CN104592362A - 卡贝缩宫素的合成工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明一种卡贝缩宫素的合成工艺，包括以下步骤：将Fmoc-Gly-OH与步骤一Rink Amide-AM Resin偶联反应获得Fmoc-Gly-Rink Amide-AM Resin；DBLK去保护(20%哌啶)得到H-Gly-Rink Amide-AM RFesin依次完成H-Gly-Rink Amide-AM Resin与Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH及四氯丁酸的偶联，直至合成卡贝缩宫素线性肽树脂；将裂解剂与步骤四获得的卡贝缩宫素线性肽树脂混合发生裂解反应，从而去除Rink Amide-AM Resin和侧链保护基；卡贝缩宫素线性粗肽环化成卡贝缩宫素粗品，分离纯化制得卡贝缩宫素。本发明合成工艺防止产生的聚合副反应，极大的简化工艺路线，降低了生产成本，提高了合成效率，且成品纯度高，便于规模化生产，同时有利于环保，有着显著的经济社会效益。

Description

卡贝缩宫素的合成工艺
技术领域
本发明涉及多肽药物化学合成领域，具体涉及一种卡贝缩宫素的合成工艺。
背景技术
卡贝缩宫素（Carbetocin）是一种化学合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约1个小时，因此足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素为长。卡贝缩宫素还有很好的安全性，在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰，因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
卡贝缩宫素化学名称：[丁酰-L-（4-甲基）酪氨酰-L-异亮氨酰-L-谷胺酰-L-天冬胺酰-L-半胱氨酰]-L-脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰胺（丁酸与半胱氨酸形成硫醚键）
化学结构式：[Butyry-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-NH2，分子式：C45H69N11O12S，分子量：988.16。
卡贝缩宫素结构与天然缩宫素的结构不同之处是其N-端的环状结构：天然缩宫素是通过两个半胱氨酸的侧链巯基形成二硫键成环，而卡贝缩宫素将N-末端的半胱酸用丁酸替代后与另一个半胱氨酸的侧链巯基形成硫醚键成环，因为硫醚键比二硫键更稳定，不易被酶降解，所以卡贝缩宫素比缩宫素更稳定性，生物活性更强。
目前国内注册的卡贝缩宫素有瑞典PolyPeptide Laboratories 公司的卡贝缩宫素原料药（H20070232）和加拿大辉凌制药的卡贝缩宫素注射液（商品名巧特欣），尚无国产卡贝缩宫素原料药和制剂上市。卡贝缩宫素注射液用于选择性硬膜外或腰麻下剖腹产术后,以预防子宫收缩乏力和产后出血。单剂量静脉注射100μg(1mL)卡贝缩宫素, 只有在硬膜外或腰下剖腹产术完成婴儿娩出后, 缓慢地在1分钟内一次性给予。卡贝缩宫素可以在胎盘娩出前或娩出后给予。
由于卡贝缩宫素的化学结构独特，导致其合成难度大。目前报道的卡贝缩宫素合成方法收率低或采用的试剂昂贵，生产成本高。
发明内容
本发明的目的是提供一种卡贝缩宫素的合成工艺，该卡贝缩宫素的合成工艺每步氨基酸缩合率能达到99.5%以上，线性粗肽的纯度可达到90%左右，成品纯度可达达到99.0%以上，最终产品的总收率超过35%，且防止产生的聚合副反应，极大的简化工艺路线，降低了生产成本，提高了合成效率，且成品纯度高，便于规模化生产，同时有利于环保，有着显著的经济社会效益。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、以AM Resin为起始载体，在缩合试1-羟基苯并三唑（HOBT）和N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）的作用下，偶联Rink Amide-AM Linker，制得Rink Amide-AM Resin，此Rink Amide-AM Resin替代度为sub=0.7~0.8 mmol/g；
步骤二、采用固相多肽逐步缩合法，根据肽序从C端至N端，首先将Fmoc-Gly-OH与步骤一Rink Amide-AM Resin偶联反应获得Fmoc-Gly-Rink Amide-AM Resin；
步骤三、去除步骤二Fmoc-Gly-Rink Amide-AM Resin的保护基Fmoc，从而获得H-Gly-Rink Amide-AM Resin；
步骤四、采用固相多肽逐步缩合法逐步依次完成H-Gly-Rink Amide-AM Resin与Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH的偶联，甲醇收缩合成卡贝缩宫素的前体肽Fmoc-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-AM Resin；
步骤五、DBLK（20%哌啶/DMF混合溶液）去除卡贝缩宫素的前体肽中保护基Fmoc得到H-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-AM Resin 茚三酮检测显阳性，将四氯丁酸/HOBT按摩尔量的3倍称量好加入去完保护的前体肽H-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-AM Resin中加入适当的DMF使其搅拌均与反应1~2h 茚三酮检测显阴性，抽掉反应液加入适当甲醇使其搅拌均匀，抽掉甲醇真空抽干树脂直至合成卡贝缩宫素线性肽树脂；
步骤六、将裂解剂与步骤五获得的卡贝缩宫素线性肽树脂混合发生裂解反应，从而去除Rink Amide-AM Resin和卡贝缩宫素侧链保护基，再依次通过沉降、离心、洗涤、干燥获得卡贝缩宫素线性粗肽；
步骤七、将步骤五获得干燥后的卡贝缩宫素线性粗肽研磨至成粉末状，用二甲基亚砜（DMSO）溶解卡贝缩宫素粗肽至浓度为1mmol/20ml，从而获得卡贝缩宫素线性粗肽溶液；
步骤八、向所述卡贝缩宫素线性粗肽溶液中滴加30%的稀氨水饱和碳酸钾（K2CO3）调节卡贝缩宫素线性粗肽溶液pH至9~10，并将温度调至50~60摄氏度，当pH至9~10、温度调至50~60摄氏度时，立刻向环化溶液中加入0.2g/mmol的三-（2-羧乙基）-膦盐酸盐（TCEP），环化时间为1~2h；
步骤九、将步骤八环化1-2h后环化完全的卡贝缩宫素粗品经过C18反相高效液相色谱柱分离纯化，旋蒸冻干后，制得卡贝缩宫素。
上述技术方案进一步改进的技术方案如下：
1. 上述方案中，所述Rink Amide-AM linker与AM Resin的投料比值为1.2~1.6：1，缩合时间为8~10h。
2. 上述方案中，所述步骤二和步骤四中采用1-羟基苯并三唑（HOBT）和N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）作为缩合剂，Rink Amide AM-Linker：N,N'-二异丙基碳二亚胺：1-羟基苯并三唑为1：1.0~1.2：1.0~1.2。
3. 上述方案中，所述AM Resin起始替代度为1.65~1.75mmol/g。
4. 上述方案中，步骤六中的所述裂解剂为TFA：EDT：TIS：间甲酚按照92.5：2.5：2.5：2.5体积比混合而成，或者为TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚按照90：5：3：2体积比混合而成。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明卡贝缩宫素的合成工艺，其在偶联过程中，每步氨基酸缩合率能达到99.5%以上，线性粗肽的纯度可达到90%左右，成品纯度可达达到99.0%以上，最终产品的总收率超过35%，工艺操作简便、工序短，对设备及人员操作要求低，有利于环保，而且容易实现规模化生产，环化效果佳，速度快，极大程度简化了工艺，提高了生产效率，且整个生产的过程采用的原料及试剂常规易得，无剧毒物质，安全环保，有广泛的应用前景和较好的经济社会价值，且采用DMSO作为溶剂，加入0.2g/mmol的三-(2-羧乙基)-膦盐酸盐，解决了环化浓度不宜过高，环化体积大的问题，防止分子之间因二硫键形成而产生的聚合副反应，极大的简化工艺路线，降低了生产成本，提高了合成效率，且成品纯度高，便于规模化生产，同时有利于环保，有着显著的经济社会效益；其次，本发明中选择的为4-氯丁酸代替现有技术中的4-溴丁酸，采用4-氯丁酸的反应速度比4-溴丁酸快60%，而且反应中4-氯丁酸比4-溴丁酸产生的杂质少，确保纯度比4-溴丁酸要高，避免了4-溴丁酸的反应条件比4-氯丁酸要苛刻的不足，相对4-溴丁酸高温控温反应12h尚未反应完全，而4-氯丁酸常温1-2H 尚可反应完全，大大缩短了反应的时间。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：一种卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、称取588.2g（合成规模1000mmol）的AM Resin（1.70mmol/g）倒入反应釜中，加入约5L二氯甲烷（DCM）溶涨约20min。待溶涨时间截止后，抽掉DCM；
加入已经冰浴活化好的反应液，此反应液由647.6gRink Amide AM-Linker、194.6g1-羟基苯并三唑1-羟基苯并三唑（HoBt）冰浴2min，然后再加入371mLN,N'-二异丙基碳二亚胺DIC于溶液中活化5min获得，反应8h后，取样茚三酮检测，显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，
加入5LDMF洗涤2遍，抽掉DMF后，加5L DBLK脱保护2次，时间分别是5min和15min，两次脱保护之间用5LDMF洗涤一次，时间约1min，抽掉。
待脱完保护后按照如下顺序洗涤：DMF×1次，DMF×1次，MeOH×1次，DCM×1次， DMF×1次，每次洗涤试剂用量约5L，洗涤时间为1min，洗完后抽掉。
步骤二、茚三酮检测显阳性，称取890.0g Fmoc-Gly-OH和485.0gHOBt置烧杯中，加入5LDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入560.0mLDIC于溶液中活化5min后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起。30℃反应，时间2-3h。待反应2h后，取样茚三酮检测，若显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入5LDMF洗涤2遍。
步骤三,将步骤二中反应好的中间体肽树脂Fmoc-Gly-Rink Amide-AM Resin ，加入5L DBLK(哌啶：DMF=1:4)溶液进行去保护实验，第一次加入5L去保护5min,真空将DBLK抽掉，再用5LDMF 洗涤一遍，真空抽掉后第二次加入5LDBLK 去保护15min,真空抽掉。
步骤四、上述步骤结束后加入适量DMF洗涤两次，根据固相多肽合成原理及肽序，重复上述步骤一次偶联下述氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH，4-氯丁酸。得到4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2-Rink Amide-AM Resin，合成完毕后用5LDMF洗涤两次后再用MeOH收缩两次，每次用量5L,每次10min。将肽树脂转移至真空干燥箱干燥至恒重，得到干燥的卡贝缩宫素线性肽树脂2215.4g。
步骤五、将2215.4g肽树脂缓缓加入到17.7L按（1g树脂8-10ml裂解液） 裂解液（裂解液配比为TFA/TIS/EDT/间甲酚=92.5/2.5/2.5/2.5），室温裂解2h，待裂解时间结束后，用砂芯漏斗将树脂滤掉，得到含多肽的裂解液，将其缓缓加入到预先冰冻的适量体积（10倍体积的裂解液）的冰乙醚中，会有白色的固体粗肽析出，静置30min后离心，洗涤及干燥，得到固体线性粗肽。
步骤六、将所得的线性粗肽研磨碾碎，溶解在约20LDMSO溶剂，调节卡贝缩宫素线性粗肽溶液pH至9-10将温度调至55摄氏度，环化时间为1~2h 且在环化的过程中加入200g的三-（2-羧乙基）-膦盐酸盐（TCEP）防止分子之间因二硫键形成而产生的聚合副反应；
室温搅拌数小时，借助HPLC监测搅拌1.5h时已环化完全。
步骤七、将步骤六的卡贝缩宫素粗品经过C18反相高效液相色谱柱分离纯化，旋蒸冻干后，制得卡贝缩宫素。
实施例2：一种卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：包括以下步骤：
（1）称取484.8g的AM Resin(合成规模800mmol)(1.65mmol/g)倒入反应柱中，加入4LDCM溶涨约20min。待溶涨时间截止后，抽掉DCM，加入已经冰浴活化完成的反应液（690.7g Rink Amide-AM Linker，207.4gHoBt冰浴2min,然后再加入238.0mLDIC于溶液中活化5min）待反应8h后，取样茚三酮检测，显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入4LDMF洗涤2遍，抽掉DMF后，加4LDBLK(20%哌啶/DMF溶液)脱保护2次，时间分别是5min和15min，两次脱保护之间用4LDMF洗涤一次，时间约1min,抽掉。待脱完保护后按照如下顺序洗涤：DMF×1次，DMF×1次,MeOH×1次，DCM×1次， DMF×1次，每次洗涤试剂用量约10L,洗涤时间为1min,洗完后抽掉。茚三酮检测显阳性，称取713.5g Fmoc-Gly-OH和388.8gHOBt置烧杯中，加入4LDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min,然后再加入446.0mLDIC于溶液中活化5min后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起。35℃反应，时间2-3h。待反应2h后，取样茚三酮检测，若显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入4LDMF洗涤2遍。
（2）上述步骤结束后加入适量DMF洗涤两次，根据固相多肽合成原理及肽序，重复上述步骤一次偶联下述氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH，4-氯丁酸，得到4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2-Rink Amide-AM Resin,再用5LMeOH收缩两次，每次10min。将肽树脂转移至真空干燥箱干燥至恒重，得到干燥的卡贝缩宫素线性肽树脂2058.0g。
（3）将2058.0g肽树脂缓缓加入到 16.5L 裂解液（TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚=90/5/3/2）中，室温裂解2h。待裂解时间结束后，用砂芯漏斗将树脂滤掉，得到含多肽的裂解液,将其缓缓加入到预先冰冻的适量体积的冰无水乙醚中,会有白色的固体粗肽析出，静置30min后离心，洗涤及干燥，得到固体线性粗肽。
（4）将所得的线性粗肽研磨碾碎，溶解在约16LDMSO溶剂中，用滴加30%的稀氨水饱和碳酸钾（K2CO3）调节pH值至10，室温搅拌数小时，借助HPLC监测搅拌2h时已环化完全。
步骤七、将步骤六的卡贝缩宫素粗品经过C18反相高效液相色谱柱分离纯化，旋蒸冻干后，制得卡贝缩宫素。
综上，本发明卡贝缩宫素的合成工艺，其在偶联过程中，每步氨基酸缩合率能达到99.5%以上，线性粗肽的纯度可达到90%左右，成品纯度可达达到99.0%以上，最终产品的总收率超过35%，工艺操作简便、工序短，对设备及人员操作要求低，有利于环保，而且容易实现规模化生产，环化效果佳，速度快，极大程度简化了工艺，提高了生产效率，且整个生产的过程采用的原料及试剂常规易得，无剧毒物质，安全环保，有广泛的应用前景和较好的经济社会价值，且采用DMSO作为溶剂，加入0.2g/mmol的三-(2-羧乙基)-膦盐酸盐，解决了环化浓度不宜过高，环化体积大的问题，防止分子之间因二硫键形成而产生的聚合副反应，极大的简化工艺路线，降低了生产成本，提高了合成效率，且成品纯度高，便于规模化生产，同时有利于环保，有着显著的经济社会效益；其次，本发明中选择的为4-氯丁酸代替现有技术中的4-溴丁酸，采用4-氯丁酸的反应速度比4-溴丁酸快60%，而且反应中4-氯丁酸比4-溴丁酸产生的杂质少，确保纯度比4-溴丁酸的高，避免了4-溴丁酸的反应条件比4-氯丁酸要苛刻的不足，相对4-溴丁酸高温控温反应12h尚未反应完全，而4-氯丁酸常温1-2H 尚可反应完全，大大缩短了反应的时间。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1. 一种卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、以AM Resin为起始载体，在缩合试1-羟基苯并三唑（HOBT）和N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）的作用下，偶联Rink Amide-AM Linker，制得Rink Amide-AM Resin，此Rink Amide-AM Resin替代度为sub=0.7~0.8 mmol/g；
步骤二、采用固相多肽逐步缩合法，根据肽序从C端至N端，首先将Fmoc-Gly-OH与步骤一Rink Amide-AM Resin偶联反应获得Fmoc-Gly-Rink Amide-AM Resin；
步骤三、去除步骤二Fmoc-Gly-Rink Amide-AM Resin的保护基Fmoc，从而获得H-Gly-Rink Amide-AM Resin；
步骤四、采用固相多肽逐步缩合法逐步依次完成H-Gly-Rink Amide-AM Resin与Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH的偶联，合成卡贝缩宫素的前体肽Fmoc-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-AM Resin；
步骤五、DBLK（20%哌啶/DMF混合溶液）去除卡贝缩宫素的前体肽中保护基Fmoc得到H-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-AM Resin 茚三酮检测显阳性，将四氯丁酸/HOBT按摩尔量的3倍称量好加入去完保护的前体肽H-Tyr(me)--Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-AM Resin中加入适当的DMF使其搅拌均与反应1~2h 茚三酮检测显阴性，抽掉反应液加入适当甲醇使其搅拌均匀，抽掉甲醇真空抽干树脂直至合成卡贝缩宫素线性肽树脂；
步骤六、将裂解剂与步骤五获得的卡贝缩宫素线性肽树脂混合发生裂解反应，从而去除Rink Amide-AM Resin和卡贝缩宫素侧链保护基，再依次通过沉降、离心、洗涤、干燥获得卡贝缩宫素线性粗肽；
步骤七、将步骤六获得干燥后的卡贝缩宫素线性粗肽研磨至成粉末状，用二甲基亚砜（DMSO）溶解卡贝缩宫素粗肽至浓度为1mmol/20ml，从而获得卡贝缩宫素线性粗肽溶液；
步骤八、向所述卡贝缩宫素线性粗肽溶液中滴加30%的稀氨水饱和碳酸钾（K2CO3）调节卡贝缩宫素线性粗肽溶液pH至9~10，并将温度调至50~60摄氏度，当pH至9~10、温度调至50~60摄氏度时，立刻向环化溶液中加入0.2g/mmol的三-（2-羧乙基）-膦盐酸盐（TCEP），环化时间为1~2h；
步骤九、将步骤八中的卡贝缩宫素粗品溶液经过C18反相高效液相色谱柱分离纯化，旋蒸冻干后，制得卡贝缩宫素。
2. 根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：所述Rink Amide-AM linker与AM Resin的投料比值为1.2~1.6：1，缩合时间为8~10h。
3. 根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：所述步骤二和步骤四中采用1-羟基苯并三唑（HOBT）和N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）作为缩合剂，Rink Amide AM-Linker：N,N'-二异丙基碳二亚胺：1-羟基苯并三唑为1：1.0~1.2：1.0~1.2。
4. 根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：所述AM Resin起始替代度为1.65~1.75mmol/g。
5. 根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的合成工艺，其特征在于：步骤六中的所述裂解剂为TFA：EDT：TIS：间甲酚按照92.5：2.5：2.5：2.5体积比混合而成，或者为TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚按照90：5：3：2体积比混合而成。
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