CN106928320B - 一种合成Etelcalcetide的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成Etelcalcetide的方法。本发明所述方法采用固相合成的策略，先合成Etelcalcetide主链肽树脂，再脱除肽链中Cys的侧链保护基，而后以2,2’‑二硫二吡啶活化肽树脂上Cys侧链的巯基并与L‑Cys构建二硫键，经裂解得到Etelcalcetide粗肽，整个过程不用经过多步纯化，所获粗肽收率和纯度较高，且纯化后精肽的总收率大幅提高。

Description

一种合成Etelcalcetide的方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成Etelcalcetide的方法。
背景技术
继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT，简称继发性甲旁亢)，是指在慢性肾功能不全、肠吸收不良综合征、Fanconi综合征和肾小管酸中毒、维生素D缺乏或抵抗以及妊娠、哺乳等情况下，甲状旁腺长期受到低血钙、低血镁或高血磷的刺激而分泌过量的甲状旁腺激素(PTH)，以提高血钙、血镁和降低血磷的一种慢性代偿性临床表现，长期的甲状旁腺增生最终导致形成功能自主的腺瘤。
Etelcalcetide是由Kai Pharmaceuticals,Inc.开发的一种新颖的拟钙剂(calcimimetic agent)，能够抑制甲状旁腺激素(PTH)的分泌。继发性甲旁亢(SHPT)是接受透析治疗的慢性肾脏病(CKD)患者中一种常见且严重的代偿失调疾病。目前已知，持续升高的甲状旁腺激素(PTH)与CKD患者的关键临床结局相关。Etelcalcetide可结合并激活甲状旁腺上的钙敏感受体，实现甲状旁腺激素(PTH)水平的降低。
Etelcalcetide有3个D构型的精氨酸、2个D构型的丙氨酸、1个D构型的精氨酰胺、1个D构型半胱氨酸与1个L构型半胱氨酸(N段被乙酰基封闭)构成，其中D构型半胱氨酸与L构型半胱氨酸以二硫键连接在一起(N-acetyl-D-cysteinyl-D-alanyl-D-arginyl-D-arginyl-D-arginyl-D-alanyl-D-Argininamide,disulfide with L-cysteine)，其结构如下所示：
Figure BDA0000899008690000011
专利CN201080045024.9首度报道了该化合物，但是未见该化合物的合成工艺报道。该化合物合成的关键在于分子间二硫键的构建，常规的分子间二硫键构建一般需要先将两个肽片段进行纯化制备，然后活化其中一个巯基，纯化制备后再与另一巯基进行反应形成二硫键，最后纯化制备后得到相应的产物。但是该方法的反应步骤比较繁琐，需要进行多步纯化制备，生产成本相应较高，且最后的总收率较低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成Etelcalcetide的方法，使得所述方法无需多步纯化即能获得较高纯度和收率的粗肽产品，同时提高精肽的总收率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成Etelcalcetide的方法，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列D-Cys侧链上、D-Arg侧链上偶联有保护基，且在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端偶联有氨基树脂以及在N端乙酰化的肽树脂片段A；
步骤2、脱除肽树脂片段A中D-Cys侧链保护基，获得肽树脂片段B；
步骤3、用2,2'-二硫二吡啶活化肽树脂片段B中D-Cys侧链巯基，获得肽树脂片段C；
步骤4、N端偶联有保护基的L-Cys与肽树脂片段C在偶联体系作用下进行偶联反应构建二硫键，获得全保护肽树脂，加入裂解液脱除所有保护基以及氨基树脂获得Etelcalcetide粗肽，粗品可直接用乙醚沉淀出。
本发明以全固相方法合成全保护的Etelcalcetide的主链肽树脂，并脱除肽树脂中Cys侧链的保护基，以2,2’-二硫二吡啶活化肽树脂上D-Cys侧链的巯基(用巯基吡啶基取代氢)，再加入N端偶联有保护基的L-Cys与其偶联反应，固相形成分子间二硫键，避免了多次纯化制备步骤，且所获得的粗肽产品纯度和收率也较高。Etelcalcetide主链七肽(本发明SEQ ID NO:1所示氨基酸序列)以N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
H-D-Cys1-D-Ala2-D-Arg3-D-Arg4-D-Arg5-D-Ala6-D-Arg7-NH2
在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中，Xaa表示D型氨基酸，其中Xaa(1)＝D-Cys；Xaa(2，6)＝D-Ala；Xaa(3，4，5)＝D-Arg，括号中的数字表示SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中氨基酸编号。
其中，作为优选，步骤1为：
保护的D-Arg在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到保护的D-Arg-氨基树脂，按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端到C端的顺序，将保护的D-Ala、保护的D-Arg、N端乙酰化的保护的D-Cys与保护的D-Arg-氨基树脂进行偶联，获得肽树脂片段A。
进一步优选地，步骤1为：
步骤1.1、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-D-Arg(Pbf)-氨基树脂；
步骤1.2、脱除Fmoc保护基得到H-D-Arg(Pbf)-氨基树脂，Fmoc-D-Ala-OH在偶联体系作用下与H-D-Arg(Pbf)-氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-氨基树脂；
步骤1.3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端到C端的顺序，依次逐个将3个Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH和N-Ac-D-Cys(Mmt)-OH按照步骤1.2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到N-Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-氨基树脂，即肽树脂片段A；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述Pdf、Mmt为氨基酸侧链保护基。
作为优选，步骤2为：
肽树脂片段A中加入TFA的DCM溶液脱除肽树脂片段A中D-Cys侧链保护基，获得肽树脂片段B。所述TFA的DCM溶液中TFA的体积百分比优选为1-3％，余量为DCM。
作为优选，本发明所述方法中涉及的偶联体系为HOBt/DIC单试剂偶联体系或HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系。其中的HOBt/DIC试剂偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：HOBt/DIC为1：(1～3)；HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比优选为：HBTU:HOBt:DIPEA为1：(1～3):(1～5)，所述各保护氨基酸与偶联试剂的摩尔比优选为1:(1～5)。
作为优选，所述裂解液为TFA的水溶液；更优选地，所述裂解液中TFA体积百分比为90-99％，余量为水。
作为优选，N端偶联有保护基的L-Cys优选为Boc-L-Cys-OH。
在本发明技术方案中，所述氨基树脂为0.2-1.0mmol/g的Rink amide Resin树脂、Rink amide AM Resin树脂或Rink amide MBHA Resin树脂。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。在本技术领域，对于氨基酸侧链需要保护的基团、侧链结构以及如何偶联保护基为本领域技术人员公知。本发明中对偶联有保护基的氨基酸表示形式也是本领域常用表示形式，为本领域技术人员所熟知，如Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH，Fmoc为氨基酸N端保护基，括号里的Pbf为Arg侧链保护基，本发明其他保护氨基酸合成原料除非特殊说明均可参照此解释。特别说明的是对于Boc-L-Cys-OH保护氨基酸，Boc为其N端保护基。
本发明在固相合成中优选通过逐一偶联方式合成目的多肽片段，逐一偶联是指以第一个氨基酸为起始，剩余氨基酸按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。在偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端Fmoc保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK(即20％哌啶的DMF溶液，体积比)脱除N端保护基。由于不断有氨基酸偶联，所合成的多肽片段是不断变化的，作为优选，每个待偶联的保护氨基酸原料与之前已经合成的肽树脂片段的摩尔比为(2～10)：1，
此外，Etelcalcetide主链七肽C末端的酰胺化本发明是通过将精氨酸与氨基树脂偶联，最后裂解脱除所有保护基和树脂时，可见氨基树脂上的氨基保留进而实现酰胺化；而N末端的乙酰化可通过对半胱氨酸的N端进行乙酰化，使其作为N端进行液相合成，也可采用市售的乙酰化半胱氨酸进行合成。
本发明在获得Etelcalcetide粗肽后还可进行RP-HPLC纯化：所述RP-HPLC纯化具体为：
得到的Etelcalcetide粗肽，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色精肽。
由本发明所述方法合成的Etelcalcetide粗肽无需进行多次纯化，所得纯度为80％-90％、收率在95％以上；同时经RP-HPLC纯化后检测，精肽纯度大于98％，总收率为45-60％。
由以上技术方案可知，本发明采用固相合成的策略，先合成Etelcalcetide主链肽树脂，再脱除肽链中D-Cys的侧链保护基，而后以2,2’-二硫二吡啶活化肽树脂上D-Cys侧链的巯基并与L-Cys构建二硫键，经裂解得到Etelcalcetide粗肽，整个过程不用经过多场纯化，所获粗肽收率和纯度较高，且纯化后精肽的总收率大幅提高。
具体实施方式
本发明公开了一种合成Etelcalcetide的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1 英文缩写释义
Figure BDA0000899008690000051
Figure BDA0000899008690000061
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：N-Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin的合成
称取替代度为0.20mmol/g的Rink-Amide树脂25.00克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取16.30克(25mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时，下同)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取7.80克(25mmol)Fmoc-D-Ala-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联后续的氨基酸，偶联结束，树脂收缩抽干，得到35.50克肽树脂片段A：N-Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin，树脂增重率97.5％。
实施例2：N-Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin的合成
称取替代度为0.45mmol/g的Rink-Amide树脂11.10克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取16.30克(25mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取7.80克(25mmol)Fmoc-D-Ala-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联后续的氨基酸，偶联结束，树脂收缩抽干，得到21.40克肽树脂片段A，树脂增重率95.7％。
实施例3：N-Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin的合成
称取替代度为0.60mmol/g的Rink-Amide树脂8.33克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取16.30克(25mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取7.80克(25mmol)Fmoc-D-Ala-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联后续的氨基酸，偶联结束，树脂收缩抽干，得到18.40克肽树脂片段A，树脂增重率94.3％。
实施例4：Mmt保护基的脱除
将实施例1中得到的10g肽树脂片段A加入到反应柱中，加入DMF溶胀30min，抽掉DMF，加入DMF洗涤两次，再加入DCM洗涤两次；加入100ml 2％TFA/DCM溶液反应2min，抽掉溶液，然后再加入100ml 1％TFA/DCM溶液反应2min，重复该操作15次，树脂用100ml DCM洗3遍，再用DMF洗3遍。树脂收缩抽干，得到9.85克肽树脂片段B：N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin
实施例5：Mmt保护基的脱除
将实施例2中得到的10g肽树脂片段A加入到反应柱中，加入DMF溶胀30min，抽掉DMF，加入DMF洗涤两次，再加入DCM洗涤两次；加入100ml 2％TFA/DCM溶液反应2min，抽掉溶液，然后再加入100ml 2％TFA/DCM溶液反应2min，重复该操作15次，树脂用100ml DCM洗3遍，再用DMF洗3遍。树脂收缩抽干，得到9.80克肽树脂片段B：N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin
实施例6：Mmt保护基的脱除
将实施例3中得到的10g肽树脂片段A加入到反应柱中，加入DMF溶胀30min，抽掉DMF，加入DMF洗涤两次，再加入DCM洗涤两次；加入100ml 3％TFA/DCM溶液反应2min，抽掉溶液，然后再加入100ml 2％TFA/DCM溶液反应2min，重复该操作15次，树脂用100ml DCM洗3遍，再用DMF洗3遍。树脂收缩抽干，得到9.82克肽树脂片段B：N-Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin
实施例7：肽树脂片段B活化
称取7.7g 2,2'-二硫二吡啶，溶于100ml DMF中，将实施例4的9.85g肽树脂片段B缓慢加入反应液中，搅拌反应2小时，抽干反应液，树脂用DMF洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到9.70克Cys侧链巯基活化的肽树脂片段C：N-Ac-D-Cys(SPyridine)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin。
实施例8：肽树脂片段B活化
称取15.4g 2,2'-二硫二吡啶，溶于100ml DMF中，将实施例5的9.80g肽树脂B缓慢加入反应液中，搅拌反应2小时，抽干反应液，树脂用DMF洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到9.60克Cys侧链巯基活化的肽树脂片段C：N-Ac-D-Cys(SPyridine)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin。
实施例9：肽树脂片段B活化
称取30.8g 2,2'-二硫二吡啶，溶于100ml DMF中，将实施例6的9.82g肽树脂B缓慢加入反应液中，搅拌反应2小时，抽干反应液，树脂用DMF洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到9.95克Cys侧链巯基活化的肽树脂片段C：N-Ac-D-Cys(SPyridine)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin。
实施例10：Boc-L-Cys-OH偶联
将实施例7得到的9.70g已活化Cys侧链巯基的肽树脂片段C加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀30分钟。加入3.12gBoc-L-Cys-OH，1.0ml DIPEA室温反应3小时。偶联结束，抽干反应液，用DMF洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到全保护肽树脂10.21克。
实施例11：Boc-L-Cys-OH偶联
将实施例8得到的9.60g已活化Cys侧链巯基的肽树脂片段C加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀30分钟。加入6.24gBoc-L-Cys-OH，1.0ml DIPEA室温反应3小时。偶联结束，抽干反应液，用DMF洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到全保护肽树脂11.12克。
实施例12：Boc-L-Cys-OH偶联
将实施例9得到的9.95g已活化Cys侧链巯基的肽树脂片段C加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀30分钟。加入9.36gBoc-L-Cys-OH，1.0ml DIPEA室温反应3小时。偶联结束，抽干反应液，用DMF洗涤6遍，树脂收缩抽干，得到全保护肽树脂12.20克。
实施例13：粗产品裂解
将实施例10得到的肽树脂10.21g加入到圆底烧瓶中，用三氟乙酸：H2O(90:10)102ml，室温振荡2小时，过滤，裂解液加入无水乙醚中，得到黄色固体1.42g，粗肽纯度81.5％，粗肽收率为96.20％。
实施例14：粗产品裂解
将实施例11得到的肽树脂11.12g加入到圆底烧瓶中，用三氟乙酸：H2O(95:5)112ml，室温振荡2小时，过滤，裂解液加入无水乙醚中，得到黄色固体2.40g，粗肽纯度80.8％，粗肽收率为98.01％。
实施例15：粗产品裂解
将实施例12得到的肽树脂11.80g加入到圆底烧瓶中，用三氟乙酸：H2O(97.5:2.5)122ml，室温振荡2小时，过滤，裂解液加入无水乙醚中，得到黄色固体2.71g，粗肽纯度81.0％，粗肽收率为95.16％。
实施例16：粗肽的纯化
取实施例13制备得到的Etelcalcetide粗肽1.42g，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色精肽固体0.85g，纯化收率为59.86％，质谱信号为1048.5。HPLC纯度98.50％，总收率57.81％。
实施例17：粗肽的纯化
取实施例14制备得到的Etelcalcetide粗肽1.50g，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色精肽固体0.78g，收率为53.06％，质谱信号为1048.4。HPLC纯度98.50％，总收率52.0％。
实施例18：粗肽的纯化
取实施例15制备得到的Etelcalcetide粗肽1.50g，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色精肽固体0.80g，收率为53.33％，质谱信号为1048.5。HPLC纯度98.50％，总收率49.48％。
实施例19：常规方法合成Etelcalcetide
1、N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin的合成
称取替代度为0.20mmol/g的Rink-Amide树脂25.00克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取16.30克(25mmol)Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时，下同)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入20％哌啶/DMF(V/V)溶液5+10分钟脱除Fmoc，脱除完毕用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取7.80克(25mmol)Fmoc-D-Ala-OH，4.05克(30mmol)HOBt，9.51克(25mmol)HBTU，用75ml DMF和75ml DCM溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联后续的氨基酸，偶联结束，树脂收缩抽干，得到34.80克肽树脂片段A：N-Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink-Amide Resin。
2、主链粗肽裂解
将得到的肽树脂10g加入到圆底烧瓶中，用三氟乙酸：H2O(95:5)102ml，室温振荡2小时，过滤，裂解液加入无水乙醚中，得到黄色固体1.40g，粗肽收率为95.24％，粗肽纯度85.2％。
3、主链粗肽纯化
主链粗肽采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色精肽固体0.82g。
4、主链Cys侧链巯基活化
称取7.7g 2,2'-二硫二吡啶，溶于50ml甲醇/水(3/1)中，将0.82g主链精肽溶于10ml水中，缓慢滴加到2,2'-二硫二吡啶溶液中，搅拌反应30分钟，用HPLC监控反应情况。反应完全后，活化中间体采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩。
5、侧链Cys修饰
称取0.242g H-Cys-OH，溶于20ml水中，缓慢滴加到上述已活化的主链精肽溶液中，搅拌反应1小时，用HPLC监控反应情况。
6、粗肽的纯化
将上述制备得到的Etelcalcetide粗肽，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色精肽固体0.46g，HPLC纯度98.50％，质谱信号为1048.3。总收率为30.53％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0000899008740000011

Claims (10)

1.一种合成Etelcalcetide的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列D-Cys侧链上、D-Arg侧链上偶联有保护基，且在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端偶联有氨基树脂以及在N端乙酰化的肽树脂片段A；
步骤2、脱除肽树脂片段A中D-Cys侧链保护基，获得肽树脂片段B；
步骤3、用2,2'-二硫二吡啶活化肽树脂片段B中D-Cys侧链巯基，获得肽树脂片段C；
步骤4、N端偶联有保护基的L-Cys与肽树脂片段C在偶联体系作用下进行偶联反应构建二硫键，获得全保护肽树脂，加入裂解液脱除所有保护基以及氨基树脂获得Etelcalcetide粗肽。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：
保护的D-Arg在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到保护的D-Arg-氨基树脂，按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，将保护的D-Ala、保护的D-Arg、N端乙酰化的保护的D-Cys与保护的D-Arg-氨基树脂进行偶联，获得肽树脂片段A。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1为：
步骤1.1、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-D-Arg(Pbf)-氨基树脂；
步骤1.2、脱除Fmoc保护基得到H-D-Arg(Pbf)-氨基树脂，Fmoc-D-Ala-OH在偶联体系作用下与H-D-Arg(Pbf)-氨基树脂进行偶联反应得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-氨基树脂；
步骤1.3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将3个Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH和N-Ac-D-Cys(Mmt)-OH按照步骤1.2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到N-Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-氨基树脂，即肽树脂片段A；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述Pdf、Mmt为氨基酸侧链保护基。
4.根据权利要求1-3任意一项所述方法，其特征在于，所述氨基树脂为0.2-1.0mmol/g的Rink amide Resin树脂、Rink amide AM Resin树脂或Rink amide MBHA Resin树脂。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：
肽树脂片段A中加入TFA的DCM溶液脱除肽树脂片段A中D-Cys侧链保护基，获得肽树脂片段B。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述TFA的DCM溶液中TFA的体积百分比为1-3％，余量为DCM。
7.根据权利要求1-3任意一项所述方法，其特征在于，所述偶联体系为HOBt/DIC双试剂偶联体系或HBTU/HOBt/DIPEA三试剂偶联体系。
8.根据权利要求1-3任意一项所述方法，其特征在于，所述偶联反应以DCM、DMF中的一种或两种为溶剂。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述裂解液为TFA的水溶液。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述裂解液中TFA体积百分比为95-99％，余量为水。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201915009A (zh) * 2017-10-03 2019-04-16 中化合成生技股份有限公司 合成依特卡肽（Ｅｔｅｌｃａｌｃｅｔｉｄｅ）或其鹽類之方法
CN109311941B (zh) * 2017-12-14 2021-09-07 深圳市健元医药科技有限公司 一种合成利那洛肽的方法
CN110054662B (zh) * 2018-01-18 2021-03-02 成都圣诺生物制药有限公司 一种固相合成Etelcalcetide的方法
CN110498835B (zh) * 2018-05-17 2021-06-08 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成etelcalcetide的方法
CN109280078B (zh) * 2018-10-30 2019-06-25 成都诺和晟泰生物科技有限公司 一种制备维拉卡肽的方法
CN109734778A (zh) * 2019-03-07 2019-05-10 苏州科技大学 一种维拉卡肽的制备方法
CN112175042B (zh) * 2019-07-03 2022-05-31 深圳翰宇药业股份有限公司 Etelcalcetide的合成方法
CN112521450A (zh) * 2019-09-19 2021-03-19 深圳市健翔生物制药有限公司 一种固液相结合制备维拉卡肽的方法
CN110668984B (zh) * 2019-12-03 2020-04-10 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 一种依特卡肽中间体及依特卡肽的合成方法
CN114524860A (zh) * 2021-12-29 2022-05-24 深圳翰宇药业股份有限公司 一种Etelcalcetide的合成方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875655A (zh) * 2012-09-29 2013-01-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成利那洛肽的方法
CN102875665A (zh) * 2012-09-28 2013-01-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成利拉鲁肽的方法
CN103497245A (zh) * 2013-06-25 2014-01-08 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成胸腺法新的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3192520T3 (pl) 2009-07-29 2019-08-30 Kai Pharmaceuticals, Inc. Środki lecznicze do zmniejszania poziomów parathormonu
AU2012335009B2 (en) * 2011-11-10 2017-08-31 Kai Pharmaceuticals, Inc. Calcimimetics and methods for their use
CN103012563A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 南京工业大学 抗菌肽依色格南的固相合成方法
US9364490B2 (en) * 2013-03-15 2016-06-14 Laboratoris Sanifit, S.L. Use of derivatives containing C—O—P bonds in patients with kidney failure
CA2916222C (en) 2013-06-28 2021-05-18 Amgen Inc. Stable liquid formulation of amg 416 (etelcalcetide)
DK3126373T3 (da) 2014-04-03 2020-05-04 Amgen Inc Fremgangsmåde til fremstilling af amg 416
CN105504012A (zh) * 2014-09-30 2016-04-20 深圳翰宇药业股份有限公司 一种多肽的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102875665A (zh) * 2012-09-28 2013-01-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成利拉鲁肽的方法
CN102875655A (zh) * 2012-09-29 2013-01-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成利那洛肽的方法
CN103497245A (zh) * 2013-06-25 2014-01-08 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成胸腺法新的方法

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