CN106146648A - 一种甲状旁腺激素类似物的合成方法 - Google Patents

一种甲状旁腺激素类似物的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种甲状旁腺激素类似物的合成方法。本发明所述方法按照甲状旁腺激素类似物Abaloparatide肽链C端至N端的氨基酸顺序，合成1-15、16-23和24-33片段，然后再将这3个多肽片段偶联得到Abaloparatide，本发明多个片段合成同时进行，合成周期短，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，产品总收率高，利于Abaloparatide的大规模生产。

Description

一种甲状旁腺激素类似物的合成方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种甲状旁腺激素类似物的合成方法。
背景技术
甲状旁腺激素是维持机体钙磷代谢平衡的一种重要的调钙激素，是重要的骨形成促进剂。甲状旁腺激素可以调节骨代谢，直接刺激成骨细胞和破骨细胞，具有促进骨形成和促进破骨细胞活性的双重作用。低剂量可促进骨骼重建，增加骨强度，但大剂量应用时，一方面引起破骨细胞广泛活化，另一方面成骨细胞的功能受到抑制，可导致骨量丢失
甲状旁腺激素相关肽是甲状旁腺素类似物，其为合成多肽激素。目前，人工合成的特立帕肽(FORTEO)，为现今临床推荐使用的惟一有效骨形成刺激剂，关于特立帕肽治疗骨质疏松症的系统评价显示，特立帕肽可明显升高腰椎、股骨颈及总体的骨密度，可降低椎体和非椎体骨折率并改善骨微结构。
Abaloparatide是Radius Health,Inc.开发的一种甲状旁腺激素类似物，开发作为骨合成代谢治疗骨质疏松症。Abaloparatide-SC是可注射的皮下制剂。2009年8月，临床2期的数据显示，Abaloparatide-SC在脊柱和臀部产生更快更大的骨密度增加，比FORTEO(特立帕肽)高钙血症少得多。2011年4月，Abaloparatide-SC开始3期临床试验，预计在2016年获得新药批准。
Abaloparatide肽序：
H-Ala1-Val2-Ser3-Glu4-His5-Gln6-Leu7-Leu8-His9-Asp10-Lys11-Gly12-Lys13-Ser14-Ile15-Gln16-Asp17-Leu18-Arg19-Arg20-Arg21-Glu22-Leu23-Leu24-Glu25-Lys26-Leu27-Leu28-2-MeAla29-Lys30-Leu31-His32-Thr33-NH2
US 6921750公开了Abaloparatide一种采用Boc固相合成方法，该方法相比于Fmoc固相法工艺复杂，需要酸碱反复洗涤，并且对环境不友好。而现有的Fmoc固相法采用逐个偶联的合成方式。然而，用逐个偶联法在制备Abaloparatide的过程中，合成周期长，杂质较多(在长肽的合成中容易产生缺省肽等杂质)，大部分杂质和目的多肽相似导致后续的纯化难以进行，收率和纯度等无法达到较高水平。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甲状旁腺激素类似物的合成方法，使得本发明所述方法能够提高甲状旁腺激素类似物Abaloparatide的粗品纯度和总收率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种甲状旁腺激素类似物的合成方法，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上的Lys侧链上、His侧链上、Thr侧链上偶联有保护基且在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端偶联有氨基树脂的肽树脂片段1；
固相合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Arg侧链上、Gln侧链上、Glu侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的肽片段2；
固相合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Glu侧链上、Thr侧链上、His侧链上、Lys侧链上、Gln侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的肽片段3；
步骤2、将肽片段2的C端与肽树脂片段1的N端进行偶联反应获得肽树脂Ⅰ；
步骤3、脱去肽树脂Ⅰ的N端保护基并与肽片段3的C端进行偶联反应获得肽树脂Ⅱ，加入裂解液去除肽树脂Ⅱ的树脂以及所有保护基得到Abaloparatide粗品；
步骤4、Abaloparatide粗品纯化后获得Abaloparatide纯品。
其中，作为优选，步骤2和步骤3所述偶联反应以HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系或HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联。进一步优选地，步骤2所述偶联反应以HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联，步骤3所述偶联反应以PyBOP/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联；
步骤2和步骤3所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：
PyBOP:HOBt:DIPEA为1:1:2，HBTU:HOBt:DIPEA为1:1:2，HOBt:DIC为1:1。
作为优选，步骤3所述裂解液为体积比TFA：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水为80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液。
作为优选，步骤2和步骤3所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，其中，作为进一步优选方案，步骤2和步骤3均为体积比DMF：DMSO为1:1的混合溶剂。
作为优选，步骤1所述固相合成肽树脂片段1为：
步骤A1、Fmoc-Thr(tBu)-OH在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-Thr(tBu)-氨基树脂；
步骤A2、脱除Fmoc保护基得到H-Thr(tBu)-氨基树脂，Fmoc-His(Trt)-OH在偶联体系作用下与H-Thr(tBu)-氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-His(Trt)-Thr(tBu)-氨基树脂；
步骤A3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-2-MeAla-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH按照步骤A2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，最后脱除N端Fmoc保护基得到H-Leu-Glu-Lys(Boc)-Leu-Leu-2-MeAla-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-氨基树脂，即肽树脂片段1；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述Trt、tBu、Boc为氨基酸侧链保护基。
在固相合成肽树脂片段1的优选方案中，进一步优选地，所述氨基树脂为0.2-1.0mmol/g的Rink amide Resin树脂、Rink amide AM Resin树脂、Rinkamide MBHA Resin树脂；
在固相合成肽树脂片段1的优选方案中，进一步优选地，所述偶联体系为DIPEA单试剂偶联体系、HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系，所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：
PyBOP:HOBt为1:1，TBTU:HOBt为1:1，HOBt:DIC为1:1，HATU：HOAT为1:1。
在固相合成肽树脂片段1的优选方案中，进一步优选地，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，优选为体积比DCM：DMF为1:1的混合溶剂。
作为优选，步骤1所述固相合成肽片段2为：
步骤B1、Fmoc-Leu-OH在偶联体系作用下与载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Leu-载体树脂；
步骤B2、脱除Fmoc保护基得到H-Leu-载体树脂，Fmoc-Glu(OtBu)-OH在偶联体系作用下与H-Leu-载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-载体树脂
步骤B3、按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH按照步骤B2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-载体树脂，加入裂解液去除载体树脂，获得Fmoc-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-OH，即为肽片段2；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、Pbf、Trt为氨基酸侧链保护基。
在固相合成肽片段2的优选方案中，进一步优选地，所述偶联体系为DIPEA单试剂偶联体系、HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系，所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：
PyBOP:HOBt为1:1，TBTU:HOBt为1:1，HOBt:DIC为1:1，HATU：HOAT为1:1。
在固相合成肽片段2的优选方案中，进一步优选地，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，优选为体积比DCM：DMF为1:1的混合溶剂。
在固相合成肽片段2的优选方案中，进一步优选地，所述裂解液为体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液。
作为优选，步骤1所述固相合成肽片段3为：
步骤C1、Fmoc-Ile-OH在偶联体系作用下与载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Ile-载体树脂；
步骤C2、脱除Fmoc保护基得到H-Ile-载体树脂，Fmoc-Ser(tBu)-OH在偶联体系作用下与H-Ile-载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Ser(tBu)-Ile–载体树脂；
步骤C3、按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH按照步骤C2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-载体树脂，加入裂解液去除载体树脂，获得Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-OH，即为肽片段3；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu、Trt、Boc为氨基酸侧链保护基。
在固相合成肽片段3的优选方案中，进一步优选地，所述偶联体系为DIPEA单试剂偶联体系、HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系，所采用的偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：
PyBOP:HOBt为1:1，TBTU:HOBt为1:1，HOBt:DIC为1:1，HATU：HOAT为1:1。
在固相合成肽片段3的优选方案中，进一步优选地，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂，优选为体积比DCM：DMF为1:1的混合溶剂。
在固相合成肽片段3的优选方案中，进一步优选地，所述裂解液为体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液。
在本发明技术方案中，所述载体树脂优选为替代度0.2-1.0mmol/g的2-CTC树脂。在本发明步骤1优选的合成步骤中，除本发明所限定的保护基外，也可以采用其他合适的保护基对氨基酸N端和侧链加以保护。
在步骤1优选的合成步骤中，延伸偶联的单个保护氨基酸与偶联体系中的偶联剂的摩尔比优选为1:1-2。
作为优选，步骤2所述肽片段2和肽树脂片段1的摩尔比为2-5:1，步骤3所述肽片段3和肽树脂Ⅰ的摩尔比为2-5:1。
在本发明所述方法中，首先按照甲状旁腺激素类似物Abaloparatide肽序合成1-15、16-23和24-33片段，然后再将这3个肽片段偶联得到Abaloparatide，以Abaloparatide主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
H-Ala1-Val2-Ser3-Glu4-His5-Gln6-Leu7-Leu8-His9-Asp10-Lys11-Gly12-Lys13-Ser14-Ile15-Gln16-Asp17-Leu18-Arg19-Arg20-Arg21-Glu22-Leu23-Leu24-Glu25-Lys26-Leu27-Leu28-2-MeAla29-Lys30-Leu31-His32-Thr33-NH2
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即为上式中编号24-33的多肽序列。本发明在步骤1中固相合成的肽树脂片段1是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上，在其Lys侧链上、His侧链上、Thr侧链上偶联有保护基且在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端偶联有氨基树脂；SEQ ID NO:2所示氨基酸序列即为上式中编号16-23的多肽序列，肽片段2是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Arg侧链上、Gln侧链上、Glu侧链上、Asp侧链上偶联有保护基；SEQ ID NO:3所示氨基酸序列即为上式中编号1-15的多肽序列，肽片段3是在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基础上，在其N端、Ser侧链上、Glu侧链上、Thr侧链上、His侧链上、Lys侧链上、Gln侧链上、Asp侧链上偶联有保护基；以上在本技术领域可以通过保护氨基酸合成原料进行合成。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质。在本技术领域，对于氨基酸侧链需要保护的基团、侧链结构以及如何偶联保护基为本领域技术人员公知。本发明中对偶联有保护基的氨基酸表示形式也是本领域常用表示形式，为本领域技术人员所熟知，如Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc为氨基酸N端保护基，括号里的OtBu为Asp侧链保护基，本发明其他保护氨基酸合成原料除非特殊说明均可参照此解释。
本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与树脂偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端Fmoc保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK(即20％哌啶的DMF溶液，体积比)脱除N端保护基。由于不断有氨基酸和树脂偶联，所合成的多肽片段树脂是不断变化的，作为优选，每个待偶联的保护氨基酸合成材料与之前已经合成的多肽片段树脂的摩尔比为2-3:1，此优选比例适用于本发明所有方案中。
作为优选，所述纯化优选为RP-HPLC纯化：进一步优选地，所述RP-HPLC纯化具体为：
Abaloparatid粗品水溶液用0.45um微孔滤膜过滤，采用Waters 600RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA水溶液/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到精肽。
将精肽溶液采用Waters 600RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到Abaloparatid纯品。
由本发明所述方法合成的Abaloparatid经RP-HPLC检测，粗品纯度为75.2％左右，纯化后纯品纯度大于99％，总收率为45％左右。而以Fmoc固相逐步偶联法合成的粗品纯度为45.5％，纯化后纯品纯度大于99％，总收率为15％左右，明显不如本发明合成的Abaloparatid。此外，本发明为了进一步验证只有适宜的片段合成方法才能够达到本发明的粗品纯度以及总收率，分别按照不同于本发明的片段数进行固相合成，结果显示，其合成的Abaloparatid的粗品纯度和总收率均低于本发明。
由以上技术方案可知，本发明按照甲状旁腺激素类似物Abaloparatide肽链C端至N端的氨基酸顺序，合成1-15、16-23和24-33片段，然后再将这3个多肽片段偶联得到Abaloparatide，本发明多个片段合成同时进行，合成周期减少了2/3，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于Abaloparatide的大规模生产。
具体实施方式
本发明公开了一种甲状旁腺激素类似物的合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1英文缩写释义
在本发明合成肽片段2、肽片段3的过程中，从滤液中沉淀出肽片段2和3可采用乙醚沉淀法实现，而Abaloparatide粗品也可直接用乙醚沉淀出。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：肽树脂片段1的制备
1、Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide Resin树脂制备
取替代度sub＝0.6mmol/g的Rink amide Resin树脂(20g，12mmol)，加入到反应柱中，用DMF溶涨30分钟以上，抽干DMF，用DBLK(含20％哌啶的DMF溶液)脱除Fmoc，每次脱除反应5分钟，共两次，脱除完毕后用DMF洗涤6次，抽干待投料。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(2.4g，6mmol)、HOBt(0.8g，6mmol)用DMF(30ml)和DCM(30ml)溶解后冰浴条件下加DIC(0.9g，7.2mmol)，活化5分钟后加入到反应柱中，60分钟后反应结束，树脂分别用DMF洗涤三次，加入封闭液(吡啶(20ml)和乙酸酐(22ml))，反应2小时后抽干，DMF洗涤6次。再用加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分钟，减压干燥得到Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide Resin(22.5g)，其替代度为0.18mmol/g。
2、肽树脂片段1的制备
称取替代度为0.18mmol/g的Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide Resin(22.5g，4mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将Fmoc-His(Trt)-OH(7.4g，12mmol)、HOBt(1.8g，13.2mmol)，溶于体积比为1:1的DCM(30ml)和DMF(30ml)混合溶液，冰浴条件下加入DIC(1.7g，13.2mmol)，活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-2-MeAla-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH延伸偶联，最后用DBLK脱除Fmoc保护，得到H-Leu-Glu-Lys(Boc)-Leu-Leu-2-MeAla-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Rink amide Resin，即肽树脂片段1。
实施例2：肽片段2的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂(40g，20mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取Fmoc-Leu-OH(21.2g，60mmol)溶于体积比为1:1的DCM(30ml)和DMF(30ml)混合溶液，冰浴条件下加入DIPEA(15.5g，120mmol)，活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h,反应结束后用封闭液(DIPEA：甲醇：DCM＝1:2:17v:v)封闭三次，每次3min。封闭液体体积按4.0ml/克树脂计算。再用加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分钟,用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。
将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(25.5g，60mmol)、HOBt(8g，60mmol)，溶于体积比为1:1的DCM(60ml)和DMF(60ml)混合溶液，冰浴条件下加入DIC(7.6g，60mmol)，活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h,(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH延伸偶联，偶联反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到肽片段2树脂Fmoc-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-2-CTC树脂75g，
称取上述合成的肽片段2树脂75g，加入至2L烧瓶中。配置裂解试剂750ml(体积比，THE：DCM＝1:4)，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至400ml左右，滴加至4000ml乙醚中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到肽片段2粗品，将粗品与水混合后后冻干，得22.0g肽片段2(Fmoc-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-OH)，纯度90％。
实施例3：肽片段3的制备
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂(40g，20mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取Fmoc-Ile-OH(21.2g，60mmol)溶于体积比为1:1的DCM(30ml)和DMF(30ml)混合溶液，冰浴条件下加入DIPEA(15.5g，120mmol)，活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h,反应结束后用封闭液(DIPEA：甲醇：DCM＝1:2:17v:v)封闭三次，每次3min。封闭液体体积按4.0ml/克树脂计算。再用加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分钟,用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。
将Fmoc-Ser(tBu)-OH(23.1g，60mmol)、HOBt(8g，60mmol)，溶于体积比为1:1的DCM(60ml)和DMF(60ml)混合溶液，冰浴条件下加入DIC(7.6g，60mmol)，活化5分钟后将溶液加入固相反应柱中，室温反应2h,(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH延伸偶联，偶联完毕后，反应结束后，DMF洗涤6次，用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到肽片段3树脂Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-2-CTC树脂80g。
称取肽片段3树脂80g，加入至1L烧瓶中。配置裂解试剂800ml(体积比，THE：DCM＝1:4)，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至400ml左右，滴加至4000ml乙醚中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到肽片段3粗品，将粗品与水混合后冻干，得28g肽片段3(Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-OH)，纯度92％。
实施例4：肽树脂Ⅰ的制备
称取实施例2合成的肽片段2(22g，20mmol)、HBTU(7.6g，20mmol)、HOBt(2.7g，20mmol)，用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入冰浴条件下加入DIPEA(5.2g，40mmol)，混合液加入实施例1合成的肽树脂片段1固相反应柱中(4mmol)，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)得到肽树脂Ⅰ，Fmoc-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu-Lys(Boc)-Leu-Leu-2-MeAla-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Rink amide Resin。
实施例5：肽树脂Ⅱ的制备
用DBLK脱除肽树脂Ⅰ的N端Fmoc保护基，然后用DMF洗涤6次；
称取实施例3合成的肽片段3(28g，20mmol)、PyBOP(10.4g，20mmol)、HOBt(2.7g，20mmol)，用DMF和DMSO为1:1的混合液溶解后加入冰浴条件下加入DIPEA(5.2g，40mmol)，混合液加入实施例4合成的肽树脂Ⅰ固相反应柱中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。然后用DMF洗涤6次，甲醇缩干得到45g肽树脂Ⅱ，Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu-Lys(Boc)-Leu-Leu-2-MeAla-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Rink amide Resin。
实施例6：肽树脂Ⅱ裂解得到Abaloparatide粗品
将实施例5中的45g肽树脂Ⅱ加入到1000ml烧瓶中，配置裂解试剂450ml(体积比，TFA:DET:PHSH:PHOH:H2O＝80:5:5:5:5)，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至4500ml乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到12.5gAbaloparatid粗品，纯度75.2％，。
实施例7：Abaloparatide粗品经纯化得到产品Abaloparatide
将实施例6中的Abaloparatid粗品水溶液用0.45um微孔滤膜过滤。采用Waters 600RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA水溶液/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5％的精肽。将精肽溶液采用Waters 600RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到6.3gAbaloparatid纯品，总收率45％，纯度大于99％。
实施例8：不同片段合成试验
为了进一步验证只有适宜的片段合成方法才能够达到本发明的纯度以及收率，分别按照不同于本发明的片段数进行固相合成，合成方法与本发明相同，结果见表2。
表2不同合成方案的Abaloparatid粗品纯度和收率
由表2可知，未按照本发明合成方案合成的Abaloparatid(方法1-4)，其粗品纯度以及总收率均不如本发明的合成方案(方法5)，由此表明，按照不同片段数进行合成对Abaloparatid的粗品纯度以及收率具有很大影响，只有按照合适的合成方案方可达到本发明的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种甲状旁腺激素类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上的Lys侧链上、His侧链上、Thr侧链上偶联有保护基且在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端偶联有氨基树脂的肽树脂片段1；
固相合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Arg侧链上、Gln侧链上、Glu侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的肽片段2；
固相合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Glu侧链上、Thr侧链上、His侧链上、Lys侧链上、Gln侧链上、Asp侧链上偶联有保护基的肽片段3；
步骤2、将肽片段2的C端与肽树脂片段1的N端进行偶联反应获得肽树脂Ⅰ；
步骤3、脱去肽树脂Ⅰ的N端保护基并与肽片段3的C端进行偶联反应获得肽树脂Ⅱ，加入裂解液去除肽树脂Ⅱ的树脂以及所有保护基得到Abaloparatide粗品；
步骤4、Abaloparatide粗品纯化后获得Abaloparatide纯品。
2.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤1所述固相合成肽树脂片段1为：
步骤A1、Fmoc-Thr(tBu)-OH在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-Thr(tBu)-氨基树脂；
步骤A2、脱除Fmoc保护基得到H-Thr(tBu)-氨基树脂，Fmoc-His(Trt)-OH在偶联体系作用下与H-Thr(tBu)-氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-His(Trt)-Thr(tBu)-氨基树脂；
步骤A3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-2-MeAla-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH按照步骤A2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，最后脱除N端Fmoc保护基得到H-Leu-Glu-Lys(Boc)-Leu-Leu-2-MeAla-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-氨基树脂，即肽树脂片段1；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述Trt、tBu、Boc为氨基酸侧链保护基。
3.根据权利要求1或2所述合成方法，其特征在于，所述氨基树脂为0.2-1.0mmol/g的Rink amide Resin树脂、Rink amide AM Resin树脂、Rink amideMBHA Resin树脂。
4.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤1所述固相合成肽片段2为：
步骤B1、Fmoc-Leu-OH在偶联体系作用下与载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Leu-载体树脂；
步骤B2、脱除Fmoc保护基得到H-Leu-载体树脂，Fmoc-Glu(OtBu)-OH在偶联体系作用下与H-Leu-载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-载体树脂
步骤B3、按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH按照步骤B2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-载体树脂，加入裂解液去除载体树脂，获得Fmoc-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-OH，即为肽片段2；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、Pbf、Trt为氨基酸侧链保护基。
5.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤1所述固相合成肽片段3为：
步骤C1、Fmoc-Ile-OH在偶联体系作用下与载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Ile-载体树脂；
步骤C2、脱除Fmoc保护基得到H-Ile-载体树脂，Fmoc-Ser(tBu)-OH在偶联体系作用下与H-Ile-载体树脂进行偶联反应得到Fmoc-Ser(tBu)-Ile–载体树脂；
步骤C3、按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH按照步骤C2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-载体树脂，加入裂解液去除载体树脂，获得Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-OH，即为肽片段3；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu、Trt、Boc为氨基酸侧链保护基。
6.根据权利要求2、4或5任意一项所述合成方法，其特征在于，所述偶联体系为DIPEA单试剂偶联体系、HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt双试剂偶联体系、HATU/HOAT双试剂偶联体系或TBTU/HOBt双试剂偶联体系。
7.根据权利要求1、2、4或5任意一项所述合成方法，其特征在于，所述偶联反应以DCM、NMP、DMF、DMSO中的一种或两种以上为溶剂。
8.根据权利要求4或5任意一项所述合成方法，其特征在于，所述裂解液为体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液。
9.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤2和步骤3所述偶联反应以HOBt/DIC双试剂偶联体系、PyBOP/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系或HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系进行偶联。
10.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤3所述裂解液为体积比TFA：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水为80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液。
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