CN106084014A - 一种合成卡贝缩宫素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽合成方法，涉及一种合成卡贝缩宫素的方法，属药物合成领域。本发明技术包括如下步骤：将合成的Cl‑(CH2)3‑CO‑Tyr(Me)‑HMBA‑NH2片段以氨基酸形式连接到Fmoc‑Cys‑Pro‑Leu‑Gly‑NH2‑Rinker Amide‑AM‑Resin的半胱氨酸上,再依次接入卡贝缩宫素主链上的其它氨基酸，主链上最后一个氨基酸为Ile，在固相上选择性脱去HMBA Linker进行成环反应，最后将肽从树脂上裂解去除侧链保护基，纯化得目标产物。本发明产生废液少，污染小，纯化难度低，不易产生消旋，终产物收率高，适于工业化生产。

Description

一种合成卡贝缩宫素的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，具体涉及一种合成卡贝缩宫素的方法，属于药物合成领域。
背景技术
卡贝缩宫素（Carbetocin）商品名为巧特欣，用于选择性硬膜外或腰麻下剖腹产术后，以预防子宫收缩乏力和产后出血。卡贝缩宫素于2007年首次在加拿大上市，其临床和药理特性与天然产生的催产素类似，其与子宫平滑肌上的催产素受体结合引起子宫有节律的收缩并且可以增加已有的收缩频率，增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚分娩的子宫具有有效的收缩作用。
不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2min内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约1h，故足以预防刚分娩后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比缩宫素长。国内研究也表明卡贝缩宫素比报道的缩宫素单次肌注后持续时间长4倍，足以预防刚分娩后的产后出血。在产后的早期给予卡贝缩宫素可以促进子宫的恢复。
卡贝缩宫素的结构式为：
现有的卡贝缩宫素的合成方法主要有固液结合合成法、固相合成法两种。专利ES2115543和CS8605461公开了固液结合法合成卡贝缩宫素，该方法主要特点是先在固相上合成多肽的部分片断，然后将多肽片断从树脂上裂解，再在液相中连接上剩余的氨基酸，然后液相环化得到卡贝缩宫素。固液结合合成多肽的方法，因为有一步或多步反应在液相中进行，操作复杂，液相中多肽的合成需要的反应体系中溶剂比例大，成为其放大生产的主要限制因素。目前多肽的合成主以固相合成为主，中国专利200910106889.0公开了一种采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成方法，以氨基树脂为载体，采取逐步合成法，最后合成四溴丁酸，然后从树脂上切割纯化，再液相环化为卡贝缩宫素。这样固相上逐步连接氨基酸，反应步骤多，增加了发生旋光的几率 ，且线性肽上最末端的四溴丁酸活性高，其-COOH与Tyr上的NH2-定向缩合反应难度大，线性肽的收率及纯度低；液相环化，产生的废液多，增加了纯化的难度，收率也不高。中国专利201110001400.0公开了多肽合成卡贝缩宫素的制备方法，该发明通过将Cys采用Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOR)-OH，逐步固相合成，最后一个氨基酸为Fmoc-Tyr（Me）-OH，得到保护的九肽树脂后，脱掉Tyr的保护基，然后用切肽试剂将直链肽从树脂上裂解并同时脱掉肽链上的其它保护基，液相环化得到卡贝缩宫素。此方法树脂和肽链上的取代基同时在裸露，降低了(CH2)3COOH中羧基与Tyr氨基的选择性，且选择在液相中环化，需要比专利200910106889.0更大量的溶剂，废液多，产率低。而且Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOR)-OH为不常见氨基酸，需要订做，极大的增加了合成的成本。因此，现有的卡贝缩宫素的合成方法存在合成路线长，步骤多，合成路线易产生旋光，耗时长，成本高，收率不高等问题，而且有的合成过程中个别氨基酸的官能团保护基相互干扰，极大的增加了官能团保护基的反应选择性。
针对以上不足，本发明提供了一种合成卡贝缩宫素的方法，先合成Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2三肽的片段，将其连接到固相合成的肽链的半胱氨酸巯基上，再依次接入卡贝缩宫素主链上的其它氨基酸，主链上最后一个氨基酸为Ile，在固相上选择性的水解掉Tyr(Me)的 HBMA Linker, 然后固相环化，最后裂解掉树脂及其余氨基酸残基上的保护基得卡贝缩宫素，离心，封干后，直接纯化。本发明产生的废液少，环境污染小，降低了纯化难度，不易产生消旋，反应的选择性高，终产物收率高，原料廉价易得、合成难度低，适合于工业化生产。
发明内容
本发明提供了一种合成卡贝缩宫素的方法。本发明使用的缩写具有如下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
HOBt:1-羟基苯骈三唑 DIC:N,N-二异丙基碳二亚胺
DMF:N,N-二甲基甲酰胺 TFA:三氟乙酸
PyBop：六氟磷酸苯并三唑－１－基氧基三吡咯烷基磷
Leu：亮氨酸 Ile：异亮氨酸 Cys：半光氨酸
Gly：甘氨酸 Pro：脯氨酸
Asn：天冬酰胺 Gln：谷氨酰胺 Tyr：酪氨酸
Me：甲基
DMF：N，N-二甲基甲酰胺 Piperdine：六氢吡啶
Fmoc-Rink-AM Resin：芴甲氧羰基氨甲基树脂
TFA：三氟乙酸 HAC：醋酸
PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷
Trt：2-氯三苯基DCM: 二氯甲烷TIS：三异丙基硅烷
DIE(P)A：N，N-二异丙基乙胺HMBA Linker :对羟甲基苯甲酸
ClCH2CH2CH2COOH：四氯丁酸DBLK: 哌啶（20%的六氢吡啶）
DMAP：4-二甲氨基吡啶
本发明采用如下技术方案：一种合成卡贝缩宫素的方法，其步骤为：
1)先以Rinker Amide-AM-Resin为载体固相逐步合成片段Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2-Rinker Amide-AM-Resin,然后将此肽树脂裂解，离心，风干，纯化后冻干后得到Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2，备用。
2)以Rinker Amide-AM-Resin为载体固相逐步合成Fmoc-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin,将Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2片段整体以氨基酸的形式连接到半胱氨酸巯基上，得到Fmoc-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin,然后逐步接入其余氨基酸得到NH2-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin。
3)在固相上，用NaOH调节PH值为10左右，脱去HMBA Linker,得到NH2-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-OH）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin。
4)在固相树脂上成环得到然后对其树脂及其余氨基上的保护基进行裂解，过滤取滤液、沉降、离心取下层固体，真空干燥得粗肽，再经过制备型高效液相色谱分离纯化后，冷冻干燥得卡贝缩宫素纯品。将纯品进行检测，纯度为98%以上，终产品收率40%-50%。
本发明的有益效果在于所用的原料廉价易得，树脂用Rink-Amide-AM-Resin 、初始氨基酸为Fmoc-Gly-OH，采用哌啶 试剂脱保护和NaOH水解,然后环化 ，避免使用昂贵难获取的Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOR)-OH。本发明主链的合成只有七步，而且由于主链合成步骤偏少，也极大的减少了目标产物合成过程中发生旋光的几率，提高了产品的质量；本发明的肽链合成及环化均在固相上进行，极大的减少了溶液的体积，废液少；本发明经过精心的设计关键步骤反应的选择性高，从而提高了产品的收率，减轻了后期纯化的难度，适合大规模工业生产。
附图说明
图1 为本发明的简要工艺流程图
具体实施方式
实施例一：
1.制备HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂
取出Rink-Amide-AM-resin树脂，放入固相反应柱里面，用DMF洗涤一次，然后用DCM溶胀20分钟左右，抽去DCM；加入用DMF溶解好的4倍量的HMBA linker、HOBt、 DIC，耦合反应2个小时，凯瑟试剂检测，若无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，重复耦合过程，直至反应完全为止。然后用DMF洗涤四次。
2.制备Fmoc-Tyr(Me)- HMBA-Rink-Amide-AM-resin树脂
在步骤1的固相反应柱里面加入用DMF混合好的Fmoc-Tyr(Me)-OH、HOBt、DMAP、DIC，他们和树脂的摩尔比是（3/3/0.3/3.6）：1，反应5个小时以上，然后用DMF洗四遍，加入20-30倍量的醋酸酐和吡啶混合液（比例为2:1），封闭过夜，或者封闭10个小时以上，用DMF，DCM交替洗涤6次，用甲醇收缩树脂，每次五分钟，真空抽干树脂。
3. Fmoc-Tyr(Me)- HMBA-Rink-Amide-AM-resin替代度的测量
取5-10mg步骤2中得到的树脂，放入1.5mL的EP管中，加入1mL的DBLK，震荡20-30min。静置取上清液，准备2个10mL的小定量瓶，一个作为空白里面加入100ul的DBLK，另一个加入100ul的上清液，分别加入DMF定量到10mL，摇匀。用紫外分光光度计在波长为290nm处检测，读取数值。根据公式，算出替代度。公式为：51*测出数值/（5.8*称取树脂量）。
4.Cl(CH2)CO-Tyr(Me)- HMBA-Rink-Amide-AM-resin的合成
根据要合成的规模，称取相应质量步骤2中制备好的树脂（合成的摩尔数=树脂的质量*树脂替代度）。放入固相反应柱里面，用DMF洗涤一次，然后用DCM溶胀20分钟左右，抽去DCM，加入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Cl(CH2)COOH、HOBt、DIC的混合DMF溶液，耦合反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后DMF，DCM交替洗涤6次，然后用甲醇收缩树脂，每次五分钟，真空抽干树脂。
5.将树脂干燥后，称重，按1:10的树脂和裂解液的比例。裂解树脂，裂解液的配比为（TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT=90:5:2:3），裂解时间2个小时左右。裂解结束后，用砂芯漏斗过滤，留下滤液，将滤液在甲基叔丁醚中沉降，然后离心，真空干燥，得到粗肽。得到Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2粗肽。
6.高相液相制备Cl(CH2)CO-Tyr(Me)- HMBA-NH2方法
制备液相使用前的准备：A相为上述制备水溶液，B相为上述制备乙腈溶液，选择C18直径50MM的DAC制备柱，流速为40ML/MIN。柱温为25度,波长220nm，将上述环化过滤后粗肽500ml泵入液相进行制备，制备梯度为时间0-7-50(MIN)，浓度为5-29-39（B%）,出峰时间为15-20MIN，出峰是B%浓度为25%时,收峰高>150MV为三肽纯品，纯度99.2%，Cl(CH2)CO-Tyr(Me)- HMBA-NH2回收率80%以上。
7.制备Fmoc-Gly-Rink-Amide-AM-resin树脂
取出Rink-Amide-AM-resin树脂，放入玻璃多肽反应柱里面，用DMF洗涤一次，然后用DCM溶胀20分钟左右，抽去DCM；加入用DMF溶解好的4倍量的Fmoc-Gly-OH、HOBt、 DIC，耦合反应2个小时，凯瑟试剂检测，若无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，重复耦合过程，直至反应完全为止。然后用DMF洗涤四次。
8.制备Fmoc-Leu-Gly-Rink-Amide-AM-resin树脂
在步骤7后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Leu-OH，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
9.制备Fmoc-Pro-Leu-Gly-Rink-Amide-AM-resin树脂
在步骤8后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Pro-OH，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
10.制备Fmoc-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink-Amide-AM-resin树脂
在步骤9后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Cys-OH，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
11.制备Fmoc-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2）-Pro-Leu-Gly-NH2-RinkerAmide-AM-Resin树脂
在步骤10后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
12制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin树脂
在步骤11后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Asn(Trt)-OH，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
13.制备Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin树脂
在步骤12后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Gln(Trt)-OH，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
14制备Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin树脂
在步骤13后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次，加入4倍量的Fmoc-Ile-OH，HOBt,DIC,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后用DMF洗涤三次。
15.制备NH2-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-OH）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin树脂
在步骤14后，入DBLK，进行脱保护（脱去临时保护基Fmoc），分别用DBLK脱除两次，时间是10+15分钟，中间用DMF洗涤一次。第二次脱保护结束后，用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次。然后用NaOH调节PH将DMF和水的混合液调到PH=10左右，氮气吹拂2小时左右。这样就水解掉了HMBA-Linker抽干，得到NH2-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys（CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-OH）-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker Amide-AM-Resin。然后用DMF，DCM分别交替洗涤树脂五次。
16的制备
在步骤14后，加入4倍量的PYBOP，HOBt,DIEA,的混合DMF溶液，反应2小时后，凯瑟试剂检测，诺无色，表示反应完全，若还有颜色，则表示没有反应完全，应延长反应时间，或者重复上面的方法进行重复耦合，直至印鉴无色为止。然后DMF，DCM交替洗涤6次，然后用甲醇收缩树脂，每次五分钟，真空抽干树脂。
17 粗肽的制备
将树脂干燥后，称重，按1:10的树脂和裂解液的比例。裂解树脂，裂解液的配比为（TFA：TIS：H2O：间甲酚=90:2.5:2.5:2.5），裂解时间2个小时左右。裂解结束后，用砂芯漏斗过滤，留下滤液，将滤液在甲基叔丁醚中沉降，然后离心，真空干燥，得到粗肽。
18.精肽的制备。
将粗肽称量，放入水中，溶解过滤。
制备液相使用前的准备：A相为上述制备水溶液，B相为上述制备乙腈溶液，选择C18直径30MM*柱长250 MM制备柱，流速为25ML/MIN.柱温为25度。
）将上述环化过滤后粗肽100ML(即为100MG)打入液相进行制备，制备梯度为时间0-7-50(MIN)，浓度为5-30-38（B%）,
）出峰时间为25MIN,出峰是B%浓度为35%。收峰高为>100MV为卡贝缩宫素纯品。纯度在98.7%，回收率43%。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1) 由Fmoc-Tyr(Me)-OH 和Rink-Amide-AM-Resin树脂反应，再与四氯丁酸反应后从树脂上裂解得到Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2；
(2) 在氨基树脂上通过固相合成法依次连接氨基具有Fmoc保护基团的氨基酸，得到Fmoc-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker-Amide-AM-Resin；
(3) 将步骤（1）的Cl-(CH2)3-CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2连接到步骤（2）Fmoc-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2-Rinker-Amide-AM-Resin的Cys巯基上得到Fmoc-Cys(CH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-HMBA-NH2)-Pro-Leu-Gly- NH2-Rinker Amide-AM-Resin；
(4) 在步骤（3）得到的产物的Cys上依次接入Asn(Trt)、Gln(Trt)、Ile氨基酸，得产物；
(5) 将步骤（4）得到的产物水解去掉Tyr上的HMBA，脱去Ile的Fmoc保护基，成环反应后，从树脂上裂解得到目标产物卡贝缩宫素。
2.根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的合成方法，其特征在于在步骤（1）的载体树脂（Rink-Amide-AM-Resin）上连接对羟甲基苯甲酸基因，再与Fmoc-Tyr(Me)-OH和四氯丁酸反应；步骤（1）中Rink-Amide-AM-Resin树脂的替代度 为0.5mmol/g~0.75mmol/g。
3.根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的合成方法，其特征在于步骤（5）脱去Ile上Fmoc的条件是加入DBLK溶液洗脱，DBLK溶液是由20%的六氢吡啶和DMF组成。
4.根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的合成方法，其特征在于步骤（5）中成环反应的条件是先用DMF/DCM交替洗涤3-6次后，加入PyBop/HOBt/DIPEA进行成环反应。
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