CN107022021A - 一种利拉鲁肽的固相合成法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备利拉鲁肽的方法，主要解决现有技术存在的使用重金属催化剂以及合成步骤复杂、纯化困难等技术缺陷。本发明技术方案包括如下步骤：1）以Fmoc‑Gly‑王树脂为载体，采用Fmoc固相合成法逐一偶联第2位至第12位氨基酸，得到多肽树脂I；2)酸解去除第11位Lys侧链的mmt保护基，并在树脂上修饰Pal‑γ‑Glu，再肼解去除Dde保护基，得到多肽树脂II；3）继续偶联第13位至第31位氨基酸，得到多肽树脂III，4）将多肽树脂进III行切割，把多肽从树脂上裂解下来同时去除侧链保护基得到利拉鲁肽粗品，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到利拉鲁肽。本发明采用的制备利拉鲁肽的工艺方法具有操作简便、粗肽纯度高、综合收率高的特点。

Description

一种利拉鲁肽的固相合成法
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，尤其涉及利拉鲁肽的固相合成方法。
背景技术
利拉鲁肽，英文名称为 liraglutide，分子 式 :C172H265N43O51，分子量 ：3751.20， CAS 号 :204656-20-2。 其肽序为 ： NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH 。
利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司研制，是胰高血糖素样肽 -1（G LP-1）的受体激动剂，作为一种皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖作用。利拉鲁肽与天然GLP-1分子结构相比有一个氨基酸差异，并增加了一个16碳棕榈 酰脂肪酸侧链，与天然人 GLP-1 有 95%同源性。并且由于脂肪酸侧链的存在，其分子不易被 DPP-IV 降解，并能与白蛋白结合因而有较高的代谢稳定性。 利拉鲁肽的活性由其与 GLP-1 受体间特定的相互作用介导，导致环磷酸腺苷 （cAMP）的增加。利拉鲁肽能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌，同时以葡萄糖 浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。
目前利拉鲁肽的合成方法有固相法和固液相结合两种方法，CN201110271342.3公开了一种固相合成利拉鲁肽的合成方法，选择了Lys(Alloc)保护策略，去除alloc要用到重金属催化剂四三苯基膦钯，这一反应后处理麻烦且不环保，不利于后期的工艺放大及产业化，另一方面合成完全序列后肽序中的β折叠二级结构极易将Lys的侧链-NH2包裹，从而导致γ-Glu-Pal这一段修饰的偶联不完全，不利于后期的纯化。CN201410001671.X和CN201310201411.2都公开了一种固液相合成利拉鲁肽的方法，CN201410001671.X选择了液相合成Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)OH这一片段，CN201310201411.2则选择了Boc-His(Trt)-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH，Nα-PAL-Glu(α-OtBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH四个二肽片段，固液相结合合成步骤复杂，放大控制项目多不稳定，且生产的副产物多，杂质的去除要多次洗涤或其他手段纯化，带来成本高的特点，不利于产业化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的利拉鲁肽的固相合成方法，主要解决现有技术存在的使用重金属催化剂以及合成步骤复杂、纯化困难等技术缺陷。
本发明的技术方案为：一种利拉鲁肽的固相合成法，包括如下步骤：
（1）以Fmoc-Gly-王树脂为载体，采用Fmoc固相合成法逐一偶联第2位至第12位氨基酸，得到多肽树脂I： Dde-Lys(mmt)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（I）；
（2）酸解去除第11位Lys侧链的mmt保护基，并在树脂上修饰Pal-γ-Glu，再肼解去除Dde保护基，得到多肽树脂II：
NH2-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（II）；
（3）继续偶联第13位至第31位氨基酸，其中第20，21位氨基酸和第24，25位残基分别用假二肽片段X,Y所取代，得到多肽树脂III：
His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Y-Asp(Otbu)-Val-X-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（III）
X= Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)；Y= Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)；
（4）加入裂解试剂对多肽树脂III进行裂解，将三十一肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，同时打开序列中两个个假二肽片段X,Y的五元环，得到利拉鲁肽粗品，如式IV所示；粗品再经高效液相色谱分离纯化、冻干精制得到利拉鲁肽：NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH。
具体步骤如下：
（1）取Fmoc-Gly-王树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH,NMM,选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-王树脂；然后再加入脱帽试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完第12位的赖氨酸,得到多肽树脂I：
Dde-Lys(mmt)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂,
所说的保护氨基酸依次包括Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Dde-Lys(mmt)-OH；
Fmoc-Gly-王树脂的取代度在0.3mmol/g-0.5mmol/g之间，优选0.35mmol/g，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Arg(Pbf)-OH的量为Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的2倍，每一步保护氨基酸的量的是Arg(Pbf)-Gly-王树脂摩尔量的2倍，HBTU/HOBT的量是Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的2倍，NMM的量是Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的4倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
（2）在步骤（1）获得的多肽树脂I中，加入酸解试剂，反应30分钟，抽干，重复两次，用DMF洗涤10次，抽干；加入Fmoc-Glu-Otbu,NMM,选择HATU/HOAT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，再加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，加入棕榈酸，NMM，选择HATU/HOAT作为缩合剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，再加入肼解试剂，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，抽干得到多肽树脂II：
NH2-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂；
酸解试剂为体积比为2.5%：2.5%：95%的TFA/TIS/DCM的混合溶液，肼解试剂为体积比为5%：95%的水合肼/DMF混合溶液，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Glu-Otbu和棕榈酸的量为多肽树脂I摩尔量的5倍，HATU/HOAT的量是多肽树脂I摩尔量的5倍，NMM的量是多肽树脂I摩尔量的10倍。
（3）在步骤（2）获得的多肽树脂II中，加入Fmoc-Ala-OH,NMM,选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，再加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，得到NH2-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂，之后依次加入保护氨基酸及假二肽片段，NMM，选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，直至连完最后一个组氨酸，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到多肽树脂III：
His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂；
所说的保护氨基酸及假二肽片段，依次包括Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Leu-OH，
Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-OH，Fmoc-Val-OH， Fmoc-Asp(otbu)-OH，Fmoc-Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-His(trt)-OH；
脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，在加Fmoc-Ala-OH时，Fmoc-Ala-OH的量是多肽树脂II摩尔量的2倍，HBTU/HOBT的量是多肽树脂II摩尔量的2倍，NMM的量是是多肽树脂II摩尔量的4倍；在加保护氨基酸时，每一步保护氨基酸的量的是NH2-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂摩尔量的2倍，HBTU/HOBT的量是NH2-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂摩尔量的2倍，NMM的量是NH2-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂摩尔量的4倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
（4）在步骤（3）所得到的多肽树脂III中加入切肽试剂，反应2-3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入6倍体积的冰乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5次，真空干燥，获得利拉鲁肽粗品。
切肽试剂选用体积比TFA:TIS:H2O=95%:3%:2%的混合试剂。
本发明中一些常用缩写具有以下含义
HBTU：O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HATU：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
NMM：N-甲基吗啉
Fmoc：芴甲氧羰基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5磺酰基
Trt：三苯甲基
Tbu：叔丁基
Otbu：叔丁氧基
Boc：叔丁氧羰基
mmt：4-甲氧基三苯基
Trp：色氨酸
Tyr：酪氨酸
Thr：苏氨酸
Gly：甘氨酸
Ala：丙氨酸
Ser：丝氨酸
Asp：天冬氨酸
Arg：精氨酸
His：组氨酸
Gln：谷氨酰胺
Leu：亮氨酸
Ile：异亮氨酸
Phe：苯丙氨酸
Lys：赖氨酸
Glu：谷氨酸
Val：缬氨酸
Pal：棕榈酸
Pip：哌啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷。
本发明的有益效果：申请人在研究中发现，选择Lys(mmt)保护策略，酸解去除mmt保护基，直接在树脂上修饰Lys侧链的γ-Glu-Pal这一片段，再逐一偶联后续的氨基酸。这一方法中去mmt的酸解试剂环保易得，后处理简便易操作，副反应少，利于后期产业化；另一方面先修饰(γ-Glu-Pal）后合成全序列这一合成路线还提高了γ-Glu-Pal这一段修饰的偶联效率，有效避免了-γ-Glu及-γ-Glu-Pal残肽片段的产生，利于后期的纯化，同时在后续序列中引入两个个类脯氨酸的假二肽片段X,Y,大大降低了β折叠二级空间结构，减少了残肽的形成，提高了后期纯化的收率。
附图说明
图1为本发明产品色谱图。
图2为本发明产品质谱图。
具体实施方式
以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述，但本发明不限于这具体实例。
实施例1：
（1）制备多肽树脂I
称取Fmoc-Gly-王树脂57.1克(0.35mmol/g, 20mmol)，用500ml DMF浸泡30分钟，抽干，加入500ml脱帽试剂，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH(MW:648.8，40mmol)26.0g，HBTU(MW:379.2，40mmol) 15.2g，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g，NMM (MW:102.1，80mmol)9.0ml，DMF500ml，反应0.5-2小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-王树脂，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，直至连完第12位的赖氨酸，DMF洗涤3次，得到多肽树脂I：Dde-Lys(mmt)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂。
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Val-OH(MW:339.4，40mmol)13.6g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Trp(boc)-OH(MW:526.6，40mmol)21.1g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Glu(otbu)-OH(MW:425.5，40mmol)17.0g，
Dde-Lys(mmt)-OH(MW:582.7，40mmol)23.3g，
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：HBTU(MW:379.2，40mmol)15.2g，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：NMM(MW:102，80mmol)9.0ml
脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液。
（2）制备多肽树脂II
在步骤（1）获得的多肽树脂I中，加入500ml酸解试剂，配比为TFA:TIS:H2O=95:3:2(v/v)，反应30分钟，抽干，重复两次，用DMF洗涤10次，抽干；加入Fmoc-Glu-Otbu(MW:425.5，100mmol)42.6g，HATU(MW:380.2，100mmol)38.0g，HOAT(MW:136.1，100mmol)13.6g，NMM(MW:102.1，200mmol)22.5ml，DMF500ml，反应0.5-2小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，再加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，加入棕榈酸(MW:256.4，100mmol)25.6g，HATU(MW:380.2，100mmol)38.0g，HOAT(MW:136.1，100mmol)13.6g，NMM(MW:102.1，200mmol)22.5ml，DMF500ml，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，再加入500ml肼解试剂，配比为水合肼：DMF=5:95(v/v)，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，抽干得到多肽树脂II;
NH2-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂。
脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液。
（3）制备多肽树脂III
在步骤（2）获得的多肽树脂II中，加入Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，HBTU(MW:379.2，40mmol) 15.2g，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g，NMM (MW:102.1，80mmol)9.0ml，DMF500ml，反应0.5-2小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得NH2-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-王树脂；之后依次加入保护氨基酸及假二肽片段，NMM，选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，直至连完最后一个组氨酸，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到多肽树脂III,
His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Gln(trt)-OH(MW:610.7，40mmol)24.5g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Glu(Otbu)-OH(MW:425.5，40mmol)17.0g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Tyr(tbu)-OH(MW:459.6，40mmol)18.4g，
X=Fmoc-Ser(tbu)-Ser{psi(me,me)pro}-OH(MW:510.58，40mmol)20.4g，
Fmoc-Val-OH(MW:339.4，40mmol)13.6g，
Fmoc-Asp(otbu)-OH(MW:411.5，40mmol)16.5g，
Y=Fmoc-Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-OH(MW:524.58，40mmol)21.0g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，40mmol)15.9g
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Glu(otbu)-OH(MW:425.5，40mmol)17.0g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-His(trt)-OH(MW:619.7，40mmol)24.8g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：HBTU(MW:379.2，40mmol)15.2g，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：NMM(MW:102，80mmol)9.0ml
脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液。
（4）制备利拉鲁肽
取步骤（3）中多肽树脂III共161g置于2L的圆底烧瓶中，加入1.6L切割试剂，配比为TFA:TIS:H2O=95:3:2(v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入8L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得利拉鲁肽粗品75g，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到纯度大于98%的利拉鲁肽精品38g，如图1，图2所示，总收率达到51%。
实施例2
选取的Fmoc-Gly-王树脂取代度为0.3mmol/g；其余同实施例1，最终得到利拉鲁肽精品37g，总收率达到50%。
实施例3
选取的Fmoc-Gly-王树脂取代度为0.5mmol/g；其余同实施例1，最终得到利拉鲁肽精品35g，总收率达到46%。

Claims (9)

1.一种利拉鲁肽的固相合成法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以Fmoc-Gly-王树脂为载体，采用Fmoc固相合成法逐一偶联第2位至第12位氨基酸，得到多肽树脂I： Dde-Lys(mmt)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（I）；
（2）酸解去除第11位Lys侧链的mmt保护基，并在树脂上修饰Pal-γ-Glu，再肼解去除Dde保护基，得到多肽树脂II：
NH2-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（II）；
（3）继续偶联第13位至第31位氨基酸，其中第20，21位氨基酸和第24，25位残基分别用假二肽片段X,Y所取代，得到多肽树脂III：
His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Y-Asp(Otbu)-Val-X-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂（III）
X= Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)；Y= Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)；
（4）加入裂解试剂对多肽树脂III进行裂解，将三十一肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，同时打开序列中两个个假二肽片段X,Y的五元环，得到利拉鲁肽粗品，利拉鲁肽粗品再经高效液相色谱分离纯化、冻干精制得到利拉鲁肽：
NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）具体内容包括如下步骤
取Fmoc-Gly-王树脂用DMF浸泡，使Fmoc-Gly-王树脂充分溶胀，抽干，加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH,NMM,选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-王树脂；然后再加入脱帽试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完第12位的赖氨酸,得到多肽树脂I：Dde-Lys(mmt)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂,所说的保护氨基酸依次包括Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Dde-Lys(mmt)-OH。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Fmoc-Gly-王树脂的取代度在0.3mmol/g-0.5mmol/g之间，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Arg(Pbf)-OH的量为Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的2倍，每一步保护氨基酸的量的是Arg(Pbf)-Gly-王树脂摩尔量的2倍，HBTU/HOBT的量是Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的2倍，NMM的量是Fmoc-Gly-王树脂摩尔量的4倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）具体内容包括如下步骤
在步骤（1）获得的多肽树脂I中，加入酸解试剂，反应30分钟，抽干，重复两次，用DMF洗涤10次，抽干；加入Fmoc-Glu-Otbu,NMM,选择HATU/HOAT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干；再加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，加入棕榈酸，NMM，选择HATU/HOAT作为缩合剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次；再加入肼解试剂，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，得到多肽树脂II：
NH2-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，酸解试剂为体积比为2.5%:2.5%:95%的TFA/TIS/DCM的混合溶液，肼解试剂为体积比为5%:95%的水合肼/DMF混合溶液，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Glu-Otbu和棕榈酸的量为多肽树脂I摩尔量的5倍，HATU/HOAT的量是多肽树脂I摩尔量的5倍，NMM的量是多肽树脂I摩尔量的10倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）具体内容包括如下步骤
在步骤（2）获得的多肽树脂II中，加入Fmoc-Ala-OH,NMM,选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，再加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，DMF洗涤5次，得到NH2-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂，之后依次加入保护氨基酸及假二肽片段，NMM，选择HBTU/HOBT作为缩合剂，以DMF作为溶剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，直至连完最后一个组氨酸，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到多肽树脂III：
His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂；
所说的保护氨基酸及假二肽片段，依次包括Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Leu-OH，
Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-OH，Fmoc-Val-OH， Fmoc-Asp(otbu)-OH，Fmoc-Thr(tbu)-Ser(psi(me,me)pro)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-His(trt)-OH。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Ala-OH的量是多肽树脂II摩尔量的2倍，每一步保护氨基酸的量的是NH2-Ala-Lys(γ-Glu-Pal)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂摩尔量的2倍，HBTU/HOBT的每次缩合，其加入量是均是对应的树脂摩尔量的2倍，NMM的每次加入，其加入量是均是对应的树脂摩尔量的4倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）具体内容包括如下步骤
在步骤（3）所得到的树脂III中加入切肽试剂，反应2-3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入6倍体积的冰乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5次，真空干燥，获得利拉鲁肽粗品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，切肽试剂选用体积比TFA:TIS:H2O=95%:3%:2%的混合试剂。
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