drugs 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 62
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 62
- 229920003180 amino resin Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims abstract description 13
- -1 fmoc-Val-OH Chemical compound 0.000 claims description 38
- XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(1-tritylimidazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(N=C1)=CN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N 0.000 claims description 18
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 18
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 14
- KJYAFJQCGPUXJY-UMSFTDKQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxo-4-(tritylamino)butanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(=O)NC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KJYAFJQCGPUXJY-UMSFTDKQSA-N 0.000 claims description 13
- OTKXCALUHMPIGM-FQEVSTJZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 OTKXCALUHMPIGM-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims description 12
- WDGICUODAOGOMO-DHUJRADRSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-oxo-5-(tritylamino)pentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CC(=O)NC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 WDGICUODAOGOMO-DHUJRADRSA-N 0.000 claims description 12
- HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N (2s)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N 0.000 claims description 12
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[[4-[2-[bis(4-methylphenyl)methylamino]-2-oxoethoxy]phenyl]-(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OCC(=O)NC(C=2C=CC(C)=CC=2)C=2C=CC(C)=CC=2)=CC=1)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- ADOHASQZJSJZBT-SANMLTNESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]indol-3-yl]propanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C(=O)OC(C)(C)C)C=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ADOHASQZJSJZBT-SANMLTNESA-N 0.000 claims description 6
- FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 6
- FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-carboxyphenyl)phenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(O)=O)C=C1 FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 5
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 claims description 5
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 claims description 4
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 3
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 39
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 19
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 12
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 12
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical group CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- SEEPANYCNGTZFQ-UHFFFAOYSA-N sulfadiazine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)NC1=NC=CC=N1 SEEPANYCNGTZFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPYXQYWILNVAU-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1.C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 DFPYXQYWILNVAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 description 1
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 description 1
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- OGBMKVWORPGQRR-UHFFFAOYSA-N forteo Chemical compound C=1NC=NC=1CC(C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCSC)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC=1N=CNC=1)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)CNC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CO)C(C)C)C(C)CC)CC1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 description 1
- PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=NC=C1 PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C.CCN(C(C)C)C(C)C WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N nesiritide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N 0.000 description 1
- 229960001267 nesiritide Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XUWHAWMETYGRKB-UHFFFAOYSA-N piperidin-2-one Chemical compound O=C1CCCCN1 XUWHAWMETYGRKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001685 postmenopausal osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- CILIXQOJUNDIDU-ASQIGDHWSA-N teduglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 CILIXQOJUNDIDU-ASQIGDHWSA-N 0.000 description 1
- 108010073046 teduglutide Proteins 0.000 description 1
- 229960002444 teduglutide Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHSJPLSEQNCRLW-UHFFFAOYSA-N triphenylmethyl radical Chemical compound C1=CC=CC=C1[C](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OHSJPLSEQNCRLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种特立帕肽的制备方法。具体地,包括步骤:(a)提供Fmoc‑Asp(氨基树脂)‑Phe‑OtBu;(b)在偶联剂存在下,使Fmoc‑Asp(氨基树脂)‑Phe‑OtBu依次与特立帕肽肽序32‑1位氨基酸的氨基酸前体进行偶联反应,得到侧链保护的特立帕肽肽树脂;和(c)在裂解试剂存在下,裂解所述特立帕肽肽树脂,从而得到特立帕肽粗品。本发明的方法制备的特立帕肽副产物少、产率高,易纯化。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域,特别涉及一种特立帕肽的制备方法。
背景技术
特立帕肽(Teriparatide)是内源性甲状旁腺激素N-末端区域1-34氨基酸片段,其肽序为:
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。本品由礼来公司研发,主要用于治疗原发性骨质疏松,女性绝经后骨质疏松及男性性腺功能衰退后骨质疏松,其生产方法为生物发酵。
2017年10月,FDA发文批准胰高血糖素,利拉鲁肽,奈西立肽,特立帕肽,替度鲁肽五个生物发酵多肽药物按化学合成药物申报,针对此类长肽,目前常规合成方法是固相合成。
特立帕肽的C端第一个氨基酸为苯丙氨酸,偶联过程中易发生消旋,在与WangResin偶联时需添加催化剂DMAP,进一步加剧消旋的风险,此位点消旋难以分离。此外,在实际生产过程中发现,33位Asn在脱Fmoc后,易于按二嗪哌酮机制脱去C端两个氨基酸,生成33~34位二肽缺失肽,且合成规模越大,二肽缺失肽占比越高,大大降低生产收率。
专利201210213044.3以片段偶联的方式将PTH分为五段,根据肽序逐段偶联,五肽片段均需自己合成,纯化,不易通过供应商获得稳定供应渠道,不利于工业化生产。
专利201510005427.5采取传统的固相合成方法,由肽链C端向N端逐步合成特立帕肽,虽然操作简便,但无法避免以二嗪哌酮机制产生的33~34位二肽缺失肽,也无法避免34位Phe的末端消旋,导致粗品纯度不高,且在进行精肽质量研究时需分离34位Phe消旋杂质,和33位Asn消旋杂质。
专利201410262511.0在肽链的16~17位采用假脯氨酸二肽的方式投料,避免了特定工艺杂质的产生,但同样无法避免33~34位二肽缺失肽,也无法避免34位Phe的末端消旋;
专利201310403743.9采用逐步偶联法合成,在17位Ser与16位Asn之间通过一步酯胺转换得到主链,通过降低空间位阻来提升偶联效率,但酯胺转换一步反应存在转化率问题,导致工艺收率不高,最终成本增加。
因此,本领域需要提供一种能避免消旋、副产物少、产率高的特立帕肽制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能避免消旋、副产物少、产率高的特立帕肽制备方法。
本发明第一方面,提供了一种特立帕肽的制备方法,包括如下步骤:
(a)提供Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu;
(b)在偶联剂存在下,使Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu依次与特立帕肽肽序32-1位氨基酸的氨基酸前体进行偶联反应,得到侧链保护的特立帕肽肽树脂;和
(c)在裂解试剂存在下,裂解所述特立帕肽肽树脂,从而得到特立帕肽粗品。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,所述特立帕肽肽序32-1位氨基酸的氨基酸前体依次为Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH,得到的侧链保护的特立帕肽肽树脂结构如下:
Fmoc-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asp(Amide Resin)-Phe-OtBu。
在另一优选例中,步骤(a)中,所述Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu中的氨基树脂的替代度为0.3~0.5mmol/g,如0.35mmol/g或0.4mmol/g。
在另一优选例中,步骤(a)中,所述Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu中的氨基树脂选自下组:Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin。
在另一优选例中,步骤(b)中,各偶联反应的偶联剂独立地选自下组:HOBt/DIC、HOAt/DIC、HOBt/HBTU/DIEA、PyBOP/DIEA、TBTU/DIEA,或其组合。
在另一优选例中,步骤(b)中,各偶联反应各自独立地包括一个或多个以下特征:
(1)氨基酸前体在反应前先脱除Fmoc基团,较佳地,脱Fmoc试剂为20%哌啶/DMF(体积比);
(2)树脂与氨基酸前体的摩尔比为1:2.0-3.5,较佳地,1:2.5-3.0,所述树脂用量以其总替代度计算;
(3)氨基酸前体与偶联剂的摩尔比为1:1-1.5,较佳地,1:1.1-1.2;
(4)反应溶剂为DMF/DCM的混合溶液,较佳地,为DMF/DCM体积比为1:1的混合溶液;和/或
(5)反应液中还加入DIC或DCC活化偶联剂,较佳地,DIC与偶联剂的摩尔比为1-1.2:1。
在另一优选例中,步骤(b)中,各偶联反应各自独立地包括一个或多个以下特征:
(1)所述反应在惰性气体氛围下进行,较佳地,N2;
(2)所述反应的温度为25±10℃,较佳地,25±5℃;
(3)所述反应的时间为1-6h,较佳地,2-3h;和/或
(4)一个反应结束后,分离反应液,洗涤树脂,以进行下一步反应或结束反应。
在另一优选例中,步骤(c)中,裂解试剂为包含体积比为5~10%清除剂的TFA溶液,其中所述清除剂选自下组:二硫苏糖醇、苯甲硫醚、苯酚、巯基乙醇、水和三异丙基硅烷,或其组合。
在另一优选例中,所述方法还包括纯化步骤,从而得到特立帕肽精品;优选地,所述纯化步骤可包括选自下组步骤:反相色谱分离、纳滤、冻干,或其组合。
在另一优选例中,所述纯化方法包括一个或多个下述步骤:
(1)色谱纯化:C18制备柱,流动相A为0.1%TFA/水,流动相B为0.1%TFA/乙腈,梯度洗脱;和/或
(2)色谱纯化:C18制备柱,以0.1%的醋酸/水为A相,以0.1%的醋酸/乙腈为B相,梯度洗脱。
本发明第二方面,提供了一种用于制备特立帕肽的中间体,所述中间体为Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu:
在另一优选例中,所述Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu中的氨基树脂选自下组:Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin。
本发明第三方面,本发明提供了Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu用于制备特立帕肽的用途。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为本领域常规固相合成方法制备特立帕肽的流程示意图;
图2为本发明合成方法制备特立帕肽的流程示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,通过大量筛选和测试,提供了一种特立帕肽的制备方法。本发明采用特定的Fmoc-Asp-Phe-OtBu二肽前体,将Asp羧基直接与氨基树脂偶联,形成地Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu作为原料合成特立帕肽,意外地,使用所述原料不仅避免了34位Phe消旋和33位Asn消旋,而且避免了33~34位二肽缺失肽的生成,从而减少反应副产物,提高产率和产品纯度。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用,术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃,较佳地,25±5℃,如未特别说明,操作的温度可为常温。
如本文所以,术语“Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu”与Fmoc-Asp(Amide Resin)-Phe-OtBu、“本发明的中间体”可互换使用。
特立帕肽
特立帕肽(Teriparatide)是内源性甲状旁腺激素N-末端区域1-34氨基酸片段,其肽序为:
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。
本发明中,特立帕肽的肽序以N端为起始,即Ser为第1位,Phe为第34位。
Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu
本发明提供了一种用于制备特立帕肽的关键中间体Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu:
本发明对所述中间体的制备方法没有特别要求,可以以本发明的Fmoc-Asp-Phe-OtBu氨基酸前体与氨基树脂在常用的固相合成条件下制备。例如,在偶联剂存在下,使Fmoc-Asp-Phe-OtBu的羧基与氨基树脂(脱保护基状态下)的氨基发生酰胺反应,从而得到所述Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu。
本发明中,对所述氨基树脂种类没有特别要求,可以为各种能够对羧基进行酰胺修饰的固相合成载体。氨基树脂在进行固相合成之前需要进行前处理程序(如洗涤、溶胀、脱Fmoc)对本领域技术人员而言是容易知道的,或可按照产品说明书进行。优选地,所述的氨基树脂可以为(包括但并不限于)Rink Amide Resin,Rink Amide AM Resin,Rink AmideMBHA Resin。
本发明的所述中间体通过将Fmoc-Asp-Phe-OtBu氨基酸前体的Asp的羧基直接连接到氨基树脂上,使Phe无需参与接下来的偶联反应,从而防止了34位的Phe在发生偶联反应时产生的消旋现象,而Phe上的叔丁基的空间位足能够阻止二嗪哌酮的生成,抑制了二肽缺失肽的生成,能够有效提高特立帕肽固态合成产率,减少副产物生成,简化纯化过程。
特立帕肽的制备方法
本发明提供了一种特立帕肽的制备方法,包括:氨基树脂与Fmoc-Asp-Phe-OtBu氨基酸前体进行偶联反应作为起始步骤,或直接所述使用Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu作为起始原料的步骤。
进一步地,在Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu的基础上,按照特立帕肽的肽序,与相应的氨基酸前体依次进行偶联反应,从而获得特立帕肽粗品。用于合成32-1位氨基酸的氨基酸前体可采用本领域常用的氨基酸前体。通常,氨基酸前体的N段被Fmoc、Boc等保护,在反应前需脱保护;且氨基酸前体中不希望参与偶联反应的反应基团被其他保护基团保护(如Boc,Trt,OtBu,tBu,Pbf等),这对本领域技术人员而言是容易理解和得到的。
优选地,用于合成32-1位氨基酸的前体依次为:Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH。
本发明中,各氨基酸前体的偶联反应可采用本领域常规方法,通常包括:脱去Fomc,以及在偶联剂存在下进行偶联反应。常用的偶联剂包括(但并不限于):HOBt/DIC、HOAt/DIC、HOBt/HBTU/DIEA、PyBOP/DIEA、TBTU/DIEA,或其组合。
此外,在偶联反应完成后,还包括步骤对得到的特立帕肽肽树脂进行裂解反应,脱除保护基和树脂的步骤。所述裂解反应可在本领域常用的裂解条件下进行。例如,在裂解试剂存在下进行裂解,优选地,裂解试剂可以为加入体积比为5~10%清除剂的TFA溶液,更佳地,所述清除剂选自下组:二硫苏糖醇、苯甲硫醚、苯酚、巯基乙醇、水和三异丙基硅烷,或其组合。
本发明的主要优点包括:
1:本发明的方法巧妙的避免了34位Phe消旋,33位Asn消旋,提升了产品质量,大大减轻了后续去除有关物质的压力。
2:本发明的方法还避免了33~34位二肽缺失肽的生成,将总体收率提升10%以上。
3.本发明的方法原料易得,操作简单,易于质控、产率高,副产物少,且产物易纯化。
下面结合具体实施,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下:
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Rink Amide AM ResinAM 氨基树脂
Rink Amide MBHA ResinMBHA 氨基树脂
tBu 叔丁基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
实施例1:Fmoc-Asp(Rink Amide AM Resin)-Phe-OtBu的合成
称取171.42g(Sub=0.35mmol/g)Rink Amide AM Resin置于固相反应器,以DMF洗涤树脂两次,DCM溶胀树脂30min,1.7L/次。树脂溶胀完成后以20%的哌啶/DMF脱Fmoc 2次,1.7L/次,第一次反应5min和第二次10min;脱保护完成后以DMF洗涤6次,1.7L/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Asp-Phe-OtBu100.44g(180.0mmol,3.0eq),HOBt 26.73g(198.0mmol,3.3eq),以800.0ml体积比为1:1的DMF/DCM的混合溶液溶解,预冻至-5~5℃,加入DIC31.68ml(198.0mmol,3.3eq)活化5min。
树脂洗涤完成投料反应,机械搅拌加氮气保护,反应温度25℃,偶联反应2.0h,抽去反应液,树脂以DMF洗涤6次,1.7L/次,取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈无色。
实施例2:Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA Resin)-Phe-OtBu的合成
称取131.58g(Sub=0.38mmol/g)Rink Amide MBHAResin置于固相反应器,以DMF洗涤树脂两次,DCM溶胀树脂30min,1.3L/次。树脂溶胀完成后以20%的哌啶/DMF脱Fmoc 2次,1.3L/次,第一次反应5min和第二次10min;脱保护完成后以DMF洗涤6次,1.3L/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Asp-Phe-OtBu 83.70g(150.0mmol,3.0eq),HOBt 22.28g(165.0mmol,3.3eq),以600.0ml体积比为1:1的DMF/DCM的混合溶液溶解,预冻至-5~5℃,加入DIC26.40ml(165.0mmol,3.3eq)活化5min。
树脂洗涤完成投料反应,机械搅拌加氮气保护,反应温度25℃,偶联反应2.0h,抽去反应液,树脂以DMF洗涤6次,1.3L/次,取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈无色。
实施例3:特立帕肽肽树脂的制备
实施例1所合成的Fmoc-Asp(Rink Amide AM Resin)-Phe-OtBu以20%的哌啶/DMF脱Fmoc 2次,1.7L/次,第一次5min,第二次10min;脱保护完成后以DMF洗涤6次,1.7L/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-His(Trt)-OH 111.42g(180mmol,3.0eq),HOBt 26.73g(198.0mmol,3.3eq),以800.0ml体积比为1:1的DMF/DCM溶液溶解,预冻至-5~5℃,加入DIC 31.68ml(198.0mmol,3.3eq)活化5min。
树脂洗涤完成投料反应,机械搅拌加氮气保护,反应温度25℃,偶联反应2.0h,抽去反应液,树脂以DMF洗涤6次,1.7L/次,取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈无色。
按照32位His类似的偶联方法,依照特立帕肽肽序,依次连接氨基酸:Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH。肽树脂合成结束后,脱除1位Ser氨基保护基Fmoc,依次以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,甲醇洗涤3次,1.7L/次,树脂25℃真空干燥8~12h,称重得PTH肽树脂584.1g。
实施例4:特立帕肽肽树脂的制备
实施例2所合成Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA Resin)-Phe-OtBu以20%的哌啶/DMF脱Fmoc 2次,1.3L/次,第一次5min,第二次10min;脱保护完成后以DMF洗涤6次,1.3L/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-His(Trt)-OH 92.85g(150mmol,3.0eq),HOBt 22.28g(165.0mmol,3.0eq),以600.0ml体积比为1:1的DMF/DCM溶液溶解,预冻至-5~5℃,加入DIC 26.40ml(165.0mmol,3.3eq)活化5min。
树脂洗涤完成投料反应,机械搅拌加氮气保护,反应温度25℃,偶联反应2.0h,抽去反应液,树脂以DMF洗涤6次,1.3L/次,取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈无色。
按照32位His类似的偶联方法,依照特立帕肽肽序,依次连接氨基酸:Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH。肽树脂合成结束后,脱除1位Ser氨基保护基Fmoc,依次以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,甲醇洗涤3次,1.3L/次,树脂25℃真空干燥8~12h,称重得PTH肽树脂471.1g。
实施例5:特立帕肽粗肽的制备
称取初始Sub为0.35mmol/g的Fmoc-Phe-Wang Resin142.85g置于固相合成釜,以20%的哌啶/DMF脱Fmoc 2次,1.3L/次,第一次5min,第二次10min;脱保护完成后以DMF洗涤6次,1.3L/次。取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Asn(Trt)-OH 89.55g(150mmol,3.0eq),HOBt 22.28g(165.0mmol,3.0eq),以600.0ml体积比为1:1的DMF/DCM溶液溶解,预冻至-5~5℃,加入DIC 26.40ml(165.0mmol,3.3eq)活化5min
树脂洗涤完成投料反应,机械搅拌加氮气保护,反应温度25℃,偶联反应2.0h,抽去反应液,树脂以DMF洗涤6次,1.7L/次,取小样以Kaiser试剂检测,树脂呈无色。
按照33位Asn类似的偶联方法,依照特立帕肽肽序,依次连接氨基酸:Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH。肽树脂合成结束后,脱除1位Ser氨基保护基Fmoc,依次以DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,甲醇洗涤3次,1.7L/次,树脂25℃真空干燥8~12h,称重得PTH肽树脂565.1g。
实施例6:特立帕肽粗肽的制备
称取实施例3所制备的特立帕肽肽树脂200g备用。
配置裂解试剂2000ml,其体积比为TFA:TIS:水:DTT=92:2:5:1,预冻至0±5℃备用。
氮气保护加搅拌条件下,肽树脂加入到裂解剂中,25℃搅拌2.0h,停止反应,抽滤,树脂以TFA洗涤两次,200ml/次,合并滤液,缓慢倾倒至12L预冷的乙醚中,搅拌,室温静置0.5~1.0h。将乙醚沉降液离心,3000r/min,3min/次,以乙醚洗涤/离心三次,所得固体干燥,得88.6g,收率104.85%。取粗肽样品分析,纯度为76.3%,未检出因34,33位二嗪哌酮机制而导致的二肽缺失肽。
实施例7:特立帕肽粗肽的制备
称取实施例4所制备的特立帕肽肽树脂200g备用。
配置裂解试剂2000ml,其体积比为TFA:TIS:水:DTT=92:2:5:1,预冻至0±5℃备用。
氮气保护加搅拌条件下,肽树脂加入到裂解剂中,25℃搅拌2.0h,停止反应,抽滤,树脂以TFA洗涤两次,200ml/次,合并滤液,缓慢倾倒至12L预冷的乙醚中,搅拌,室温静置0.5~1.0h。将乙醚沉降液离心,3000r/min,3min/次,以乙醚洗涤/离心三次,所得固体干燥,得91.3g,收率104.94%。取粗肽样品分析,纯度为77.1%,未检出因34,33位二嗪哌酮机制而导致的二肽缺失肽。
实施例8:特立帕肽粗肽的制备
称取实施例5所制备的特立帕肽肽树脂200g备用。
配置裂解试剂2000ml,其体积比为TFA:TIS:水:DTT=92:2:5:1,预冻至0±5℃备用。
氮气保护加搅拌条件下,肽树脂加入到裂解剂中,25℃搅拌2.0h,停止反应,抽滤,树脂以TFA洗涤两次,200ml/次,合并滤液,缓慢倾倒至12L预冷的乙醚中,搅拌,室温静置0.5~1.0h。将乙醚沉降液离心,3000r/min,3min/次,以乙醚洗涤/离心三次,所得固体干燥,得77.01g,收率88.52%。取粗肽样品分析,纯度为62.31%,因34,33位二嗪哌酮机制而导致的二肽缺失肽占比12.55%。
实施例9:特立帕肽粗肽的纯化
称取实施例6所得粗肽30.0g,以3000ml 5%的醋酸/水溶解,0.45um滤膜过滤。
内径为150mm的C18制备柱,流动相A为0.1%TFA/水,流动相B为0.1%TFA/乙腈,流速600ml/min,检测波长210nm。梯度洗脱,根据色谱出峰时间收集馏分,中控分析纯度为97.0%的为一纯合格馏分。
一纯合格馏分在内径为150mm的C18制备柱上,以0.1%的醋酸/水为A相,以0.1%的醋酸/乙腈为B相,流速600ml/min,检测波长210nm,梯度洗脱进行二步纯化,收集制备峰峰顶段馏分,中控分析纯度>99%,单杂小于0.1%部分为二纯合格馏分。
二纯合格馏分经过旋蒸,纳滤后冻干,得特立帕肽精肽12.61g,总收率44.1%。以反相UPLC方法检测精肽有关物质,纯度99.6%,34位Phe消旋杂质及33位Asn消旋杂质均未检出。
实施例10:特立帕肽粗肽的纯化
称取实施例7所得粗肽30.0g,以3000ml 5%的醋酸/水溶解,0.45um滤膜过滤。
内径为150mm的C18制备柱,流动相A为0.1%TFA/水,流动相B为0.1%TFA/乙腈,流速600ml/min,检测波长210nm。梯度洗脱,根据色谱出峰时间收集馏分,中控分析纯度为97.0%的为一纯合格馏分。
一纯合格馏分在内径为150mm的C18制备柱上,以0.1%的醋酸/水为A相,以0.1%的醋酸/乙腈为B相,流速600ml/min,检测波长210nm,梯度洗脱进行二步纯化,收集制备峰峰顶段馏分,中控分析纯度>99%,单杂小于0.1%部分为二纯合格馏分。
二纯合格馏分经过旋蒸,纳滤后冻干,得特立帕肽精肽12.96g,总收率43.9%。以反相UPLC方法检测精肽有关物质,纯度99.6%,34位Phe消旋杂质及33位Asn消旋杂质均未检出。
实施例11:特立帕肽粗肽的纯化
称取实施例8所得粗肽30.0g,以3000ml 5%的醋酸/水溶解,0.45um滤膜过滤。
内径为150mm的C18制备柱,流动相A为0.1%TFA/水,流动相B为0.1%TFA/乙腈,流速600ml/min,检测波长210nm。梯度洗脱,根据色谱出峰时间收集馏分,中控分析纯度为97.0%的为一纯合格馏分。
一纯合格馏分在内径为150mm的C18制备柱上,以0.1%的醋酸/水为A相,以0.1%的醋酸/乙腈为B相,流速600ml/min,检测波长210nm,梯度洗脱进行二步纯化,收集制备峰峰顶段馏分,中控分析纯度>99%部分为二纯合格馏分。
二纯合格馏分经过旋蒸,纳滤后冻干,得特立帕肽精肽8.30g,总收率28.12%。以反相UPLC方法检测精肽有关物质,纯度99.25%,34位Phe消旋杂质占比0.11%,33位Asn消旋杂质占比0.08%。
综上可见,本发明的方法成功避免了34位Phe和33位Asn的消旋,同时还避免了二肽缺失肽的产生,使得制备的特立帕肽产品中不含难分离的消旋杂质,产率显著提高,且产品易于纯化,非常适合特立帕肽的工业化生产。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种特立帕肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a)提供Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu;
(b)在偶联剂存在下,使Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu依次与特立帕肽肽序32-1位氨基酸的氨基酸前体进行偶联反应,得到侧链保护的特立帕肽肽树脂;和
(c)在裂解试剂存在下,裂解所述特立帕肽肽树脂,从而得到特立帕肽粗品。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,所述特立帕肽肽序32-1位氨基酸的氨基酸前体依次为Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH,得到的侧链保护的特立帕肽肽树脂结构如下:
Fmoc-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asp(Amide Resin)-Phe-OtBu。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,所述Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu中的氨基树脂选自下组:Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、RinkAmide MBHA Resin。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,各偶联反应的偶联剂独立地选自下组:HOBt/DIC、HOAt/DIC、HOBt/HBTU/DIEA、PyBOP/DIEA、TBTU/DIEA,或其组合。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(c)中,裂解试剂为包含体积比为5~10%清除剂的TFA溶液,其中所述清除剂选自下组:二硫苏糖醇、苯甲硫醚、苯酚、巯基乙醇、水和三异丙基硅烷,或其组合。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述方法还包括纯化步骤,从而得到特立帕肽精品;优选地,所述纯化步骤可包括选自下组步骤:反相色谱分离、纳滤、冻干,或其组合。
9.根据权利要求8所述的中间体,其特征在于,所述Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu中的氨基树脂选自下组:Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHAResin。
10.Fmoc-Asp(氨基树脂)-Phe-OtBu用于制备特立帕肽的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110777224.3A CN115594754A (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 一种特立帕肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110777224.3A CN115594754A (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 一种特立帕肽的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115594754A true CN115594754A (zh) | 2023-01-13 |
Family
ID=84841125
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110777224.3A Pending CN115594754A (zh) | 2021-07-09 | 2021-07-09 | 一种特立帕肽的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115594754A (zh) |
-
2021
- 2021-07-09 CN CN202110777224.3A patent/CN115594754A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109311961B (zh) | 一种索马鲁肽的合成方法 | |
CN106699871B (zh) | 一种利拉鲁肽的制备方法 | |
EP2757107B1 (en) | Method for solid phase synthesis of liraglutide | |
CN109180801B (zh) | 一种合成索玛鲁肽的方法 | |
CN110294800B (zh) | 一种索玛鲁肽的制备方法 | |
CN107573408B (zh) | 一种高纯度亮丙瑞林的合成方法 | |
CN113135991B (zh) | 一种制备索玛鲁肽的方法 | |
CN113880935B (zh) | 一种索马鲁肽全保护肽树脂的制备方法、一种索马鲁肽制备方法 | |
CN107022021A (zh) | 一种利拉鲁肽的固相合成法 | |
CN106632655B (zh) | 一种艾塞那肽的制备方法及其产品 | |
AU2009293665A1 (en) | Process for the synthesis of (Aib8,35)hGLP-1(7-36)-NH2 | |
Balasubramaniam et al. | Synthesis of neuropeptide Y | |
JP2022527041A (ja) | プレカナチドを製造する改善された方法 | |
CN109306366B (zh) | 一种合成pt141的方法 | |
CN108070030B (zh) | 洛塞那肽及其类似物的制备方法 | |
CN112028986A (zh) | 一种司美格鲁肽的合成方法 | |
CN106432468A (zh) | 一种制备艾塞那肽的固相合成方法 | |
WO2023279323A1 (zh) | 一种合成glp-1类似物的方法 | |
CN115594754A (zh) | 一种特立帕肽的制备方法 | |
CN110845600B (zh) | 一种制备利拉鲁肽的方法 | |
CN111233980B (zh) | 一种戈舍瑞林的片段法合成方法 | |
CN112175067B (zh) | 一种替度鲁肽的制备方法 | |
CN111892650A (zh) | 一种利拉鲁肽固相合成方法 | |
CN113480633B (zh) | 一种替度鲁肽的制备方法 | |
CN113135988B (zh) | 一种胸腺肽β4的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |