CN103467573B

CN103467573B - 一种卡贝缩宫素的制备方法

Info

Publication number: CN103467573B
Application number: CN201310392663.8A
Authority: CN
Inventors: 肖庆; 潘俊锋; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-09-02
Filing date: 2013-09-02
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2033-09-02
Also published as: CN103467573A

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。所述方法包括以下步骤：1）采用Fmoc固相合成法，在氨基树脂上依次进行偶联，得到结构式如下的线型肽树脂A：其中X为Cl、Br或I；Y为Cl、Br或I；2）向所述线型肽树脂A加入Na₂S溶液进行环化反应得到肽树脂B；3）裂解所述肽树脂B得到卡贝缩宫素粗品。本发明的方法避免了使用巯基保护氨基酸所带来例如原料昂贵、需重金属试剂等工艺问题，并且本发明的方法成本低、不产生大量废液、反应条件温和且有利于大规模生产。

Description

一种卡贝缩宫素的制备方法

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。

背景技术

卡贝缩宫素（Carbetocin）是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。

卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。

卡贝缩宫素的分子式为C₄₅H₆₉N₁₁O₁₂S，分子量为998.17。其肽序列为：

卡贝缩宫素及其类似物的制备方法早期主要是液相合成法，该方法操作复杂，不利于工业生产、应用价值不高。目前在国外申请的卡贝缩宫素合成方面的专利也不多，其中包括一家西班牙公司的专利ES2115543，该专利公开了固液相结合的合成方法，这个方法主要是：通过常规的固相多肽合成法，采用HOBt/DIC体系得到4-氯丁基-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA,然后用比例为8:1:1（v/v）的三氟乙酸／十二硫醇/H₂O裂解2小时，得到线性肽4-氯丁基-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH₂，线性肽用1：1（v/v）的乙腈和水作溶剂，用1M NaOH调pH=9，环化得到卡贝缩宫素。它所用的碱还包括LiOH，NaHCO₃，DIEA，DMAP。

捷克专利CS8605461，先用固相多肽合成法合成Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O-树脂，然后裂解得到Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH₂,再将其氢化，得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH₂，再跟4-溴丁酸反应，得到Ile-Gln-Asn-Cys(C₃H₆COOH)-Pro-Leu-Gly-NH₂，再跟X-Tyr(OMe)-OH反应，脱保护，环化得到卡贝缩宫素。

中国专利CN200910106889.0公布了一种固相制备卡贝缩宫素的方法，该方案通过固相合成法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，得到卡贝缩宫素前体肽-氨基树脂；用三苯基膦钯脱掉半胱氨酸侧链烯丙基保护基，加入有机碱，氯化锂，环化，裂解，纯化、冻干得到精卡贝缩宫素，该方法中脱侧链烯丙基保护基的试剂价格昂贵，不利于大规模生产。

中国专利CN201110151928.6公布了一种卡贝缩宫素的制备方法，其采用新型的巯基保护氨基酸Fmoc-Cys((CH₂)₃COOAll)，该方法中脱侧链烯丙基保护基的试剂价格也很昂贵，不利于大规模生产。

中国专利CN201110001400.0公布了一种多肽合成卡贝缩宫素的制备方法，该方法采用固相合成法合成线性卡贝缩宫素前体肽，然后将其液相环化，该方法中的环化需要在极稀溶剂（10^-4-10^-5mol/L）中进行，产生大量废液，同时易产生多聚物，具有环化效率不高，后续处理复杂等缺点。

中国专利CN102796178A公布了一种卡贝缩宫素的制备方法，该方法采用新型的巯基保护氨基酸Fmoc-Cys((CH₂)₃COOCH₂CH₂CN)作为原料，该原料价格昂贵，并且Fmoc-Cys((CH₂)₃COOCH₂CH₂CN)保护副反应多，不利于大规模生产。

发明内容

本发明的方法无需采用巯基保护氨基酸，因此可避免使用巯基保护氨基酸所带来的工艺问题，例如原料昂贵，需重金属试剂等。本发明的方法使用Na₂S作为环化试剂，成本较低；进行环化时Na₂S的使用浓度为10^-1-10^-2mol/L，不会产生大量的废液；同时进行环化反应的反应条件比较温和且有利于大规模生产。

本发明提供了一种卡贝缩宫素的制备方法，其包括以下步骤：

1）采用Fmoc固相合成法，在氨基树脂上依次进行偶联得到结构式如下的线型肽树脂A：

其中

X为Cl、Br或I；

Y为Cl、Br或I；

2）向所述线型肽树脂A加入Na₂S溶液进行环化反应得到肽树脂B；

3）裂解所述肽树脂B得到卡贝缩宫素粗品。

在优选实施方案中，所述方法还包括纯化所述卡贝缩宫素粗品得到卡贝缩宫素。在本发明的实施方案中，使用RP-HPLC对所述卡贝缩宫素粗品进行纯化。

在优选实施方案中，所述氨基树脂为Rink amide Resin。

在优选实施方案中，所述环化反应在20℃-40℃下进行，优选在25℃-30℃下进行。

在优选的实施方案中，进行所述环化反应的时间为8-40小时，优选为12-36小时，更优选24-30小时。

在优选的实施方案中，所述Na₂S溶液的浓度为10^-1-10^-2mol/L，优选0.08mol/L。

在优选的实施方案中，所述Na₂S溶液通过将Na₂S溶解于DMF制备。

在优选的实施方案中，所述制备方法中的步骤1）包括以下步骤：

a）采用固相合成法，使Fmoc-Gly-OH与氨基树脂经反应得到Fmoc-Gly-氨基树脂；

b）依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-A(X)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(OMe)-OH和原料D的偶联，得到线型肽树脂A；

其中，

在步骤b）中，所述Fmoc-A(X)-OH的结构式如下：

其中X为Cl、Br或I，优选为Cl或Br；

所述原料D为4-卤代丁酸，结构式如下：

其中Y为Cl、Br或I，优选为Cl或Br。

具体实施方式

本文中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。

本说明书和权利要求书所使用的缩写及英文的含义如下所示：

缩写及英文含义

Fmoc 9-芴甲氧羰基

DIC 二异丙基碳二亚胺

HOBt 1-羟基苯并三唑

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DCM 二氯甲烷

TFA 三氟乙酸

Na₂S 硫化钠

OMe 甲氧基

DIEA N,N-二异丙基乙胺

DMAP 对二甲氨基吡啶

DBLK 六氢吡啶/DMF溶液

Trt 三苯甲基

TFA 三氟乙酸

RP-HPLC 反相高效液相色谱层析

Bzl 苄基

本发明的使用的Rink amide Resin购自天津南开和成科技有限公司；原料Fmoc-A(Cl)-OH、Fmoc-A(Br)-OH均购自Alfa Aesar，其它溶剂和试剂均为普通市售品。

实施例1 制备线型肽树脂A

称取1 mmol（2g）替代度为0.50mmol/g的Rink amide Resin，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Rink amide Resin 30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将Fmoc-Gly –OH（0.8 g，3 mmol），HOBt（0.45 g，3.3 mmol），用DMF溶解后在冰浴条件下加入DIC（0.52ml，3.3mmol），然后将所得溶液加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸进行偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-A(Cl)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(OMe)-OH、4-氯丁酸的偶联，得到线型肽树脂A。

其中所述Fmoc-A(Cl)-OH的结构为：

X为氯。

实施例2制备肽树脂B

称取Na₂S（0.32g，4mmol）溶解在50ml DMF中，溶解完毕后加入实施例1中的反应柱开始环化反应。室温下反应24小时，DMF洗涤6次，最后加入甲醇洗涤3次，抽干得到3.3g肽树脂B。

实施例3制备粗品卡贝缩宫素

将实施例2中的3.3g肽树脂B加入到50ml烧瓶中，配置裂解试剂35ml（TFA:H₂O=95:5（v/v）），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2小时。反应结束后，过滤树脂，收集滤液。将所得滤液滴加至350ml乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到0.95g粗品卡贝缩宫素，HPLC纯度为72.36%。

实施例4制备卡贝缩宫素精肽

称取实施例3中的0.95g粗品卡贝缩宫素用50ml20%醋酸溶液溶解后，采用Waters2695RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到HPLC纯度大于98.5%的精肽溶液。将精肽溶液采用Waters2695RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到卡贝缩宫素精肽0.42g，HPLC纯度大于98.5%，总收率42.5%。

实施例5制备线型肽树脂A

称取1mmol（2g）替代度为0.50mmol/g的Rink amide Resin，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Rink amideResin30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将Fmoc-Gly–OH（0.8g，3mmol），HOBt（0.45g，3.3mmol），用DMF溶解后在冰浴条件下加入DIC（0.52ml，3.3mmol），将所得的溶液加入固相反应柱中，室温反应2小时（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1小时）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸进行偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-A(Br)-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr（OMe）-OH、4-溴丁酸的偶联，得到线型肽树脂A。其中所述Fmoc-A(Br)-OH的结构为：

X为Br。

实施例6制备肽树脂B

称取Na₂S（0.32g，4mmol）溶解在50ml DMF中，溶解完毕后加入实施例5中的反应柱，开始环化反应。室温下反应24小时，DMF洗涤6次，最后加入甲醇洗涤3次，抽干得到3.2g肽树脂B。

实施例7制备粗品卡贝缩宫素

将实施例6中的3.2g肽树脂B加入到50ml烧瓶中，配置裂解试剂35ml（TFA:H₂O=95:5（v/v）），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将所得滤液滴加至350ml乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到1.0g粗品卡贝缩宫素，HPLC纯度85.22%。

实施例8制备卡贝缩宫素精肽

称取实施例7中的1.0g粗品卡贝缩宫素用50ml20%醋酸溶液溶解后，采用Waters2695RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到HPLC纯度大于98.5%的精肽溶液。将精肽溶液采用Waters2695RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到卡贝缩宫素精肽0.53g，HPLC纯度大于98.5%，总收率53%。

实施例9：制备肽树脂B

在固相反应柱中制备线型肽树脂A（制备方法与实施例5完全一致）。称取Na₂S（0.32g，4mmol）溶解在50ml DMF中，溶解完毕后加入所述反应柱开始环化反应。室温下反应12小时，DMF洗涤6次，最后加入甲醇洗涤3次，抽干得到3.1g肽树脂B。

实施例10：制备粗品卡贝缩宫素

将实施例10中的3.1g肽树脂B加入到50ml烧瓶中，配置裂解试剂35ml（TFA:H₂O=95:5（v/v）），将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将所得滤液滴加至350ml乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到0.97g粗品卡贝缩宫素，HPLC纯度78.52%。

实施例11：制备卡贝缩宫素精肽

称取实施例11中的1.0g粗品卡贝缩宫素用50ml20%醋酸溶液溶解后，采用Waters2695RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到HPLC纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters2695RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.2%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到卡贝缩宫素精肽0.46g，HPLC纯度大于98.5%，总收率46.5%。

虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，所述改变或改进都落在本发明权利要求书所限定的保护范围内。

Claims

1.一种卡贝缩宫素的制备方法，其包括以下步骤：

1)采用Fmoc固相合成法，在氨基树脂上依次进行偶联，得到结构式如下的线型肽树脂A：

其中

X为Cl、Br或I；

Y为Cl、Br或I；

2)向所述线型肽树脂A加入Na₂S溶液进行环化反应得到肽树脂B；

3)裂解所述肽树脂B得到卡贝缩宫素粗品。

2.权利要求1的方法，还包括纯化所述卡贝缩宫素粗品得到卡贝缩宫素。

3.权利要求2的方法，其中使用RP-HPLC对所述卡贝缩宫素粗品进行纯化。

4.权利要求1的方法，其中所述氨基树脂为Rink amide Resin。

5.权利要求1的方法，其中所述环化反应在20℃-40℃下进行。

6.权利要求5的方法，其中所述环化反应在25℃-30℃下进行。

7.权利要求1的方法，其中进行所述环化反应的时间为8-40小时。

8.权利要求7的方法，其中进行所述环化反应的时间为12-36小时。

9.权利要求8的方法，其中进行所述环化反应的时间为24-30小时。

10.权利要求1的方法，其中所述Na₂S溶液的溶度为10^-1-10^-2mol/L。

11.权利要求10的方法，其中所述Na₂S溶液的溶度为0.08mol/L。

12.权利要求1的方法，其中所述Na₂S溶液通过将Na₂S溶于DMF制备。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述步骤1)包括：

a)采用固相合成法，使Fmoc-Gly-OH与氨基树脂经反应得到Fmoc-Gly-氨基树脂；

b)依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-A(X)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Tyr(OMe)-OH和原料D的偶联，得到线型肽树脂A；

其中，

在步骤b)中，所述Fmoc-A(X)-OH的结构式如下：

其中X为Cl、Br或I；

所述原料D为4-卤代丁酸，结构式如下：

其中Y为Cl、Br或I。

14.权利要求13的方法，其中在步骤b)中，所述Fmoc-A(X)-OH的结构式如下：

其中X为Cl或Br。

15.权利要求13的方法，其中在步骤b)中，所述原料D为4-卤代丁酸，结构式如下：

其中Y为Cl或Br。