CN110294800B - 一种索玛鲁肽的制备方法 - Google Patents
一种索玛鲁肽的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于多肽合成领域，特别涉及一种新的索玛鲁肽的制备方法，既能减少杂质的产生，尤其是[D‑His1]‑索玛鲁肽，又可提高产率，降低生产成本，可用于工业上大规模生产索玛鲁肽。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成领域，特别涉及一种新的索玛鲁肽的制备方法，既能减少杂质的产生，尤其是[D-His1]-索玛鲁肽，又可提高产率，降低生产成本，可用于工业上大规模生产索玛鲁肽。
技术背景
索玛鲁肽(Sermaglutide)是诺和诺德公司开发的新一代GLP-1类似物，该产品能显著降低2型糖尿病患者的糖化血红蛋白(HbA1c)水平及减轻体重，同时大大降低低血糖的风险。
从结构上看，索玛鲁肽是将GLP-1(7-37)链上8位的Aib取代了Ala，34位的Arg取代了Lys，26位的Lys接上十八烷酸脂肪链。与利拉鲁肽相比，索玛鲁肽分子中20位赖氨酸侧链氨基上所引入的修饰基团比利拉鲁肽更大，对多肽药物分子抵御体内代谢的能力更强，在体内的药物作用时间更长。索玛鲁肽分子中短链的PEG修饰使得药物分子的亲水性大大增强。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。
索玛鲁肽已于2016年12月正式向FDA提交了上市申请，并于在2017年12月7日获得FDA批准。该产品的上市将为改善2型糖尿病患者治疗提供独特机遇。
目前关于索玛鲁肽的合成方法较少，主要包括：
WO2006097537、CN101133082报道了主链采用氨基酸逐步偶联合成，1位His采用Boc-His(Boc)-OH，20位Lys侧链氨基采用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，脱除保护基后，侧链以四肽片段活化酯17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-(2，5-二氧吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰}丙基氨基甲酰)十七烷偶联制得。Mmt为酸敏感基团，在用含量重量1-5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液脱除时容易造成其他氨基酸侧链酸敏感保护基，也容易造成肽从2-CTC树脂上脱落，导致纯度降低，收率降低。
CN103848910报道了主链逐步偶联获得，其中20位Lys采用Fmoc-Lys(Mmt)-OH，脱除侧链保护基后，将2-(2-(2氨基乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸获得。该方法除了存在上述Mmt的缺点外，偶联步骤长，工序繁琐，侧链较长致使空间位阻效应增强，偶联反而难于进行，导致产品收率低的问题。
CN104356224报道了液相中先将Lys与侧链做成五肽，然后再逐步偶联主链氨基酸的同时侧链随Lys在一起偶联入侧链，然后再逐步偶联主链剩余的氨基酸。侧链整体引入侧链时，由于空间位阻效应，偶联效率降低，导致收率降低。
CN106928343A报道了一种索玛鲁肽的制备方法，虽然降低了杂质[D-His1]-索玛鲁肽的含量，但仍有0.98％。
发明内容
鉴于现有的索玛鲁肽制备方法存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种新的索玛鲁肽的制备方法，既能减少杂质的产生，尤其是[D-His1]-索玛鲁肽，又可提高产率，降低生产成本，可用于工业上大规模生产索玛鲁肽。
术语说明：
侧链保护基团：指与氨基酸的侧链(即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基)偶联的化学部分，其有助于防止侧链的一部分与多肽合成、加工等步骤中使用的化学物质反应。
缩合剂：能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽键的试剂。
活化助剂：在多肽缩合反应中，能够协助缩合剂更好的促进缩合反应的试剂，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。
偶联：是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应；
Fmoc是指芴甲氧羰酰基；pbf是指2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；OtBu是指叔丁氧基；Boc是指叔丁氧基羰基；tBu是指叔丁基；Alloc是指烯丙氧基羰基；Cbz是指苄氧基羰基；IvDde是指1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)-3-甲基丁基；Dde是指1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基；Trt是指三苯甲基；Mmt是指4-甲氧基三苯甲基，Mtt是指4-甲基三苯甲基。
本发明提供一种索玛鲁肽的制备方法，其包括步骤如下：
(1)以Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；
(2)将步骤(1)脱除Fmoc保护基的树脂在活化助剂和缩合剂存在下采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂：
Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂
(3)将步骤(2)制备的侧链全保护的索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，再与Fmoc-Lys(P)-OH在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽[20-31]片段肽-树脂：
Fmoc-Lys(P)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂
其中，P选自-AEEA-Alloc或-AEEA-AEEA-Alloc；当P为-AEEA-Alloc时，Fmoc-Lys(P)-OH对应的结构如式I所示；当P为-AEEA-AEEA-Alloc时，Fmoc-Lys(P)-OH对应的结构如式II所示。
(4)将步骤(3)制备的侧链全保护的索玛鲁肽[20-31]片段肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，按照步骤(2)相同的偶联方法，再依次与剩余的氨基酸在活化剂和缩合剂的存在下顺序进行偶联反应，得到侧链全保护的索玛鲁肽-树脂前体，结构如下：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(P)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-树脂
(5)当P为-AEEA-AEEA-Alloc时，将步骤(4)制备的侧链全保护的索玛鲁肽前体肽-树脂用脱保护试剂脱除烯丙氧羰基(Alloc)后，再与十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂；
或者
当P为-AEEA-Alloc时，将步骤(4)制备的侧链全保护的索玛鲁肽前体肽-树脂用脱保护试剂脱除烯丙氧羰基(Alloc)后，先偶联Alloc-AEEA-OH，然后脱出保护基Alloc后，再与十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂；
其中十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu的结构为：
(6)经裂解剂裂解除去侧链全保护索玛鲁肽-树脂上的树脂和保护基团，经沉淀，得到索玛鲁肽粗品。
进一步地，本发明的方法还包括：
(7)索玛鲁肽粗品的纯化：将上述步骤(6)得到的索玛鲁肽粗品经反相高效液相色谱纯化，冻干得到索玛鲁肽纯品。
其中，其中，R1独立地选自Boc、Cbz、Fmoc、ivDde、Dde；
R2独立地选自Boc、Fmoc、Cbz、ivDde、Dde、Trt、Mmt、Mtt；
所述脱保护剂为哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1：4的混合溶液；
所述的裂解剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯甲硫醚、乙二硫醇和水组成的混合物，三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯甲硫醚：乙二硫醇：水＝90～95:0～5:0～5:0～5:0～5体积比；
所述活化助剂选自1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)；优选为1-羟基苯并三氮唑(HOBt)中的一种或多种；
所述的缩合剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N’，N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的一种或多种；优选为N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)中的一种或多种；
步骤(1)所述的Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂的荷载量为0.1～0.6mmol/g，优选0.2～0.5mmol/g；树脂与脱保护剂投料比为1:10～50，优选1:20～40，单位：mol/L；脱保护反应时间为每次10min；优选重复脱保护3次。
上述步骤(2)中所述的Fmoc保护的氨基酸及其依次连接顺序为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
步骤(2)缩合剂的用量与树脂中氨基的摩尔比为2～6:1，优选3～5：1；更优选4：1；
步骤(2)中活化助剂与树脂中氨基的摩尔比为2～6:1，优选3～5：1；更优选4：1；
步骤(2)和(3)中活化助剂和缩合剂以下列方式应用：将活化助剂和缩合剂与Fmoc保护氨基酸一起溶于N，N-二甲基甲酰胺后，加入反应器。
步骤(2)中所述的偶联反应时间为30～150min，优选60～120min。
步骤(3)中所述的Fmoc-Lys(P)-OH的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂的用量的摩尔比为2～5:1，优选3:1。
上述步骤(4)中氨基酸以下列形式应用并依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、R1-His(R2)-OH。
本发明步骤(4)所述的固相偶联反应与步骤(2)的反应条件完全相同，所用的活化助剂和缩合剂与步骤(2)相同，活化助剂和缩合剂的用量也与步骤(2)相同。
步骤(5)中所述脱保护试剂为Pd(Ph3P)4做为催化剂，与还原剂配合使用，所述还原剂选自：PhSiH3、NaBH4、Bu3SnH、HCO2H、TEA、双甲酮中的一种或多种。
本发明步骤(5)所述的固相偶联反应与步骤(2)的反应条件完全相同，所用的活化助剂和缩合剂与步骤(2)相同，活化助剂和缩合剂的用量也与步骤(2)相同。
步骤(5)中所述的十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu二肽片段的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[1-31]肽-树脂的用量的摩尔比为2～5:1；进一步优选3:1摩尔比。
步骤(6)所述的裂解剂的用量与侧链全保护索玛鲁肽-树脂之比为5～20：1，优选8～15ml/g，更优选10：1，单位：ml/g。
步骤(6)所述的裂解反应时间为1～5h，优选为1.5～3.5h。
优选的，步骤(7)索玛鲁肽粗品的纯化方法具体保护以下步骤和条件：
高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10μm的反相C8固定相，色谱柱直径为50毫米、长度为250毫米，纯化方法步骤如下：
称取索玛鲁肽粗品溶于适量水中(浓度优选5-50mg/ml，更优选10-3mg/ml)，微孔滤膜过滤，将滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)—0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，蒸除乙腈，得索玛鲁肽三氟乙酸盐溶液；冷冻干燥得索玛鲁肽纯品。
本发明第二方面提供一种Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH的制备方法，其包括以下步骤：
将碳酸钾(1.5当量)溶于水中，加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(缩写为H-AEEA-OH，1.0当量)和四氢呋喃，搅拌均匀，向上述溶液中滴加氯甲酸烯丙酯(1.2当量)，室温下搅拌反应18小时。反应结束后将反应液进行减压浓缩，浓缩液用乙醚进行萃取3次，水相用浓盐酸调节至PH值2左右后用二氯甲烷萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩滤液获得Alloc-AEEA-OH。
将Alloc-AEEA-OH(1.0当量)和N-羟基丁二酰亚胺(缩写：HOSu，1.0当量)溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(DCC，1.0当量)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Alloc-AEEA-OSu；
将Fmoc-Lys-OH、碳酸钠溶于水中，加入Alloc-AEEA-OSu的1,4-二氧六环溶液(浓度优选0.1-1.5g/ml)，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH；其中，Fmoc-Lys-OH与碳酸钠的摩尔比为1:2。
本发明第三方面提供一种Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH的制备方法，其包括以下步骤：
将2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(H-AEEA-OH，1.0当量)、碳酸钠(2.0当量)溶于适量水中，加入Alloc-AEEA-OSu的1,4-二氧六环溶液(浓度优选0.1-1.5g/ml)，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后得Alloc-AEEA-AEEA-OH。
将Alloc-AEEA-AEEA-OH(1.0当量)和N-羟基丁二酰亚胺(HOSu，1.0当量)溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(DCC，1.0当量)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Alloc-AEEA-AEEA-OSu。
将Fmoc-Lys-OH、碳酸钠溶于适量水中，加入Alloc-AEEA-AEEA-OSu的1,4-二氧六环溶液(浓度优选0.1-1.5g/ml)，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤，收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH；其中，Fmoc-Lys-OH与碳酸钠的摩尔比为1:2。
本发明第四方面提供一种十八烷二酸单叔丁酯-Glu-Otbu的制备方法，其包括以下步骤：
将十八烷二酸单叔丁酯(1.0当量)和N-羟基丁二酰亚胺(HOSu，1.0当量)溶于四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(DCC，1.0当量)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于适量二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得十八烷二酸单叔丁酯-OSu。将H-Glu-OtBu、碳酸钠(摩尔比＝1:2)溶于适量水中，加入十八烷二酸单叔丁酯-OSu的1,4-二氧六环溶液，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得二肽片段十八烷二酸单叔丁酯-Glu-Otbu。
本发明的方法中，在制备索玛鲁肽粗品时用裂解剂裂解脱掉除Fmoc以外的tBu、Trt、Boc、Pbf等保护基即可。裂解过程除脱去树脂外，还会同时脱去除氨基酸上的其余保护基团(tBu、Trt、Boc、Pbf等)。
本发明使用了赖氨酸侧链氨基被一个或两个PEG修饰的Fmoc-(P)-OH二肽或三肽(P为-AEEA-Alloc或-AEEA-AEEA-Alloc)以及十八烷二酸单叔丁酯-Glu-Otbu片段引入侧链片段，AEEA为短直链PEG结构与Lys接入主链不会影响其本身以及后续氨基酸的偶联效率，同时侧链伸出的AEEA直链减小了主链空间位阻对侧链后续氨基酸偶联的影响，二肽片段十八烷二酸单叔丁酯-Glu-Otbu提高了脂肪酸的偶联效率，同时减少了侧链片段偶联的工序，此方法提高了产品的收率和纯度，反应效率高，有利于实现规模化的固相化学合成。氨基端His采用R1-His(R2)-OH为原料降低了His的消旋风险，减少消旋杂质[D-His1]-索玛鲁肽的产生。
本发明方法首次合成了侧链氨基被P修饰的Fmoc-(P)-OH二肽或三肽(P为-AEEA-Alloc或-AEEA-AEEA-Alloc)，并将其应用于索玛鲁肽的固相合成，使得最终产品的纯度大于99.5％，与现有技术相比，本发明工艺具有操作简单、条件温和等特点，适于大规模工业化制备索玛鲁肽。
在本发明中，所使用的试剂均为常规试剂，所使的原料也均为常规化学原料，均可以通过商业购买或按照已公开的现有文献制备得到。例如Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂均可以从吉尔生化有限公司购买得到。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步说明。但是应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温环境下进行，所述室温一般是指15-30℃，优先15-25℃，更优选15-20℃。(ii)含量及收率“％”均为质量百分比。(iii)产物纯度％均为高效液相色谱纯度HPLC。
实施例1、Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH的制备
将碳酸钾(41.5g，300mmol)溶于450ml水中，加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(H-AEEA-OH，32.6g，200mmol)和四氢呋喃(450ml)，搅拌均匀，向上述溶液中滴加氯甲酸烯丙酯(38.9g，240mmol)，室温下搅拌反应18小时。反应结束后将反应液进行减压浓缩，浓缩液用乙醚进行萃取3次(3×100ml)，水相用浓盐酸调节至PH值至2后用二氯甲烷萃取3次(3×100ml)，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤后减压蒸出溶剂获得Alloc-AEEA-OH(49.3g，收率99.7％)。Ms＝247.11(M+H+)。
将Alloc-AEEA-OH(48g，194mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(HOSu，22.3g，194mmol)溶于550ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(DCC，40g，194mmol)，室温搅拌反应18小时。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于300ml二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Alloc-AEEA-OSu(66.2g，收率99.1％)。Ms＝344.12(M+H+)。
将Fmoc-Lys-OH(63.2g，171.6mmol)、碳酸钠(36.4g，343.2mmol)溶于600ml水中，加入Alloc-AEEA-OSu(65g，188.8mmol)的1,4-二氧六环溶液600ml，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化，得到Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH(97.3g，收率95％)。Ms＝596.26(M+H+)。
实施例2、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH的制备
将碳酸钾(51.8g，375mmol)溶于450ml水中，加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(H-AEEA-OH，40.8g，250mmol)和四氢呋喃(450ml)，搅拌均匀，向上述溶液中滴加氯甲酸烯丙酯(36.2g，300mmol)，室温下搅拌反应18h。反应结束后将反应液进行减压浓缩，浓缩液用乙醚进行萃取3次(3×100ml)，水相用浓盐酸调节至PH值至2后用二氯甲烷萃取3次(3×100ml)，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩滤液获得Alloc-AEEA-OH(61.2g，收率99.0％)。Ms＝247.11(M+H+)。
将Alloc-AEEA-OH(60g，242.7mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(HOSu，27.9g，242.7mmol)溶于550ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(DCC，50g，242.7mmol)，室温搅拌反应18h。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于300ml二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Alloc-AEEA-OSu(82.6g，收率98.8％)。Ms＝344.12(M+H+)。
将2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(34.5g，211.2mmol)、碳酸钠(44.8g，422.4mmol)溶于600ml水中，加入Alloc-AEEA-OSu(80g，232.3mmol)的1,4-二氧六环溶液600ml，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后得Alloc-AEEA-AEEA-OH(81.3g，收率98.1％)；Ms＝392.18(M+H+)。
将Alloc-AEEA-AEEA-OH(79.7g，203mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(23.4g，203mmol)溶于600ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(41.9g，203mmol)，室温搅拌反应18h。反应结束后，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃进行洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于300ml二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得Alloc-AEEA-AEEA-OSu(97.4g，收率98.0％)。Ms＝489.2(M+H+)。
将Fmoc-Lys-OH(65g，176.5mmol)、碳酸钠(37.4g，353mmol)溶于适量650ml水中，加入Alloc-AEEA-AEEA-OSu(95g，194.1mmol)的1,4-二氧六环溶液650ml，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，浓缩除去1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤收集固体产品，水洗，干燥后柱层析纯化得三肽片段Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH(122.5g，收率93.6％)。Ms＝741.33(M+H+)。
实施例3、十八烷二酸单叔丁酯-Glu-Otbu的制备
将十八烷二酸单叔丁酯(74.1g，200mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(23g，200mmol)溶于500ml四氢呋喃中，加入二环己基碳二亚胺(41.3g，200mmol)，室温搅拌反应18h。反应结束后，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤，合并滤液后进行减压浓缩，再重新溶于200ml二氯甲烷，溶液在0℃静置30分钟后，进行过滤，固体用二氯甲烷洗涤，合并滤液后进行加压浓缩，获得十八烷二酸单叔丁酯-OSu(91.3g，收率97.6％)。Ms＝467.32(M+H+)。
将H-Glu-OtBu(35.6g，175mmol)、碳酸钠(37.1g，350mmol)溶于100ml水中，加入十八烷二酸单叔丁酯-OSu(90g，192.5mmol)的1,4-二氧六环溶液700ml，搅拌反应2～3h，TLC检测反应结束后，蒸出1，4-二氧六环，加入2mol/L盐酸调节溶液pH值至2-3，析出大量固体，抽滤，滤饼水洗，干燥后柱层析纯化，得十八烷二酸单叔丁酯-Glu-Otbu(90.3g，收率92.8％)。Ms＝555.41(M+H+)。
实施例4、侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂25.0g(荷载量0.4mmol/g，10mmol)加入固相反应器中，加入含体积比20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复前述脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(分子量：648.8，30mmol，19.5g)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量：126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上偶联步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-His(Boc)-OH，
制得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1，其结构如下：
Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Wang树脂
实施例5、侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂25.0g(荷载量0.4mmol/g，10mmol)加入固相反应器中，加入含体积比20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(分子量：648.8，30mmol)19.5g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上偶联步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，制得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2，其结构如下：
Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Wang树脂。
实施例6、侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1的制备
称取Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂33.3g(荷载量0.3mmol/g，10mmol)加入固相反应器中，加入含体积比20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复前述脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(分子量：648.8，30mmol)19.5g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上偶联步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、
Fmoc-His(Fmoc)-OH，制得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1，其结构如下：
Fmoc-His(Fmoc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂。
实施例7、侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2的制备
称取Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂33.3g(荷载量0.3mmol/g，10mmol)加入固相反应器中，加入含体积比20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(分子量：648.8，30mmol)19.5g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上偶联步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联，依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Boc)-OH，制得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2，其结构如下：
Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-2-chlorotrityl树脂。
实施例8、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
脱保护试剂的配制：称取3.47g(Ph3P)4Pd(分子量：1155.6，3mmol)溶于150ml二氯甲烷中，再加入12.3ml苯硅烷(分子式：PhSiH3，分子量：108.2，100mmol)，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例4所得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1中，室温反应30min，然后抽滤，重复前述脱保护试剂反应。反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤6次。将Alloc-AEEA-OH(分子量：232.3，30mmol)7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。再次加入前述方法配置的脱保护剂进行脱保护反应，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8，30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。加入含体积比20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例9、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
配制脱保护试剂：称取3.47g(Ph3P)4Pd(分子量：1155.6，3mmol)溶于150ml二氯甲烷中，再加入12.3ml苯硅烷，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例5制备的侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2中，室温反应30min，然后抽滤，重复前述脱保护反应。反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8，30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。加入20％的哌啶N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例10、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
配制脱保护试剂：称取3.47g(Ph3P)4Pd(分子量：1155.6，3mmol)溶于150ml二氯甲烷中，再加入12.3ml苯硅烷，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例6制备的侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1中，室温反应30min，然后抽滤，重复前述脱保护反应。反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将Alloc-AEEA-OH(分子量：232.3，30mmol)7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。再次加入前述方法配置的脱保护剂进行脱保护反应，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8，30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。加入含有体积比20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25～30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200ml N，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例11、侧链全保护索玛鲁肽-树脂的制备
配制脱保护试剂：称取3.47g(Ph3P)4Pd(分子量：1155.6，3mmol)溶于150ml二氯甲烷二氯甲烷中，再加入12.3ml苯硅烷，混合均匀。
将配制好的脱保护试剂加入实施例7制备的侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2中，室温反应30min，然后抽滤，重复前述脱保护反应。反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次。将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu(分子量：555.8，30mmol)16.7g、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(分子量：135.1，30mmol)3.9g溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(分子量:126.2，30mmol)3.6ml，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。抽滤反应液，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，洗涤，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂。
实施例12、索玛鲁肽粗品的制备
裂解试剂200ml的配制：取三氟乙酸192ml，三异丙基硅烷2ml，苯甲硫醚2ml，1，2-乙二硫醇2ml，水2ml，混合后预冷至0℃。
将实施例8制备的侧链全保护索玛鲁肽-树脂20g加入到500ml圆底烧瓶中；加入前述配制的裂解试剂，反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入2L预冷却(优选-20℃～0℃，更优选-10℃～-5℃)的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到索玛鲁肽粗品5.8g。粗肽收率93.70％。
实施例13、索玛鲁肽粗品的制备
裂解试剂500ml的配制：取三氟乙酸480ml，三异丙基硅烷5ml，苯甲硫醚5ml，1，2-乙二硫醇5ml，水5ml，混合后预冷至0℃。
将实施例11制备的侧链全保护索玛鲁肽-树脂50g加入到1000ml圆底烧瓶中；加入前述配制的裂解试剂，反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入5L预冷却(优选-20℃～0℃，更优选-10℃～-5℃)的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到索玛鲁肽粗品15.5g，收率94.1％。
实施例14、索玛鲁肽粗品的纯化
称取实施例13制备的索玛鲁肽粗品粉末8.0g，采用200ml水溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
反相制备液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子规格：50mm×250mm；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液-0.1％三氟乙酸/乙腈溶液；洗脱的流速60ml/min；采用梯度洗脱，循环进样方式上样。将前述处理的样品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，冷冻干燥，得索玛鲁肽纯品2.84g，纯化收率35.5％，产品纯度为99.6％，D-[His1]索玛鲁肽杂质均小于0.1％。
Claims (20)
1.一种索玛鲁肽的制备方法，其包括步骤如下：
（1）以Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；
（2）将步骤（1）脱除Fmoc保护基的树脂在活化助剂和缩合剂存在下采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂：
Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
（3）将步骤（2）制备的侧链全保护的索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，再与Fmoc-Lys(P)-OH在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽[20-31]片段肽-树脂：
Fmoc-Lys(P)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
其中，P选自-AEEA-Alloc或-AEEA-AEEA-Alloc；当P为-AEEA-Alloc时，Fmoc-Lys(P)-OH对应的结构如式I所示；当P为-AEEA-AEEA-Alloc时，Fmoc-Lys(P)-OH对应的结构如式II所示；
式Ⅰ
式Ⅱ
（4）将步骤（3）制备的侧链全保护的索玛鲁肽[20-31]片段肽-树脂用脱保护剂脱除Fmoc保护后，按照步骤（2）相同的偶联方法，再依次与剩余的氨基酸在活化助剂和缩合剂的存在下顺序进行偶联反应，得到侧链全保护的索玛鲁肽-树脂前体，结构如下：
R1-His(R2)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(P)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-树脂；
（5）当P为-AEEA-AEEA-Alloc时，将步骤（4）制备的侧链全保护的索玛鲁肽-树脂前体用脱保护试剂脱除烯丙氧羰基后，再与十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂；
或者，
当P为-AEEA-Alloc时，将步骤（4）制备的侧链全保护的索玛鲁肽-树脂前体用脱保护试剂脱除烯丙氧羰基后，先偶联Alloc-AEEA-OH，然后脱出保护基Alloc后，再与十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂；
其中十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu的结构为：
（6）经裂解剂裂解除去侧链全保护索玛鲁肽-树脂上的树脂和保护基团，经沉淀，得到索玛鲁肽粗品；
进一步地，还包括：
(7)索玛鲁肽粗品的纯化：将上述步骤（6）得到的索玛鲁肽粗品经反相高效液相色谱纯化，冻干得到索玛鲁肽纯品；
其中，R1独立地选自Boc、Cbz、Fmoc、ivDde、Dde；
R2独立地选自Boc、Fmoc、Cbz、ivDde、Dde、Trt、Mmt、Mtt；
所述脱保护剂为哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1：4的混合溶液；
所述裂解剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯甲硫醚、乙二硫醇和水组成的混合物，三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯甲硫醚：乙二硫醇：水=90～95:0～5:0～5:0～5:0～5,体积比；
所述活化助剂选自1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑；
所述的缩合剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺、N，N-二环己基碳二亚胺、（1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基）二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂的荷载量为0.1～0.6mmol/g；树脂与脱保护剂投料比为1:10~50，单位：mol/L；脱保护反应时间为每次10min；
步骤（2）中所述的Fmoc保护的氨基酸及其依次连接顺序为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH；
步骤（2）缩合剂的用量与树脂中氨基的摩尔比为2～6:1；
步骤（2）活化助剂与树脂中氨基的摩尔比为2～6:1；
步骤（2）中所述的偶联反应时间为30～150min；
步骤（3）中所述的Fmoc-Lys(P)-OH的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂的用量的摩尔比为2～5:1；
步骤(4)氨基酸以下列形式应用并依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、R1-His(R2)-OH；
步骤（5）中所述脱保护试剂为Pd(Ph3P)4，与还原剂配合使用，所述还原剂选自：PhSiH3、NaBH4、Bu3SnH、HCO2H、TEA、双甲酮中的一种或多种；
步骤（5）中所述的十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体的用量的摩尔比为2～5:1；
步骤（6）所述的裂解剂的用量与侧链全保护索玛鲁肽-树脂之比为5～20：1，单位：ml/g；
步骤（6）所述的裂解反应时间为1～5h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)索玛鲁肽粗品的纯化方法具体包含以下步骤和条件：
高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10µm的反相C8固定相，色谱柱直径为50毫米、长度为250毫米，纯化方法步骤如下：
称取索玛鲁肽粗品溶于适量水中，微孔滤膜过滤，将滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为体积比0.1%三氟乙酸水溶液—体积比0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，蒸除乙腈，冷冻干燥得索玛鲁肽纯品。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化助剂均为1-羟基苯并三氮唑。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸盐、2-（7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1,1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或多种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-chlorotrityl树脂的荷载量为0.2～0.5mmol/g。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，树脂与脱保护剂投料比为1:20~40，单位：mol/L。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，重复脱保护3次。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）缩合剂的用量与树脂中氨基的摩尔比3~5：1。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）缩合剂的用量与树脂中氨基的摩尔比4：1。
11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）活化助剂与树脂中氨基的摩尔比为3~5：1。
12.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）活化助剂与树脂中氨基的摩尔比为4：1。
13.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的偶联反应时间为60～120min。
14.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的Fmoc-Lys(P)-OH的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[21-31]片段肽-树脂的用量的摩尔比为3:1。
15.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu的用量与侧链全保护的索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体的用量的摩尔比为3:1。
16.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述的裂解剂的用量与侧链全保护索玛鲁肽-树脂之比为8～15：1，单位：ml/g。
17.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述的裂解剂的用量与侧链全保护索玛鲁肽-树脂之比为10：1，单位：ml/g。
18.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述的裂解反应时间为1.5～3.5h。
19.一种索玛鲁肽的制备方法，其包括步骤如下：
（1）称取荷载量为0.4mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂25.0g，加入固相反应器中，加入含体积比20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25~30℃搅拌反应10min，重复前述脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、1-羟基苯并三氮唑3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺3.6ml，25~35℃反应2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上偶联步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-His(Boc)-OH，制得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1，其结构如下：
Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Wang树脂；
（2）脱保护试剂的配制：称取3.47g(Ph3P)4Pd溶于150ml二氯甲烷中，再加入12.3ml苯硅烷，混合均匀；
将配制好的脱保护试剂加入步骤（1）所得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体1中，室温反应30min，然后抽滤，重复前述脱保护试剂反应；反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤6次；将7gAlloc-AEEA-OH、1-羟基苯并三氮唑3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺3.6ml，25~35℃反应2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次；再次加入前述方法配置的脱保护剂进行脱保护反应，反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次；将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu16.7g、1-羟基苯并三氮唑3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺3.6ml，25~35℃反应2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准；抽滤反应液，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次；加入含体积比20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25~30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂；
（3）裂解试剂200ml的配制：取三氟乙酸192ml，三异丙基硅烷2ml，苯甲硫醚2ml，1，2-乙二硫醇2ml，水2ml，混合后预冷至0℃；
将步骤（2）制备的侧链全保护索玛鲁肽-树脂20g加入到500ml圆底烧瓶中；加入前述配制的裂解试剂，反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液；在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入2L预冷却的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到索玛鲁肽粗品；
（4）称取步骤（3）制备的索玛鲁肽粗品粉末，采用水溶解，溶液用0.45µm微孔滤膜过滤，备用；
反相制备液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子规格：50mm×250mm；流动相：0.1%三氟乙酸水溶液-0.1%三氟乙酸/乙腈溶液；洗脱的流速60ml/min；采用梯度洗脱，循环进样方式上样；将前述处理的样品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，冷冻干燥，得索玛鲁肽纯品。
20.一种索玛鲁肽的制备方法，其包括步骤如下：
（1）称取荷载量为0.4mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂25.0g，加入固相反应器中，加入含体积比20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25~30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，将19.5gFmoc-Arg(Pbf)-OH、1-羟基苯并三氮唑3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺3.6ml，25~35℃反应2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，重复以上偶联步骤，按照索玛鲁肽序逐一与相应Fmoc保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，制得侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2，其结构如下：
Fmoc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Wang树脂；
（2）配制脱保护试剂：称取3.47g(Ph3P)4Pd溶于150ml二氯甲烷中，再加入12.3ml苯硅烷，混合均匀；
将配制好的脱保护试剂加入步骤（1）制备的侧链全保护索玛鲁肽[1-31]肽-树脂前体2中，室温反应30min，然后抽滤，重复前述脱保护反应；反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次；将十八烷二酸单叔丁酯-Glu-OtBu16.7g、1-羟基苯并三氮唑3.9g溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入固相反应器内，再加入N，N-二异丙基碳二亚胺3.6ml，25~35℃反应2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准；抽滤反应液，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次；加入20%的哌啶N，N-二甲基甲酰胺溶液150ml，25~30℃搅拌反应10min，重复脱保护3次，脱除His的保护基，反应完毕后抽滤，将树脂用200mlN，N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次，得到侧链全保护索玛鲁肽-树脂;
（3）裂解试剂500ml的配制：取三氟乙酸480ml，三异丙基硅烷5ml，苯甲硫醚5ml，1，2-乙二硫醇5ml，水5ml，混合后预冷至0℃；
将步骤（2）制备的侧链全保护索玛鲁肽-树脂50g加入到1000ml圆底烧瓶中；加入前述配制的裂解试剂，反应温度在20分钟内升至25℃，并在此温度下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液；在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入5L预冷却的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到索玛鲁肽粗品；
（4）称取步骤（3）制备的索玛鲁肽粗品粉末，采用水溶解，溶液用0.45µm微孔滤膜过滤，备用；
反相制备液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子规格：50mm×250mm；流动相：0.1%三氟乙酸水溶液-0.1%三氟乙酸/乙腈溶液；洗脱的流速60ml/min；采用梯度洗脱，循环进样方式上样；将前述处理的样品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，冷冻干燥，得索玛鲁肽纯品。
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