CN109734794A - 一种阿巴帕肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽药物制备技术领域，提供了一种阿巴帕肽的制备方法，首先在缩合体系作用下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc‑Leu‑Leu‑OH二肽片段和Fmoc‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑OH三肽片段按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端的顺序进行缩合，得到阿巴帕肽‑氨基树脂；再将阿巴帕肽‑氨基树脂进行裂解、纯化和冻干处理，得到阿巴帕肽。本发明提供的制备方法步骤简单、原料消耗低，并且产品产率高、纯度高，适合规模化工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，特别涉及一种阿巴帕肽的制备方法。
背景技术
甲状旁腺激素(PTH)是一种由甲状旁腺主细胞分泌的，调节体内钙和磷代谢的多肽类激素，其C端肽链与PTH-II受体结合可促进骨细胞凋亡、N端肽链与PTH-I受体结合可促进骨骼重建。Lilly公司以人甲状旁腺素(hPTH)N-末端34个氨基酸残基研制的用于治疗骨质疏松症的药物特立帕肽(Teriparatide)于2002年12月被FDA批准上市。
阿巴帕肽，英文名称为Abaloparatide，是由Radius Health公司研制的一种新型甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)，它是PTH-I受体强有力的选择性激活剂，可以增加骨矿物质含量、骨密度以及骨强度，促进骨骼形成，已于2017年4月28日被FDA批准上市，其商品名称为Tymlos。阿巴帕肽经皮下注射，用于治疗处于骨折风险或对其它治疗药物无效的绝经后妇女的骨质疏松症，可有效降低新发椎体和非椎体骨折率。与特立帕肽相比，阿巴帕肽能够更好的降低骨折率和高钙血症发生率。
阿巴帕肽是由34个氨基酸残基组成的多肽，分子式为C174H300N56O49，分子量为3960.64g/mol，CAS号为247062-33-5，其结构如下：
Ala1-Val2-Ser3-Glu4-His5-Gln6-Leu7-Leu8-His9-Asp10-Lys11-Gly12-Lys13-Ser14-Ile15-Gln16-Asp17-Leu18-Arg19-Arg20-Arg21-Glu22-Leu23-Leu24-Glu25-Lys26-Leu27-Leu28-Aib29-Lys30-Leu31-His32-Thr33-Ala34-NH2。
专利US6921750B2公开了Boc策略固相合成阿巴帕肽，该策略反复使用TFA切除Boc保护基，同时使用危险性的强酸氢氟酸对肽树脂进行裂解。
专利CN106146648A公开了阿巴帕肽的制备方法，首先采用固相合成的方法合成3个肽树脂片段，随后将肽片段2和3与肽树脂片段1进行连接。然而该方法肽片段2和3进行缩合之前需要冻干过程，并且肽树脂片段2和3的生成需要使用大量昂贵的2-CTC树脂，导致生产成本增加。
专利CN108047329A公开了阿巴帕肽的制备方法，首先采用液相合成法合成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Ala-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH，再以氨基树脂作为固相合成的载体，按照阿巴帕肽的氨基酸序列从C端至N端依次缩合α-NH2带有Fmoc保护基的全保护氨基酸和上述所合成的二肽片段、四肽片段。该方法液相合成短肽较多，制备过程非常繁琐。
因此，亟待开发一种过程简单、成本低，且产品收率高的阿巴帕肽的制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种阿巴帕肽的制备方法。本发明提供的制备方法步骤简单、成本低且产品产率高、纯度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种阿巴帕肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在缩合体系作用下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段进行缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂；所述缩合反应按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端的顺序进行缩合；
(2)将步骤(1)得到的阿巴帕肽-氨基树脂进行裂解，得到阿巴帕肽粗肽；
(3)将所述阿巴帕肽粗肽依次进行纯化和冻干处理，得到阿巴帕肽。
优选地，所述步骤(1)中的Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段由以下方法制备得到：
(Ⅰ)将Fmoc-Leu-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-OSu；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)所述的Fmoc-Leu-OSu和H-Leu-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-Leu-OH。
优选地，所述步骤(1)中的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段由以下方法制备得到：
(a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-OSu；
(b)将步骤(a)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH；
(c)将步骤(b)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu；
(d)将步骤(c)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
优选地，所述步骤(1)中缩合反应具体为：
(A)将Fmoc保护的氨基树脂溶胀后，在去保护溶液的作用下脱Fmoc保护，得到脱保护的氨基树脂；
(B)分别将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段与缩合体系混合后活化，得到活化氨基酸和肽片段；
(C)将步骤(B)所述的活化氨基酸和肽片段与步骤(A)所述的脱保护的氨基树脂混合，进行氨基酸的缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂；
所述步骤(A)和步骤(B)没有时间顺序的要求。
优选地，所述步骤(A)中去保护溶液为哌啶和DMF的混合溶液，所述混合溶液中哌啶和DMF的体积比为1:(2～5)。
优选地，所述缩合体系包括缩合剂和反应溶剂；所述缩合剂为DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中一种或几种。
优选地，所述缩合反应缩合全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段的顺序依次为：
Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、
Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH；所述阿巴帕肽-氨基树脂为：
Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-
Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pb f)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-L eu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-氨基树脂。
优选地，所述氨基树脂包括Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂、RinkAmideBHA树脂和Sieber树脂中的一种或几种；所述氨基树脂的取代度为0.2～1.0mmol/g。
优选地，所述步骤(2)中裂解阿巴帕肽-氨基树脂的方法为：将所述阿巴帕肽-氨基树脂在裂解试剂中进行裂解反应，得到阿巴帕肽粗肽。
优选地，所述裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，所述混合溶剂中TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的体积比为(80～90):(2～8):(1～5):(1～5):(0.5～2)；所述裂解试剂的加入量为阿巴帕肽-氨基树脂体积的5～10倍。
本发明提供了一种阿巴帕肽的制备方法，首先在缩合体系作用下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端的顺序进行缩合，得到阿巴帕肽-氨基树脂；再将阿巴帕肽-氨基树脂进行裂解、纯化和冻干处理，得到阿巴帕肽。本发明将Arg和Leu残基分别以肽片段Arg-Arg-Arg和Leu-Leu的形式接入，简化了阿巴帕肽的合成步骤，制备过程更加简单；同时有效的避免了缺失肽杂质[-1Arg]-阿巴帕肽、[-2Arg]-阿巴帕肽和[-3Arg]-阿巴帕肽、杂质[+1Leu]-阿巴帕肽和[-1Leu]-阿巴帕肽的产生。本发明提供的制备方法步骤简单、原料消耗低，并且产品产率高、纯度高，适合规模化工业生产。实施例结果表明，由本发明提供的制备方法制备的阿巴帕肽的纯度可达99.8％，收率可达60％。
附图说明
图1为实施例5制备的阿巴帕肽产品的质谱图。
具体实施方式
本发明中所使用的缩写的具体含义见表1：
表1各缩写的具体含义
本发明提供了一种阿巴帕肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在缩合体系作用下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段进行缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂；所述缩合反应按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端的顺序进行缩合；
(2)将步骤(1)得到的阿巴帕肽-氨基树脂进行裂解，得到阿巴帕肽粗肽；
(3)将所述阿巴帕肽粗肽依次进行纯化和冻干处理，得到阿巴帕肽。
在本发明中，所述Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段优选采用液相合成法制备得到。在本发明中，所述Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段由以下方法制备得到：
(Ⅰ)将Fmoc-Leu-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-OSu；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)所述的Fmoc-Leu-OSu和H-Leu-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-Leu-OH。
本发明优选将Fmoc-Leu-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-OSu。在本发明中，所述步骤(Ⅰ)中偶联反应的溶剂优选为THF，本发明对所述溶剂的用量没有特殊要求，能够使反应顺利进行即可；所述Fmoc-Leu-OH、HOSu和DCC的摩尔比优选为(0.8～1.2):(1～1.2):(1～1.2)。在本发明中，所述步骤(Ⅰ)中偶联反应优选包括依次进行的低温反应阶段和室温反应阶段，所述低温反应阶段优选为在冰水浴条件下进行，时间优选为0.5～2h，更优选为1h；所述室温反应阶段的温度优选为15～35℃，更优选为25℃，时间优选为2～5h，更优选为3h。在本发明中，所述DCC为偶联反应的缩合试剂。
在本发明的具体实施例中，优选先将所述Fmoc-Leu-OH和HOSu溶解于溶剂中，然后再在冰水浴的条件下，向所得混合液中滴加DCC溶液，然后在冰水浴条件下进行低温反应，低温反应完成后，将反应液温度升至室温，开始进行室温反应。在本发明中，所述低温反应的时间以所述DCC溶液滴加完毕开始计算；所述室温反应的时间自升温至室温反应阶段的温度时开始计算。
步骤(Ⅰ)中偶联反应完成后，本发明优选对得到的偶联反应液进行后处理；所述后处理优选为：将所述偶联反应液依次进行过滤和第一蒸干，得到蒸干物；将所述蒸干物溶解于DCM中，然后依次进行过滤和第二蒸干，得到粗产物；使用乙酸乙酯为溶剂，将所述粗产物进行重结晶，得到Fmoc-Leu-OSu。
本发明对所述过滤、溶解、蒸干和重结晶的具体操作方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法即可。
得到Fmoc-Leu-OSu后，本发明优选将所述Fmoc-Leu-OSu和H-Leu-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-Leu-OH。在本发明中，所述碱优选为碳酸钠。在本发明中，所述步骤(Ⅱ)中偶联反应的溶剂优选为THF-H2O混合溶剂，本发明对所述溶剂的用量没有特殊要求，能够使反应顺利进行即可；所述Fmoc-Leu-OSu、H-Leu-OH、碱的摩尔比优选为(0.8～1.2):(1～1.5):(1～1.5)。在本发明中，所述步骤(Ⅱ)中偶联反应的温度优选为15～35℃，更优选为25℃，时间优选为5～24h，更优选为10～16h。
在本发明具体实施例中，所述步骤(Ⅱ)中偶联反应的步骤具体优选为：
将所述H-Leu-OH和Na2CO3溶于THF水溶液中，得混合溶液Ⅰ；
将所述Fmoc-Leu-OSu溶于THF中，得混合溶液Ⅱ；
将所述混合溶液Ⅱ滴加至所述混合溶液Ⅰ中进行所述步骤(Ⅱ)中的偶联反应。
在本发明中，所述步骤(Ⅱ)中偶联反应的时间自混合溶液Ⅱ滴加完毕时开始计算。
步骤(Ⅱ)中偶联反应完成后，本发明优选对得到的偶联反应液进行后处理。在本发明中，所述后处理优选包括：将所述偶联反应液依次进行旋蒸、萃取、洗涤、干燥和重结晶，得到Fmoc-Leu-Leu-OH。在本发明中，所述萃取用萃取剂优选为乙酸乙酯，本发明优选在萃取前使用体积分数为15％的柠檬酸将旋蒸液的pH值调至3；在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为饱和NaCl溶液；所述干燥用干燥剂优选为无水Na2SO4；所述重结晶用溶剂优选为乙酸乙酯。
在本发明中，所述Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段由以下方法制备得到：
(a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-OSu；
(b)将步骤(a)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH；
(c)将步骤(b)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu；
(d)将步骤(c)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
在本发明中，所述Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段的具体制备过程与上述Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段的具体制备过程相似，其中步骤(a)和(c)的具体过程对应于上述步骤(Ⅰ)的具体过程，步骤(b)和(d)的具体过程对应于上述步骤(Ⅱ)的具体过程，仅将反应原料进行替换即可，在此不再赘述。
得到Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段后，本发明在缩合体系作用下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段进行缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂；所述缩合反应按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端的顺序进行缩合。
在本发明中，所述缩合反应优选包括以下步骤：
(A)将Fmoc保护的氨基树脂溶胀后，在去保护溶液的作用下脱Fmoc保护，得到脱保护的氨基树脂；
(B)分别将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段与缩合体系混合后活化，得到活化氨基酸和肽片段；
(C)将步骤(B)所述的活化氨基酸和肽片段与步骤(A)所述的脱保护的氨基树脂混合，进行氨基酸的缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂；
所述步骤(A)和步骤(B)没有时间顺序的要求。
本发明优选将Fmoc保护的氨基树脂溶胀后，在去保护溶液的作用下脱Fmoc保护，得到脱保护的氨基树脂。在本发明中，所述氨基树脂优选包括RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂、Rink Amide BHA树脂和Sieber树脂中的一种或几种；所述氨基树脂的取代度优选为0.2～1.0mmol/g，更优选为0.6mmol/g。
在本发明中，所述溶胀用溶胀剂优选为DCM或DMF；所述氨基树脂与溶胀剂的用量比优选为1g：5～15ml；所述溶胀的时间优选为0.2～1h；本发明优选将溶胀剂加入所述氨基树脂中进行溶胀。
溶胀完成后，本发明优选将溶胀体系中的溶胀剂抽干，然后对树脂进行洗涤，得到溶胀氨基树脂固体；所述洗涤用溶剂优选为DMF。
在本发明中，所述去保护溶液优选为哌啶和DMF的混合溶液，所述混合溶液中哌啶和DMF的体积比优选为1:(2～5)。在本发明中，所述溶胀氨基树脂固体与去保护溶液的用量比优选为1g：5～15ml。本发明优选将所述去保护溶液加入到所述溶胀氨基树脂固体中，进行脱Fmoc保护。
在本发明中，所述脱Fmoc保护优选依次包括第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，具体为：将去保护溶液加入到溶胀氨基树脂固体中，进行脱Fmoc保护，得到第一脱Fmoc保护氨基树脂；再将去保护溶液加入到所述第一脱Fmoc保护氨基树脂中，进行第二次脱Fmoc保护，得到脱Fmoc保护氨基树脂。在本发明中，所述第一次脱Fmoc保护的温度优选为15～35℃，时间优选为5min；所述第二次脱Fmoc保护的温度优选为15～35℃，时间优选为10min。本发明采用两次脱Fmoc保护，可以保证氨基树脂完全脱Fmoc保护。
脱Fmoc保护后，本发明优选将脱Fmoc保护的氨基树脂洗涤至中性；所述洗涤用洗涤剂优选为DMF。
本发明优选分别将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段与缩合体系混合后活化，得到活化氨基酸和肽片段。在本发明中，所述缩合体系优选包括缩合剂和反应溶剂；所述缩合剂为DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂优选为DMF、DCM、NMP和DMSO中一种或几种。在本发明中，所述活化的温度优选为15～30℃，更优选为25℃，时间优选为5～10min，更优选为8min。本发明通过活化将所述全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段在缩合体系作用下生成相应的活化酯。
得到活化氨基酸和肽片段后，本发明优选将所述活化氨基酸和肽片段与所述脱保护的氨基树脂混合，进行氨基酸的缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂。本发明优选按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端的顺序依次逐个将所述活化氨基酸和肽片段加入至所述脱保护的氨基树脂中进行氨基酸的缩合反应。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为15～30℃，时间优选为1～5h。在本发明中，所述缩合反应缩合全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段的顺序依次为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH；所述阿巴帕肽-氨基树脂为：Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-氨基树脂。在本发明中，所述全保护氨基酸、缩合体系与Fmoc保护的氨基树脂的摩尔比优选为2～5:2～5:1，更优选为3:3:1。
本发明优选采用茚三酮显色反应监控所述缩合反应的进程，实现活化后的氨基酸和肽片段的逐步缩合；所述茚三酮显色反应的步骤优选为：在缩合了某一氨基酸或肽片段后，取少量缩合产物置于试管中，DMF洗涤两次，在试管中分别加入一滴体积分数5％茚三酮-乙醇溶液、一滴体积分数85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶后，于120℃条件下加热2min，再用DMF洗涤两次后，观察树脂颜色：若树脂为黄色，则说明此氨基酸或肽片段缩合完全，可进行下一个氨基酸或肽片段的缩合；若树脂为蓝色，则说明此氨基酸或肽片段未缩合完全，需要重新缩合。
在本发明中，所述阿巴帕肽-氨基树脂的制备采用的是固相合成法，所述Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段的制备采用的是液相合成法，本发明通过固液结合方式能够提高生产效率，适合规模化工业生产。
缩合反应完成后，本发明优选对缩合产物体系进行后处理；所述后处理优选为：将缩合产物洗涤后进行真空干燥，得到阿巴帕肽-氨基树脂。在本发明中，所述洗涤优选为用MeOH和DCM进行交替洗涤，洗涤后将MeOH和DCM抽干；所述交替洗涤的次数优选为2～5次，所述交替洗涤的时间优选为3～10min/次。
得到阿巴帕肽-氨基树脂后，本发明将得到的阿巴帕肽-氨基树脂进行裂解，得到阿巴帕肽粗肽。在本发明中，所述裂解阿巴帕肽-氨基树脂的方法优选为：将所述阿巴帕肽-氨基树脂在裂解试剂中进行裂解反应，得到阿巴帕肽粗肽。
在本发明中，所述裂解试剂优选为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，所述混合溶剂中TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的体积比优选为(80～90):(2～8):(1～5):(1～5):(0.5～2)；所述裂解试剂的加入量优选为阿巴帕肽-氨基树脂体积的5～10倍。
在本发明中，所述裂解反应的温度优选为15～30℃，更优选为25℃，时间优选为2～5h，更优选为3h。本发明通过对阿巴帕肽-氨基树脂进行裂解，去除所述阿巴帕肽-氨基树脂中的树脂并同时脱除所有的侧链保护基。
裂解完成后，本发明优选将得到的裂解液进行后处理；所述后处理优选为：将所述裂解液抽滤得到滤液，将所述滤液加至预冷的乙醚中依次进行沉淀和离心，再用乙醚将离心产物洗涤后真空干燥，得到阿巴帕肽粗肽。在本发明中，所述滤液与预冷的乙醚的体积比为1：5～10；所述预冷的乙醚的温度优选为0～15℃。
得到阿巴帕肽粗肽后，本发明将所述阿巴帕肽粗肽依次进行纯化和冻干处理，得到阿巴帕肽。在本发明中，所述纯化的方法优选为：将所述阿巴帕肽粗肽溶解后，采用反相高效液相色谱法对阿巴帕肽粗肽进行纯化；所述反相高效液相色潽优选采用反相C18柱，所述反相高效液相色谱的紫外检测波长优选为220nm。
在本发明中，所述纯化优选包括依次进行的第一步纯化和第二步纯化。在本发明中，所述第一步纯化和第二步纯化均优选采用梯度洗脱的方法进行，所述第一步纯化采用的洗脱剂中，流动相A优选为体积分数0.1％的TFA-H2O溶液，流动相B优选为体积分数0.1％的TFA-ACN溶液；所述第二步纯化采用的洗脱剂中，流动相A优选为体积分数0.1％的乙酸-H2O溶液，流动相B优选为体积分数0.1％的乙酸-ACN溶液。在本发明中，所述两步纯化中梯度洗脱的流速独立地优选为60～90mL/min，洗脱时间独立地优选为50～80min，所述梯度洗脱中流动相B的体积浓度梯度独立地优选为10％～60％。本发明通过第一步纯化得到精肽溶液；再对得到的精肽溶液进行第二步纯化，在第二步纯化过程中除去第一步纯化残存的TFA杂质，并将多肽转化成乙酸盐形式，从而得到纯化产物。
纯化后，本发明优选将纯化后的产物进行浓缩。
浓缩后，本发明将浓缩物进行冻干处理，得阿巴帕肽。本发明对所述浓缩和冻干的方法没有特别的要求，采用本领域熟知的方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的阿巴帕肽的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
二肽片段Fmoc-Leu-Leu-OH的制备：
1)Fmoc-Leu-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Leu-OH和0.11mol HOSu溶于0.2L的THF，置于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.11mol DCC溶于0.1L的THF中，并滴至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Leu-OSu。
2)Fmoc-Leu-Leu-OH的合成：
将0.12mol H-Leu-OH和0.12mol Na2CO3溶于0.2L体积分数50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Leu-OSu溶于THF中，并滴加至混合溶液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；再用乙酸乙酯将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Leu-Leu-OH。
实施例2
Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的制备：
1)Fmoc-Arg(Pbf)-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-OH和0.11mol HOSu溶于0.2L的THF中，至于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.11mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-OSu。
2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：
将0.12mol H-Arg(Pbf)-OH和0.12molNa2CO3溶于0.2L体积分数50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；用乙酸乙酯将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
3)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu的合成：
将0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和0.11mol HOSu溶于2L的THF中，至于冰水浴，得混合液Ⅲ；将0.11mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅲ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu。
4)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：
将0.12mol H-Arg(Pbf)-OH和0.12molNa2CO3溶于0.2L体积分数50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅳ；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅳ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
实施例3
阿巴帕肽-氨基树脂的制备：
1)Fmoc氨基树脂溶胀：取20g替代度为0.5mmol/g的RinkAmide MBHA树脂，加入200mL DCM或DMF将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂后，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂，得氨基树脂固体Ⅰ。
2)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤1)制得的氨基树脂固体Ⅰ中，加入200mL体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护溶液，在25℃条件下进行两次脱Fmoc保护：第一次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，第一次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min后，再用DMF洗涤氨基树脂pH至7，抽干溶剂，得脱保护的氨基树脂。
3)氨基酸和肽片段活化：分别将Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH各30mmol与缩合体系：30mmolHOBT和30mmol DIC，用适量的DMF溶解，在25℃条件下反应5min，得活化后的氨基酸和肽片段。
4)缩合：将步骤3)制得的活化后的氨基酸和活化后的肽片段加至步骤2)制得的脱除Fmoc保护基的氨基树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控缩合反应进程，逐步缩合活化后的保护氨基酸和肽片段：按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端依次缩合的全保护氨基酸和肽片段顺序为Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH；最终得线性全保护阿巴帕肽-氨基树脂Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA树脂；树脂增重率92％。
上述茚三酮显色方法：取少量树脂至于试管中，DMF洗涤两次，在试管中分别加入一滴体积分数5％茚三酮-乙醇溶液、一滴体积分数85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶后，于120℃条件下加热2min后，再用DMF洗涤两次后，观察树脂颜色。
5)肽树脂收缩：将步骤4)制得的肽树脂用500mL MeOH和500mLDCM交替洗涤三次，5min/次，抽干溶剂，真空干燥，得阿巴帕肽树脂。
实施例4
阿巴帕肽粗肽的制备：
裂解实施例3制得的阿巴帕肽-氨基树脂，同时切除侧链保护基，得阿巴帕肽粗肽，具体如下：
向实施例3制得的阿巴帕肽树脂中加入其10倍体积的裂解试剂，在25℃条件下反应3h后，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次，真空干燥得到阿巴帕肽粗肽，裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，其中体积比为TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:5:2:2:1。
经检测阿巴帕肽粗肽纯度为90％。
实施例5
阿巴帕肽粗肽的纯化：
对实施例4制得的阿巴帕肽粗肽进行纯化、冻干，得阿巴帕肽纯品多肽，具体如下：
采用反相高效液相色潽法对阿巴帕肽粗肽进行纯化；反相高效液相色潽法的色谱条件为：反相C18柱，先用流动相A为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，将所要的组分收集浓缩；再采用流动相A为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；两步均为梯度洗脱：流速为80mL/min，洗脱时间为60min，洗脱梯度流动相B相体积百分数为10％～60％，紫外检测波长220nm，对阿巴帕肽纯品换盐，将所需要的组分收集浓缩，冻干，得阿巴帕肽产品。
经检测阿巴帕肽产品纯度为99.8％，总收率60％。其质谱如图1所示，[M]+1：3959.645，阿巴帕肽的理论精确分子量为：3958.270，样品质谱结果与理论分子量相符。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种阿巴帕肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在缩合体系作用下，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段进行缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂；所述缩合反应按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端的顺序进行缩合；
(2)将步骤(1)得到的阿巴帕肽-氨基树脂进行裂解，得到阿巴帕肽粗肽；
(3)将所述阿巴帕肽粗肽依次进行纯化和冻干处理，得到阿巴帕肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段由以下方法制备得到：
(Ⅰ)将Fmoc-Leu-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-OSu；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)所述的Fmoc-Leu-OSu和H-Leu-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Leu-Leu-OH。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段由以下方法制备得到：
(a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-OSu；
(b)将步骤(a)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH；
(c)将步骤(b)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和HOSu在DCC的作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu；
(d)将步骤(c)所述的Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu和H-Arg(Pbf)-OH在碱催化作用下发生偶联反应，生成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中缩合反应具体为：
(A)将Fmoc保护的氨基树脂溶胀后，在去保护溶液的作用下脱Fmoc保护，得到脱保护的氨基树脂；
(B)分别将全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段与缩合体系混合后活化，得到活化氨基酸和肽片段；
(C)将步骤(B)所述的活化氨基酸和肽片段与步骤(A)所述的脱保护的氨基树脂混合，进行氨基酸的缩合反应，得到阿巴帕肽-氨基树脂；
所述步骤(A)和步骤(B)没有时间顺序的要求。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中的去保护溶液为哌啶和DMF的混合溶液，所述混合溶液中哌啶和DMF的体积比为1:(2～5)。
6.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述缩合体系包括缩合剂和反应溶剂；所述缩合剂为DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中一种或几种。
7.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述缩合反应缩合全Fmoc保护氨基酸、Fmoc-Leu-Leu-OH二肽片段和
Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH三肽片段的顺序依次为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH；
所述阿巴帕肽-氨基树脂为：
Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pb f)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-L eu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-氨基树脂。
8.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述氨基树脂包括RinkAmide树脂、Rink Amide MBHA树脂、Rink Amide BHA树脂和Sieber树脂中的一种或几种；所述氨基树脂的取代度为0.2～1.0mmol/g。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中裂解阿巴帕肽-氨基树脂的方法为：将所述阿巴帕肽-氨基树脂在裂解试剂中进行裂解反应，得到阿巴帕肽粗肽。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，所述混合溶剂中TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的体积比为(80～90):(2～8):(1～5):(1～5):(0.5～2)；所述裂解试剂的加入量为阿巴帕肽-氨基树脂体积的5～10倍。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190510 |
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