CN108047329A - 一种阿巴帕肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种阿巴帕肽的制备方法，解决了现有技术合成阿巴帕肽方法步骤繁琐、原料消耗大，而且合成产品产率低、纯度低、自身杂质多纯化难的技术问题。本发明提供了一种阿巴帕肽的制备方法，首先采用液相合成方法同时合成二肽片段Fmoc‑Thr(OtBu)‑Ala‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑Gly‑OH、Fmoc‑Ala‑Val‑OH和四肽片Fmoc‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑Glu(OtBu)‑OH，再以氨基树脂作为固相合成的载体，按照阿巴帕肽的氨基酸序列从C端至N端依次缩合α‑NH2带有Fmoc保护基的全保护氨基酸和所合成的二肽片段、四肽片段，减少了6步固相缩合反应，得到全保护的阿巴帕肽肽树脂，经裂解、纯化得到阿巴帕肽纯品。本发明广泛应用于多肽药物制备合成技术领域。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种阿巴帕肽的制备方法。
背景技术
甲状旁腺激素(PTH)是一种由甲状旁腺主细胞分泌的，调节体内钙和磷代谢的多肽类激素，其C端肽链与PTH-II受体结合可促进骨细胞凋亡、N端肽链与PTH-I受体结合可促进骨骼重建。Lilly公司以人甲状旁腺素(hPTH)N-末端34个氨基酸残基研制的用于治疗骨质疏松症的药物特立帕肽(Teriparatide)于2002年12月被FDA批准上市。
阿巴帕肽，英文名称为Abaloparatide，是由Radius Health公司研制的一种新型甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)，它是PTH-I受体强有力的选择性激活剂，可以增加骨矿物质含量、骨密度以及骨强度，促进骨骼形成，已于2017年4月28日被FDA批准上市，其商品名称为Tymlos。阿巴帕肽经皮下注射，用于治疗处于骨折风险或对其它治疗药物无效的绝经后妇女的骨质疏松症，可有效降低新发椎体和非椎体骨折率。与特立帕肽相比，阿巴帕肽能够更好的降低骨折率和高钙血症发生率。
阿巴帕肽是由34个氨基酸残基组成的多肽，分子式为C174H300N56O49，分子量为3960.64g/mol，CAS号为247062-33-5，其结构如下：
Ala1-Val2-Ser3-Glu4-His5-Gln6-Leu7-Leu8-His9-Asp10-Lys11-Gly12-Lys13-
Ser14-Ile15-Gln16-Asp17-Leu18-Arg19-Arg20-Arg21-Glu22-Leu23-Leu24-Glu25
Lys26-Leu27-Leu28-Aib29-Lys30-Leu31-His32-Thr33-Ala34-NH2
专利US6921750B2公开了Boc策略固相合成阿巴帕肽，该策略反复使用TFA切除Boc保护基，同时使用危险性的强酸氢氟酸对肽树脂进行裂解。
专利CN106146648A公开了阿巴帕肽的制备方法，首先采用固相合成的方法合成3个肽树脂片段，随后将肽片段2和3与肽树脂片段1进行连接。然而该方法肽片段2和3进行缩合之前需要冻干过程，并且肽树脂片段2和3的生成需要使用大量昂贵的2-CTC树脂；同时在氨基酸缩合时氨基酸与树脂投料量的摩尔比值为3:1，在肽片段进行缩合时肽片段2和3与肽树脂片段1投料量的摩尔比值为5:1，造成消耗大量原料，导致生产成本增加。
在固相合成反应中Arg属于困难氨基酸，在缩合过程中缩合效率低下，非常容易产生[-Arg]的缺失肽，而阿巴帕肽序列在中含有3个连续的Arg残基，极易产生缺失肽杂质[-1Arg]-阿巴帕肽、[-2Arg]-阿巴帕肽和[-3Arg]-阿巴帕肽，乃至出现多个Arg同时缺失的阿巴帕肽杂质。同时Gly和Ala由于自身的结构特点，使其在缩合过程中容易重复缩合，容易产生[+1Gly]-阿巴帕肽和[+1Ala]-阿巴帕肽的杂质，这些杂质与目标肽的极性相近，不易分离，增加产品分离纯化的难度。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术的不足，结合阿巴帕肽的结构特点，提供一种合成步骤简单、原料消耗低，合成产品产率高、纯度高、自身杂质少、纯化简易的阿巴帕肽的制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种阿巴帕肽的制备方法，包括步骤如下：
1)用液相合成法合成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH二肽片段；
2)用液相合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH二肽片段；
3)用液相合成方法合成
Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH四肽片段；
4)用液相合成方法合成Fmoc-Ala-Val-OH二肽片段；
5)缩合反应：
在缩合体系存在下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，用固相合成法，逐步缩合保护氨基酸：按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端依次缩合全保护氨基酸和步骤1)合成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH二肽片段、步骤2)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH二肽片段、步骤3)合成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH四肽片段和步骤4)合成Fmoc-Ala-Val-OH二肽片段，得阿巴帕肽-氨基树脂为：Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-氨基树脂；依次缩合全保护氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-Val-OH；
6)裂解步骤5)制得的阿巴帕肽-氨基树脂，同时切除侧链保护基，得阿巴帕肽粗肽；
7)对步骤6)制得的阿巴帕肽粗肽进行纯化、冻干，得阿巴帕肽纯品多肽。
优选的，步骤1)中Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH的合成方法为：先将Fmoc-Thr(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时，生成Fmoc-Thr(OtBu)-OSu；再将Fmoc-Thr(OtBu)-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH。
优选的，步骤2)中Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH的合成方法为：先将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Lys(Boc)-OSu；再Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH。
优选的，步骤3)中Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH的合成方法为：先将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-OSu；再将Fmoc-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化下生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu；Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化下生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和HOSu在缩合剂DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu和H-Glu(OtBu)-OH在碱催化下生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH。
优选的，步骤4)中Fmoc-Ala-Val-OH的合成方法为：先Fmoc-Ala-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Ala-OSu；再将Fmoc-Ala-OSu和H-Val-OH在碱催化下生成Fmoc-Ala-Val-OH。
优选的，步骤5)中的氨基树脂为RinkAmide树脂、RinkAmide MBHA树脂、RinkAmideBHA树脂或Sieber树脂其中任何一种；氨基树脂的取代度为0.1～1.0mmol/g。
优选的，步骤5)中缩合体系为：A+D或A+B+C，其中A为HOBt或HOAt其中任何一种，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEPA或TMP其中任何一种，D为DIC。
优选的，步骤6)中裂解肽树脂、脱除侧链保护基的方法为：向阿巴帕肽-氨基树脂中加入裂解试剂，在10～30℃条件下反应2～5h，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤，真空干燥得到阿巴帕肽粗肽；裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，其体积比为：TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；裂解试剂加入量为阿巴帕肽-氨基树脂体积量的10倍。
优选的，步骤7)中阿巴帕肽的纯化、冻干方法为：将步骤6)制得的阿巴帕肽粗肽溶解后，采用反相高效液相色潽法对阿巴帕肽粗肽进行纯化；反相高效液相色潽法的色谱条件为：反相C18柱，先用流动相A为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，将所要的组分收集浓缩；再采用流动相A为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；两部均为梯度洗脱：流速为80ml/min，洗脱时间为60min，洗脱梯度为B相体积百分数10％～60％，紫外检测波长220nm，对阿巴帕肽纯品进行换盐，将所需要的组分收集浓缩，冻干，得阿巴帕肽产品。
优选的，碱为：Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、二乙胺、三乙胺中任何一种。
优选的，步骤1)中缩合步骤如下：
a)Fmoc氨基树脂溶胀：向Fmoc氨基树脂中加入DCM或DMF将树脂溶胀0.5h后，再用DMF将树脂洗涤；
b)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤a)中溶胀后的氨基树脂中，加入体积分数为20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤氨基树脂pH至7；第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱保护的氨基树脂；
c)氨基酸和肽片段活化：在10～30℃条件下，将保护氨基酸或肽片段与缩合体系混合后活化5～10min，得活化氨基酸或肽片段；
d)缩合：将步骤c)制得的活化氨基酸或肽片段加至步骤b)脱保护的氨基树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
所述保护氨基酸、缩合体系与Fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1。
本发明的有益效果：本发明结合阿巴帕肽的结构特点，根据现有合成方法的不足，提供一种合成步简单、原料消耗低，合成产品产率高、纯度高、自身杂质少、纯化简易的阿巴帕肽的制备方法。
本发明将Arg、Gly和Ala残基分别以肽片段Arg-Arg-Arg-Glu、Lys-Gly、Ala-Val和Thr-Ala的形式接入，减少了6步固相缩合反应步骤，同时有效的避免了缺失肽杂质[-1Arg]-阿巴帕肽、[-2Arg]-阿巴帕肽和[-3Arg]-阿巴帕肽、杂质[+1Gly]-阿巴帕肽和[+1Ala]-阿巴帕肽的产生，不但提高产品的纯度和收率，有效降低了纯化难度；以固液结合方式进行阿巴帕肽生产，提高了合成效率，适合规模化工业生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的原料，如无特殊规定，均为常规的市售产品。
本发明中所使用的缩写的具体含义列于下表中：
实施例1
二肽片段Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH的制备：
1)Fmoc-Thr(OtBu)-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Thr(OtBu)-OH和0.12mol HOSu溶于0.2LTHF，至于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.12mol DCC溶于0.1LTHF中，并滴至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Thr(OtBu)-OSu。
2)Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH的合成：
将0.15mol H-Ala-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L体积分数50％THF-H2O溶液，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Thr(OtBu)-OSu溶于THF中，并滴加至混合溶液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；再用乙酸乙酯将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH。
实施例2
二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH的制备：
1)Fmoc-Lys(Boc)-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.12mol HOSu溶于0.2L THF，至于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.12mol DCC溶于0.1LTHF中，并滴至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将得固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Lys(Boc)-OSu。
2)Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH的合成：
将0.15mol H-Gly-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L体积分数50％THF-H2O溶液，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Lys(Boc)-OSu溶于THF中，并滴加至混合溶液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH。
实施例3
Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH的制备：
1)Fmoc-Arg(Pbf)-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-OH和0.12mol HOSu溶于0.2LTHF中，至于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.12mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-OSu。
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：
将0.15mol H-Arg(Pbf)-OH和0.15molNa2CO3溶于0.2L体积分数50％THF-H2O溶液，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；用乙酸乙酯将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
3)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和0.12mol HOSu溶于2LTHF中，至于冰水浴，得混合液Ⅲ；将0.12mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅲ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu。
4)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：
将0.15mol H-Arg(Pbf)-OH和0.15molNa2CO3溶于0.2L体积分数50％THF-H2O溶液，得混合液Ⅳ；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅳ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
5)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和0.12mol HOSu溶于0.2LTHF中，至于冰水浴，得混合液Ⅴ；将0.12mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅴ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu。
6)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH的合成：
将0.15mol H-Glu(OtBu)-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L体积分数50％THF-H2O溶液，至于冰水浴，得混合液Ⅵ；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅵ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂后，得固体Ⅵ；用二氯甲烷-甲基叔丁基醚混合溶剂对固体Ⅵ进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH。
实施例4
Fmoc-Ala-Val-OH的制备：
1)Fmoc-Ala-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Ala-OH和0.12mol HOSu溶于0.2L THF，至于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.12mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干后，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Ala-OSu。
2)Fmoc-Ala-Val-OH的合成：
将0.15mol H-Val-OH和0.15mol Na2CO3溶于0.2L体积分数50％THF-H2O溶液，至于冰水浴，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Ala-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得Fmoc-Ala-Val-OH。
实施例5
阿巴帕肽线性肽树脂的制备：
1)Fmoc氨基树脂溶胀：取20g替代度为0.5mmol/g的RinkAmideAM树脂，加入150mlDCM或DMF将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂后，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂，得氨基树脂固体Ⅰ。
2)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤1)制得的氨基树脂固体Ⅰ中，加入200ml体积分数20％PIP-DMF混合溶液，在25℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min后，再用DMF洗涤氨基树脂pH至7，抽干溶剂，得脱保护的氨基树脂；
3)氨基酸和肽片段活化：分别将Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-Ala-OH各30mmol与缩合体系：30mmolHOBT和30mmol DIC，用适量的DMF溶解，在25℃条件下反应5min，得活化后的氨基酸和肽片段。
4)缩合：将步骤3)制得的活化后的氨基酸和活化后的肽片段加至步骤2)制得的脱除Fmoc保护基的氨基树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控缩合反应进程，逐步缩合活化后的保护氨基酸和肽片段：按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端依次缩合保护氨基酸和实施例1合成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH二肽片段、实施例2合Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH二肽片段、实施例3合成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH四肽片段和实施例4合成Fmoc-Ala-Val-OH二肽片段，依次缩合的全保护氨基酸和肽片段顺序为Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-Val-OH；最终得线性全保护肽树脂Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-RinkAmideAM树脂，树脂增重率91％。
上述茚三酮显色方法：取少量树脂至于试管中，DMF洗涤两次，在试管中分别加入一滴体积分数5％茚三酮-乙醇溶液、一滴体积分数85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶后，于120℃条件下加热2min后，再用DMF洗涤两次后，观察树脂颜色。
5)肽树脂收缩：将步骤4)制得的肽树脂用500ml MeOH和500mlDCM交替洗涤三次，5min/次，抽干溶剂，真空干燥，得阿巴帕肽树脂。
实施例6
阿巴帕肽粗肽的制备：
裂解实施例5制得的阿巴帕肽树脂，同时切除侧链保护基，得阿巴帕肽粗肽，具体如下：
向实施例5制得的阿巴帕肽树脂中加入其10倍体积的裂解试剂，在25℃条件下反应3h后，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次，真空干燥得到阿巴帕肽粗肽，裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，其中体积比为：TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5。
经检测阿巴帕肽粗肽纯度为72.7％。
实施例7
阿巴帕肽粗肽的纯化：
对实施例6制得的阿巴帕肽粗肽进行纯化、冻干，得阿巴帕肽纯品多肽，具体如下：
采用反相高效液相色潽法对阿巴帕肽粗肽进行纯化；反相高效液相色潽法的色谱条件为：反相C18柱，先用流动相A为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，将所要的组分收集浓缩；再采用流动相A为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；两部均为梯度洗脱：流速为80ml/min，洗脱时间为60min，洗脱梯度流动相B相体积百分数为10％～60％，紫外检测波长220nm，对阿巴帕肽纯品换盐，将所需要的组分收集浓缩，冻干，得阿巴帕肽产品。
经检测阿巴帕肽产品纯度为99.3％，总收率46.7％。
上述实施例中，改变氨基树脂种类为：RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂、RinkAmide BHA树脂或Sieber树脂其中任何一种；改变氨基树脂替代度为0.1～1.0mmol/g；改变原料的投料比例为：全保护氨基酸、缩合体系与Fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；改变反应溶剂、反应温度10～30℃、反应时间；改变缩合体系为：A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEPA或TMP；改变碱为：NaHCO3、K2CO3、KHCO3、二乙胺、三乙胺中任何一种等，均可使合成阿巴帕肽的方法的合成步简单、合成产品产率高、纯度高、自身杂质少、纯化简易的阿巴帕肽的制备方法。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
<110> 润辉生物技术（威海）有限公司
<120> 一种阿巴帕肽的制备方法
<160> 1
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)
<223> Xaa=Aib
<400> 1
Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln
1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu His
20 25 30
Thr Ala
Claims (11)
1.一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
1)用液相合成法合成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH二肽片段；
2)用液相合成法合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH二肽片段；
3)用液相合成法合成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH四肽片段；
4)用液相合成法合成Fmoc-Ala-Val-OH二肽片段；
5)缩合反应：
在缩合体系存在下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，用固相合成法，按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端依次缩合全保护氨基酸和步骤1)合成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH二肽片段、步骤2)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH二肽片段、步骤3)合成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH四肽片段和步骤4)合成Fmoc-Ala-Val-OH二肽片段，得阿巴帕肽-氨基树脂为：
Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-氨基树脂；所述的依次缩合全保护氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-Val-OH；
6)裂解步骤5)制得的阿巴帕肽-氨基树脂，同时切除侧链保护基，得阿巴帕肽粗肽；
7)对步骤6)制得的阿巴帕肽粗肽进行纯化、冻干，得阿巴帕肽纯品多肽。
2.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH的合成方法为：先将Fmoc-Thr(OtBu)-OH和HOSu在DCC存在时，生成Fmoc-Thr(OtBu)-OSu；再将Fmoc-Thr(OtBu)-OSu和H-Ala-OH在碱催化下生成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH。
3.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH的合成方法为：先Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Lys(Boc)-OSu；再Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Gly-OH在碱催化下生Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH。
4.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH的合成方法为：先将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-OSu；再将Fmoc-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化下生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化下生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和HOSu在缩合剂DCC存在时生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu和H-Glu(OtBu)-OH在碱催化下生Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH。
5.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述Fmoc-Ala-Val-OH的合成方法为：先将Fmoc-Ala-OH和HOSu在DCC存在时生成Fmoc-Ala-OSu；再将Fmoc-Ala-OSu和H-Val-OH在碱催化下生成Fmoc-Ala-Val-OH。
6.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述的氨基树脂为RinkAmide树脂、RinkAmide MBHA树脂、RinkAmide BHA树脂或Sieber树脂其中任何一种；所述氨基树脂的取代度为0.1～1.0mmol/g。
7.根据权利要求6所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤5)中缩合体系为：A+D或A+B+C，其中A为HOBt或HOAt其中任何一种，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEPA或TMP其中任何一种，D为DIC。
8.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤6)中所述裂解肽树脂、脱除侧链保护基的方法为：向阿巴帕肽-氨基树脂中加入裂解试剂，在10～30℃条件下反应2～5h，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤，真空干燥得到阿巴帕肽粗肽；所述裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，其体积比为：TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；所述裂解试剂加入量为阿巴帕肽-氨基树脂体积量的10倍。
9.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤7)中所述阿巴帕肽的纯化、冻干方法为：将步骤6)制得的阿巴帕肽粗肽溶解后，采用反相高效液相色潽法对阿巴帕肽粗肽进行纯化；所述反相高效液相色潽法的色谱条件为：反相C18柱，先用流动相A为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，将所要的组分收集浓缩；再采用流动相A为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；两部均为梯度洗脱：流速为80ml/min，洗脱时间为60min，洗脱梯度为B相体积百分数10％～60％，紫外检测波长220nm，对阿巴帕肽纯品进行换盐，将所需要的组分收集浓缩，冻干，得阿巴帕肽产品。
10.根据权利要求2～5中任何一项所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，所述的碱为：Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、二乙胺、三乙胺中任何一种。
11.根据权利要求1所述的一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述缩合步骤如下：
a)Fmoc氨基树脂溶胀：向Fmoc氨基树脂中加入DCM或DMF将树脂溶胀0.5h后，再用DMF将树脂洗涤；
b)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤a)中溶胀后的氨基树脂中，加入体积分数20％PIP-DMF溶液，在10～30℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护后，再用DMF洗涤氨基树脂pH至7；所述第一次脱Fmoc保护时间为5min，所述第二次脱Fmoc保护时间为10min，得脱保护的氨基树脂；
c)氨基酸和肽片段活化：在10～30℃条件下，将全保护氨基酸或肽片段与缩合体系混合后活化5～10min，得活化氨基酸或肽片段；
d)缩合：将步骤c)制得的活化氨基酸或肽片段加至步骤b)脱保护的氨基树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
所述全保护氨基酸、缩合体系与Fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1。
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