CN102875665B - 一种合成利拉鲁肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成利拉鲁肽的方法。本发明所述方法按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成第1至第4氨基酸、第5至第10氨基酸、第11至第16氨基酸、第17至第24氨基酸以及第25至第31氨基酸的5个多肽片段，然后偶联5个多肽片段合成利拉鲁肽。本发明所述方法能够同时进行5个片段的合成，极大地缩短合成周期，提高效率，而且该方法能够提高利拉鲁肽的总收率，优于现有的合成方法。
Description
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成利拉鲁肽的方法。
背景技术
利拉鲁肽，英文名为Liraglutide，是丹麦诺和诺德公司研制出的一种治疗II型糖尿病的药物。利拉鲁肽是一种人胰高糖素样肽-1（GLP-1）类似物，其作为GLP-1受体激动剂能起到良好的降低血糖作用，肽序如下：
NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys（N-ε-（N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl））-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH
利拉鲁肽与天然GLP-1分子结构相比有一个氨基酸差异，并增加了一个16碳棕榈酰脂肪酸侧链，与天然人GLP-1有95%同源性。并且由于脂肪酸侧链的存在，其分子不易被DPP-IV降解，并能与白蛋白结合因而有较高的代谢稳定性。
在利拉鲁肽的现有合成方法中，诺和诺德公司主要是通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽，但是国内无法得到酵母菌种进行生产。专利US6268343B1、US6458924B2以及文献“Journal of Medicinal Chemistry 43，1664-1669，2000”均公开了利用中间体GLP-1(7-37)-OH和Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu来制备利拉鲁肽的方法，但是这三种现有技术中，中间体GLP-1(7-37)-OH均需要反相HPLC纯化，再在液相条件下与Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，并且由于GLP-1(7-37)-OH N端未保护以及侧链保护基全部脱除，会导致产生许多杂质，难以纯化，操作繁琐，周期长，废液多，不利于环保，并且两步纯化，需花费大量乙腈，成本高昂，不利于大规模生产等。
中国专利CN102286092A公开了一种全固相合成方法，采用2-CTC树脂或王树脂，按照利拉鲁肽肽序逐个偶联氨基酸，最后经过反向纯化得到利拉鲁肽，其不需要两步纯化而且杂质较少，优于上述几种现有制备方法。但是，这种方法需要逐个偶联氨基酸，合成周期长，总收率较低，仅为15%左右（参见CN102286092A实施例12-14），仍需要进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成利拉鲁肽的方法，使得本发明所述方法能够提高其总收率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成利拉鲁肽的方法，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、His侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段1；
固相合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Ser侧链上以及Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2；
固相合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Tyr侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段3；
固相合成在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列N端、Gln侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在Lys侧链上偶联有Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu的多肽片段4；
固相合成在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列C端偶联有王树脂或2-CTC树脂以及在Trp侧链上和Arg侧链上偶联有保护基的多肽片段5；
步骤2、将多肽片段5的N端和多肽片段4的C端偶联，偶联后脱除多肽片段4的N端保护基，得到肽树脂Ⅰ；
步骤3、将多肽片段3的C端和肽树脂Ⅰ的N端偶联，偶联后脱除多肽片段3的N端保护基，得到肽树脂Ⅱ；
步骤4、将多肽片段2的C端和肽树脂Ⅱ的N端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到肽树脂Ⅲ；
步骤5、将多肽片段1的C端和肽树脂Ⅲ的N端偶联，得到利拉鲁肽树脂；
步骤6、利拉鲁肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化后即得利拉鲁肽。
其中，步骤1所述固相载体为树脂固相载体，更优选为2-CTC树脂。
利拉鲁肽主链氨基酸有31个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能有利于提高利拉鲁肽的总收率。为此，申请人根据长期的试验研究以及氨基酸消旋情况，提出了本发明所述方法来制备利拉鲁肽，提高了总收率。
在本发明所述方法中，首先按照利拉鲁肽主链肽序分成5个片段，分别先合成这5个片段，然后再将5个片段逐步偶联获得利拉鲁肽。以利拉鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
NH2-His1-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-COOH
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即为上式中编号1-4的多肽序列，SEQ IDNO:2所示氨基酸序列即为上式中编号5-10的多肽序列，SEQ ID NO:3所示氨基酸序列即为上式中编号11-16的多肽序列，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列即为上式中编号17-24的多肽序列，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列即为上式中编号25-31的多肽序列。
本发明在步骤1中固相合成的多肽片段1是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上，在其N端、His侧链上以及Glu侧链上分别偶联保护基；固相合成的多肽片段2是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Thr侧链上、Ser侧链上以及Asp侧链上分别偶联保护基；固相合成的多肽片段3是在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基础上，在其N端、Ser侧链上、Tyr侧链上以及Glu侧链上分别偶联保护基；固相合成的多肽片段4是在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列基础上，在其N端、Gln侧链上、Glu侧链上分别偶联保护基以及在其Lys侧链上偶联有Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu（OtBu为谷氨酸上α羧基的保护基）；固相合成的多肽片段5是在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列基础上，在其C端偶联有王树脂或2-CTC树脂以及在Trp侧链上和Arg侧链上分别偶联保护基。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通过Trt保护基保护组氨酸、谷氨酰胺的侧链；通过OtBu保护基保护谷氨酸、天冬氨酸的侧链；通过tBu保护基保护苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸的侧链；通过Boc保护基保护色氨酸的侧链；通过Pdf保护基保护精氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的氨基酸中，除组氨酸外，其余氨基酸N端均优选通过Fmoc保护基进行保护，而组氨酸优选通过Boc保护基进行保护。
作为优选方案，步骤1所述固相合成多肽片段1具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸（Fmoc-Glu（OtBu）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸（Fmoc-Ala-OH）、N端偶联有Boc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的组氨酸（Fmoc-His（Trt）-OH）进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段1（Boc-His（Trt）-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH）。
作为优选方案，步骤1所述固相合成多肽片段2具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸（Fmoc-Val-OH）溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Val-固相载体，然后按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸（Fmoc-Asp（OtBu）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸（Fmoc-Ser（tBu）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸（Fmoc-Thr（tBu）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸（Fmoc-Thr（tBu）-OH）进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段2（Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH）。
作为优选方案，步骤1所述固相合成多肽片段3具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸（Fmoc-Glu（OtBu）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸（Fmoc-Leu-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的酪氨酸（Fmoc-Tyr（tBu）-OH）、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸（Fmoc-Ser（tBu）-OH）进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段3（Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH）。
作为优选方案，步骤1所述固相合成多肽片段4具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸（Fmoc-Ala-OH）溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Ala-固相载体，然后按照SEQ ID NO:4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基的异亮氨酸（Fmoc-Ile-OH）、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸（Fmoc-Glu（OtBu）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Alloc保护基的丝氨酸（Fmoc-Lys（Alloc）-OH）、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸（Fmoc-Ala-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺（Fmoc-Gln（Trt）-OH）进行延伸偶联，然后脱除赖氨酸保护基Alloc并和Nα-Palmotiyl-Glu-OtBu偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段4（Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-OH）。
其中，所述Nα-Palmotiyl-Glu-OtBu中，OtBu为谷氨酸上α羧基（即主链上的羧基）的保护基，是为了使谷氨酸侧链上的羧基和赖氨酸侧链上的氨基缩合偶联形成谷酰基（glutamyl），最终完成利拉鲁肽赖氨酸侧链的合成。
作为优选方案，步骤1所述固相合成多肽片段5具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO:5所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸（Fmoc-Arg（Pdf）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸（Fmoc-Arg（Pdf）-OH）、N端偶联有Fmoc保护基的缬氨酸（Fmoc-Val-OH）、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸（Fmoc-Leu-OH）、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的色氨酸（Fmoc-Trp（Trt）-OH）进行延伸偶联得到N段偶联有Fmoc保护基的多肽片段5，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段5（Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-固相载体），所述固相载体为王树脂或2-CTC树脂。
在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与固相载体偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应（主链氨基和羧基的缩合反应）进行偶联。在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK脱除N端保护基。
在上述固相合成多肽片段1-4的优选方案中，进一步优选采用2-CTC树脂为固相载体进行合成，更优选采用替代度范围为0.65-1.1mmol/g的2-CTC树脂为固相载体进行合成。
在上述固相合成多肽片段1-4的优选方案中，进一步优选采用体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液进行裂解。
在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，进一步优选采用HOBT／DIC双体系偶联剂、PyBOP／HOBt／DIEA三体系偶联剂或TBTU／HOBt／DIEA三体系偶联剂进行偶联。更优选为，在固相合成多肽片段1-4的优选方案中采用TBTU／HOBt／DIEA三体系偶联剂偶联；在固相合成多肽片段5的优选方案中采用HOBT／DIC双体系偶联剂偶联。对于这些多体系的偶联剂，其各组分的配比在本领域中是一定的且是公知的，在此不再赘述。
在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，进一步优选采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种溶剂来溶解，以及采用DIEA或DIC来活化，更优选为采用体积比DMF:DCM为1:1的混合溶剂、DMF或DCM来溶解，以及采用DIEA来活化。
在上述固相合成多肽片段1-5的优选方案中，进一步优选，所述偶联的氨基酸与固相载体的摩尔比为3-5:1，所述偶联的氨基酸与偶联剂中HOBt的摩尔比为1:1.1。
在上述固相合成多肽片段4的优选方案中，进一步优选用苯基硅烷和四三苯基磷钯来脱除Alloc保护基。
在上述固相合成多肽片段5的优选方案中，进一步优选，所述王树脂或2-CTC树脂的替代度为0.3-1.0mmol/g。
在本发明所述方法步骤2至步骤6中，所述偶联优选采用HOBT／DIC双体系偶联剂、PyBOP／HOBt／DIEA三体系偶联剂或HBTU／HOBt／DIEA三体系偶联剂进行偶联，所述脱出N端保护基优选采用DBLK脱除N端保护基。对于这些多体系的偶联剂，其各组分的配比在本领域中是一定的且是公知的，在此不再赘述。
在本发明所述方法步骤2至步骤5中，所述偶联优选采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种为溶剂，更优选为在步骤2和步骤3中采用体积比NMP:DMF为1:1的混合溶剂，在步骤4中采用体积比NMP:DMSO为1:1的混合溶剂，在步骤5中采用DCM为溶剂。
在本发明所述方法步骤6中，作为优选方案，所述裂解采用体积比TFA:H2O为95:5的混合裂解液、TFA:EDT:PHOH:H2O为90-95:1-5:1-3:1-2的混合裂解液或TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H2O为80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液裂解，更优选为采用TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H2O为80:5:5:5:5的混合裂解液裂解。
在本发明所述方法步骤6中，作为优选方案，所述纯化为HPLC反向纯化。
由本发明所述方法合成的利拉鲁肽经HPLC检测，纯度为99%以上，总收率为30%以上，而且本发明所述方法中5个片段可以同时进行合成，与现有逐个合成氨基酸的技术方案相比，能够极大地缩短合成周期，提高效率。
由以上技术方案可知，本发明先固相合成利拉鲁肽其中的5个多肽片段，而后再将多肽片段偶联制成成品，所述方法能够极大地缩短合成周期，提高效率，而且提高了利拉鲁肽的总收率，优于现有的合成方法。
具体实施方式
本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用王树脂和2-CTC树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1 英文缩写释义
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| tBu | 叔丁基 |
| Trt | 三苯甲基 |
| NMP | N-甲基吡咯烷酮 |
| DMSO | 二甲基亚砜 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DBLK | 20%六氢吡啶／DMF溶液 |
| DIC | N,N-二异丙基碳二亚胺 |
| DIEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| DMAP | 4-二甲胺基吡啶 |
| PYBOP | 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基 |
| TBTU | O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸 |
| HOBT | 1-羟基苯并三唑 |
| TFE | 三氟乙醇 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| PhSMe | 苯甲硫醚 |
| EDT | 1,2-乙二硫醇 |
| PHOH | 苯酚 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：多肽片段1的合成
称取替代度为0.65mmol/g的2-CTC树脂15.38g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.94g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入40mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，得到H-Gly-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将12.75g Fmoc-Glu(OtBu)-OH，4.46gHOBt，5.13ml DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC。
按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的延伸偶联。
反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到20.66g未脱除2-CTC树脂的多肽片段1，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂220ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入20mlDCM，将混合液滴加至200ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到7.19g多肽片段1，Boc-His（Trt）-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH，纯度95.78%，收率90.89%。
实施例2：多肽片段1的合成
称取替代度为1.1mmol/g的2-CTC树脂9.17g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.94g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，得到H-Gly-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将12.75g Fmoc-Glu(OtBu)-OH，4.46gHOBt，9.63gTBTU，10.45ml DIEA溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC。
按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的延伸偶联。
反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到21.12g未脱除2-CTC树脂的多肽片段1，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂220ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入20mlDCM，将混合液滴加至200ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到6.73g多肽片段1，Boc-His（Trt）-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH，纯度94.37%，收率85.3%。
实施例3：多肽片段2的合成
称取替代度为0.65mmol/g的2-CTC树脂15.38g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取6.78g Fmoc-Val-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入40mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Val-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Val-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，得到H-Val-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将12.34g Fmoc-Asp（OtBu）-OH，4.46g HOBt，5.13ml DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Asp（OtBu）-Val-2-CTC。
按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH的延伸偶联。
反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到未脱除2-CTC树脂的多肽片段2，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂220ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入20mlDCM，将混合液滴加至200ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到9.47g多肽片段2，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH，纯度96.23%，收率85.1%。
实施例4：多肽片段2的合成
称取替代度为1.1mmol/g的2-CTC树脂9.17g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取6.78g Fmoc-Val-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Val-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Val-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟,得到H-Val-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将12.34g Fmoc-Asp（OtBu）-OH，4.46g HOBt，9.63gTBTU，10.45ml DIEA溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Asp（OtBu）-Val-2-CTC。
按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH的延伸偶联。
反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到未脱除2-CTC树脂的多肽片段2，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂220ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入20mlDCM，将混合液滴加至200ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到8.9g多肽片段2，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH，纯度93.2%，收率80.2%。
实施例5：多肽片段3的合成
称取替代度为0.65mmol/g的2-CTC树脂15.38g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.94g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入40mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，得到H-Gly-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将12.75g Fmoc-Glu（OtBu）-OH，4.46g HOBt，5.13ml DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Glu（OtBu）-Gly-2-CTC。
按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、两个Fmoc-Ser（tBu）-OH的延伸偶联。
反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到未脱除2-CTC树脂的多肽片段3，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂220ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入20mlDCM，将混合液滴加至200ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到10.1g多肽片段3，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH，纯度96.8%，收率91.4%。
实施例6：多肽片段3的合成
称取替代度为1.1mmol/g的2-CTC树脂9.17g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.94g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，得到H-Gly-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将12.75g Fmoc-Glu（OtBu）-OH，4.46g HOBt，9.63gTBTU，10.45ml DIEA溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Glu（OtBu）-Gly-2-CTC。
按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、两个Fmoc-Ser（tBu）-OH的延伸偶联。
反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到未脱除2-CTC树脂的多肽片段3，加入至250ml烧瓶中。配置裂解试剂220ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入20mlDCM，将混合液滴加至200ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到9.74g多肽片段3，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH，纯度95.23%，收率88.53%。
实施例7：多肽片段4的合成
称取替代度为1.1mmol/g的2-CTC树脂9.09g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取6.62g Fmoc-Ala-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ala-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Ala-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，得到H-Ala-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将10.59g Fmoc-Ile-OH，4.46g HOBt，15.6g PyBOP，10.45ml DIEA溶于60ml DCM，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Ile-Ala-2-CTC。
按照SEQ ID NO:4所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH的延伸偶联，得到Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-2-CTC。
偶联结束后，Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-2-CTC用DCM洗涤3次，加入80ml DCM，加入苯基硅烷14.7ml，反应2分钟，再加入3.1g四三苯基磷钯，反应30分钟，抽掉反应液，DCM洗涤树脂5次，茚三酮检测显蓝黑色（赖氨酸侧链Alloc保护基已脱除，氨基裸露，茚三酮显色）。
称取Nα-Palmotiyl-Glu-OtBu 13.23g，TBTU9.83g，HOBt 4.46g，加入80mlDCM溶解，冰水浴下加入10.45ml DIEA，5分钟后，加入到反应柱中，反应2小时，茚三酮检测无色透明。抽掉反应液，DCM洗涤树脂5次，然后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到22.03g未脱除2-CTC树脂的多肽片段4，加入至300ml烧瓶中。配置裂解试剂220ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入30mlDCM，将混合液滴加至300ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到13.1g多肽片段4，Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-OH，纯度90.16%，收率84.4%。
实施例8：多肽片段4的合成
称取替代度为0.65mmol/g的2-CTC树脂15.38g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取6.62g Fmoc-Ala-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入40mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ala-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Ala-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，得到H-Ala-2-CTC，然后用DMF洗涤6次。将10.59g Fmoc-Ile-OH，4.46g HOBt，15.6g PyBOP，10.45ml DIEA溶于60ml DCM，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Ile-Ala-2-CTC。
按照SEQ ID NO:4所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH的延伸偶联，得到Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-2-CTC。
偶联结束后，Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-2-CTC用DCM洗涤3次，加入80ml DCM，加入苯基硅烷14.7ml，反应2分钟，再加入3.1g四三苯基磷钯，反应30分钟，抽掉反应液，DCM洗涤树脂5次，茚三酮检测显蓝黑色（赖氨酸侧链Alloc保护基已脱除，氨基裸露，茚三酮显色）。
称取Nα-Palmotiyl-Glu-OtBu 13.23g，TBTU9.83g，HOBt 4.46g，加入80mlDCM溶解，冰水浴下加入10.45ml DIEA，5分钟后，加入到反应柱中，反应2小时，茚三酮检测无色透明。抽掉反应液，DCM洗涤树脂5次，然后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到26.6g未脱除2-CTC树脂的多肽片段4，加入至300ml烧瓶中。配置裂解试剂270ml（体积比，THE：DCM=1:4），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸干后，加入30mlDCM，将混合液滴加至300ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到13.97g多肽片段4，Fmoc-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-OH，纯度96.10%，收率90.05%。
实施例9：多肽片段5的合成
称取替代度为1.0mmol/g的王树脂10g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取5.94g Fmoc-Gly-OH、2.97gHOBt和0.21gDMAP用DMF溶解，冰水浴下加入3.42mL DIC后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应1.2小时后，加入20mL吡啶和22ml乙酸酐封闭12小时。用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-王树脂11.1g，检测替代度为0.45mmol/g。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-王树脂中的Fmoc保护基3+7分钟，DMF洗涤6次，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 9.73g，HOBt2.23g，用30mlDMF溶解，冰水浴下加入DIC 2.57ml，3分钟后，加入到反应柱中反应2小时，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-王树脂。
按照SEQ ID NO:5所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH的延伸偶联，偶联完Fmoc-Trp(Boc)-OH后脱除其N端Fmoc保护基，得到多肽片段5，Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂。
实施例10：多肽片段5的合成
称取替代度为0.3mmol/g的2-CTC树脂33.3g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取5.94g Fmoc-Gly-OH、DMF溶解，冰水浴下加入6.94mL DIPEA后，加入上述装有树脂的反应柱中，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入100mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC中的Fmoc保护基3+7分钟，DMF洗涤6次，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 9.73g，HOBt2.23g，用30mlDMF溶解，冰水浴下加入DIC 2.57ml，3分钟后，加入到反应柱中反应2小时，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-2-CTC。
按照SEQ ID NO:5所示氨基酸序列C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH的延伸偶联，偶联完Fmoc-Trp(Boc)-OH后脱除其N端Fmoc保护基，得到多肽片段5，Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2-CTC。
实施例11：肽树脂I的合成
称取15.5g按实施例8方法合成的多肽片段4，HBTU3.21g，HOBt1.49g，用30mlNMP／DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入3.5ml DIEA，3分钟后，加入到装有实施例9得到的肽树脂片段5（即多肽片段5）的反应柱中，室温反应2.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂I，H-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-王树脂。
实施例12：肽树脂I的合成
称取15.5g按实施例7方法合成的多肽片段4，HBTU3.21g，HOBt1.49g，用30mlNMP／DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入3.5ml DIEA，3分钟后，加入到装有实施例10得到的肽树脂片段5（即多肽片段5）的反应柱中，室温反应2.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂I，H-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-2-CTC。
实施例13：肽树脂II的合成
称取16.5g按实施例6方法合成的多肽片段3，PyBOP 7.8g，HOBt2.23g，用30mlNMP／DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.23ml DIEA，3分钟后，加入到实施例11得到的肽树脂I反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂II，H-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-王树脂。
实施例14：肽树脂II的合成
称取16.5g按实施例5方法合成的多肽片段3，PyBOP 7.8g，HOBt2.23g，用30mlNMP／DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.23ml DIEA，3分钟后，加入到实施例12得到的肽树脂I反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂II，H-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-2-CTC。
实施例15：肽树脂III的合成
称取16.7g按实施例4方法合成的多肽片段2，PyBOP 7.8g，HOBt2.23g，用30mlNMP／DMSO(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.23ml DIEA，3分钟后，加入到装有实施例13得到的肽树脂II反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂III，H-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-王树脂。
实施例16：肽树脂III的合成
称取16.7g按实施例3方法合成的多肽片段2，PyBOP 7.8g，HOBt2.23g，用30mlNMP／DMSO(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.23ml DIEA，3分钟后，加入到装有实施例14得到的肽树脂II反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂III，H-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2-CTC。
实施例17：利拉鲁肽肽树脂的合成
称取11.85g按实施例1方法合成的多肽片段1，HBTU 4.82g，HOBt2.23g，用30mlDCM溶解，冰水浴下加入5.23ml DIEA，3分钟后，加入到装有实施例15得到的肽树脂III反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DCM洗涤6次，甲醇收缩得到34.85g利拉鲁肽肽树脂，Boc-His（Trt）-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-王树脂，增重率88.5%。
实施例18：利拉鲁肽肽树脂的合成
称取11.85g按实施例2方法合成的多肽片段1，HBTU 4.82g，HOBt2.23g，用30mlDCM溶解，冰水浴下加入5.23ml DIEA，3分钟后，加入到装有实施例16得到的肽树脂III反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DCM洗涤6次，甲醇收缩得到利拉鲁肽肽树脂57.1g，Boc-His（Trt）-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（N-ε-（Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu））-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pbf）-Gly-Arg（Pbf）-Gly-2-CTC，增重率82.3%。
实施例19：利拉鲁肽肽树脂的裂解
将实施例17得到的利拉鲁肽肽树脂34.85g，加入到500ml烧瓶中，配置350ml裂解液TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H2O=80:5:5:5:5，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3500ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到15.85g 利拉鲁肽粗肽，H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，粗肽收率84.7%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。
实施例20：利拉鲁肽肽树脂的裂解
将实施例17得到的肽树脂加入到500ml烧瓶中，配置350ml裂解液TFA:EDT:PHOH:H2O=92:3:3:2，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到3500ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到14.61g利拉鲁肽粗肽，H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，粗肽收率77.97%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。
实施例21：利拉鲁肽肽树脂的裂解
将实施例18得到的肽树脂加入到500ml烧瓶中，配置570ml裂解液TFA:EDT:PHOH:H2O=92:3:3:2，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到5700ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到14.1g利拉鲁肽粗肽，H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，粗肽收率75.2%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。
实施例22：利拉鲁肽粗肽的纯化
称取14.6g利拉鲁肽粗肽用20%乙腈水的混合溶剂150mL超声溶解后，采用Waters 2545 RP-HPLC系统，波长275nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。
实施例23：利拉鲁肽粗肽的纯化
脱盐纯化：色谱柱为以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150mm×250mm。0.05%氨水的水溶液为A相，色谱纯乙腈为B相，流速：500ml／min，梯度：30% B-60% B，检测波长：275nm旋转蒸发浓缩，冻干得到利拉鲁肽精肽6.35g，HPLC纯度99.4%，总收率33.86%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种合成利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、His侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段1；
固相合成在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Ser侧链上以及Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2；
固相合成在SEQ ID NO:3所示氨基酸序列N端、Ser侧链上、Tyr侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段3；
固相合成在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列N端、Gln侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在Lys侧链上偶联有Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu的多肽片段4；
固相合成在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列C端偶联有王树脂或2-CTC树脂以及在Trp侧链上和Arg侧链上偶联有保护基的多肽片段5；
步骤2、将多肽片段5的N端和多肽片段4的C端偶联，偶联后脱除多肽片段4的N端保护基，得到肽树脂Ⅰ；
步骤3、将多肽片段3的C端和肽树脂Ⅰ的N端偶联，偶联后脱除多肽片段3的N端保护基，得到肽树脂Ⅱ；
步骤4、将多肽片段2的C端和肽树脂Ⅱ的N端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到肽树脂Ⅲ；
步骤5、将多肽片段1的C端和肽树脂Ⅲ的N端偶联，得到利拉鲁肽树脂；
步骤6、利拉鲁肽树脂采用体积比TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H2O为80-85:1-5:1-5:1-5:1-5的混合裂解液裂解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化后即得利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽片段1具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Boc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的组氨酸(Fmoc-His(Trt)-OH)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段1：Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽片段2具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Val-固相载体，然后按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段2：Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-OH。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽片段3具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO:3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)进行延伸偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段3：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽片段4具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Ala-固相载体，然后按照SEQ ID NO:4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基的异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Alloc保护基的丝氨酸(Fmoc-Lys(Alloc)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln(Trt)-OH)进行延伸偶联，然后脱除赖氨酸保护基Alloc并和Nα-Palmotiyl-Glu-OtBu偶联，偶联后裂解脱除固相载体得到多肽片段4：Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl-OtBu))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述固相合成多肽片段5具体为：
将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)溶解并活化，与固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-固相载体，然后按照SEQ ID NO:5所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg(Pdf)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg(Pdf)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的缬氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的色氨酸(Fmoc-Trp(Trt)-OH)进行延伸偶联得到N段偶联有Fmoc保护基的多肽片段，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段5：Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-固相载体，所述固相载体为王树脂或2-CTC树脂。
7.根据权利要求2-5任意一项所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用的固相载体为2-CTC树脂。
8.根据权利要求2-5任意一项所述方法，其特征在于，所述裂解采用体积比TFE:DCM为1:4的混合裂解液裂解。
9.根据权利要求2-6任意一项所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用HOBT/DIC双体系偶联剂、PyBOP/HOBt/DIEA三体系偶联剂或TBTU/HOBt/DIEA三体系偶联剂偶联。
10.根据权利要求2-6任意一项所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中采用的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种。
11.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2至步骤5所述偶联采用HOBT/DIC双体系偶联剂、PyBOP/HOBt/DIEA三体系偶联剂或HBTU/HOBt/DIEA三体系偶联剂偶联。
12.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2至步骤5所述偶联采用的溶剂为DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种。
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