CN106854235B - 一种固相片段法合成卡贝缩宫素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种卡贝缩宫素的固相片段制备方法，其包括以下步骤：1)以固相合成树脂为载体依次连接氨基和侧链经过保护的脯氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、酪氨酸得到线性六肽片段树脂；2)脱除末端氨基保护后，连接4‑氯丁酸；3)脱除半胱氨酸巯基保护基；4)在碱性条件下，在缩合剂作用下，末端氯基团与半胱氨酸侧链巯基偶联成环，得到环七肽片段树脂；5)裂解环七肽片段树脂；6)以固相合成树脂为载体依次连接氨基经过保护的甘氨酸和亮氨酸；7)将步骤5)所得环七肽片段连接到二肽树脂上，得到卡贝缩宫素肽树脂；8)裂解得到卡贝缩宫素。本申请选择Pro‑Leu之间的位点，所得的卡贝缩宫素纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种环肽的制备方法，具体涉及卡贝缩宫素的固相合成方法。
背景技术
卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。
卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
研究表明，当硬膜外或腰麻下剖腹产术后立即单剂量静脉给予卡贝缩宫素100ug，在预防子宫张力不足和减少产后出血方面，卡贝缩宫素明显优于安慰剂。在产后的早期给予卡贝缩宫素也可以促进子宫的复旧。
卡贝缩宫素具有以下结构：
用氨基酸缩写表示为：
卡贝缩宫素及其类似物的制备方法早期主要是液相合成工艺，操作复杂，不利于工业生产、应用价值不高；目前在国外卡贝缩宫素申报的专利合成方面的也不多，其中包括一家西班牙公司的ES2115543，是固液相结合的合成方法，主要方法是：用常规固相多肽合成，采用HOBt/DIC体系得到4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA,然后用TFA/1-Dodecanethiol/H2O＝8:1:1裂解2小时(注：1-Dodecanethiol十二硫醇)，得到线形肽4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly－NH2，线性肽用1：1的乙腈和水作溶剂，用1M NaOH调pH＝9，环化得到卡贝缩宫素。其所用的碱还包括LiOH，NaHCO3，DIEA，DMAP。
捷克专利CS：8605461，先用固相多肽合成方法合成肽树脂再裂解得到Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2，再氢化得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2再跟4-Bromobutyric acid反应，得到Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2再跟X-Tyr(OMe)-OH反应，脱保护，环化得到卡贝缩宫素。
在这些专利描述的方法中，都以液相方法进行环合，国内专利用液相环合的还有杭州和锦的专利(申请号：201010560715.4)，上海苏豪逸明制药的专利(申请号：201110001400.0)以及苏州天马的专利(申请号201510001735.0)，这种方法需要反应原料在极稀溶液中反应，且副反应较多，在规模化生产中需大量溶剂，随即产生大量废液。本发明利用固相假稀释原理，开发了固相高效环合方法，反应时间缩短至2～3小时，反应废液降为液相反应的1/10以下。并且能有效减少副反应，提高粗肽纯度，进而提高收率。
国内专利中有多篇也使用固相方法环化，根据先成硫醚键还是先成酰胺键可分为两类：第一类是先将溴代丁酸通过酰胺偶联与肽链的酪氨酸氨基偶联，再用碱(如DIPEA、NMM、LiCl、DMAP)作用下消除溴化氢形成硫醚键而关环。采用该方法的专利有深圳翰宇药业的专利(申请号200910106889.0)和杭州湃肽的专利(申请号201410461695.3)；另一类是先将羧基保护的丁酸连接到半胱氨酸的巯基上，偶联完所有残基后脱除丁酸羧基保护基，再通过酰胺偶联与肽链上的酪氨酸氨基偶联环合，采用该方法的专利有深圳健元药业的专利(申请号201010544419.5)，成都圣诺科技的专利(申请号201110151928.6)，无锡凯利的专利(申请号201210255959.0)，成都天台山药业的专利(申请号201410331088.5)。
采用片段偶联的专利国内也有两篇。杭州诺泰的专利(申请号201310412014.X)，单独将碳端的谷氨酰胺作为一个片段，其余8个残基作为一个片段，环化采用液相方法进行。海南双成的专利(申请号201410076731.4)采用将碳端的Pro-Leu-Gly作为一个片段，其余6个残基作为一个片段，采用溴丁酸为丁酸残基原料，固相环化的碱采用DIPEA、TEA或LiOH。
以液相方法进行环合的方法需要反应原料在极稀溶液中反应，且副反应较多，在规模化生产中需大量溶剂，随即产生大量废液。本发明利用固相假稀释原理，开发了固相高效环合方法，反应时间缩短至2～3小时，反应废液降为液相反应的1/10以下。并且能有效减少副反应，提高粗肽纯度，进而提高收率。
采用片段合成，可以解决按次序逐个偶联造成的粗产物纯度不高。片段法可以选择分段的位点有三处，为Cys-Pro-Leu-Gly之间的三个位点。选择Cys-Pro之间(如201410076731.4)，则Cys为片段的起始连接氨基酸，由于Fmoc-Cys(Mmt)-OH在与Wang树脂偶联时容易出现消旋，使Cys对映体杂质明显增大(见对比例1)，而Cys对映体杂质对纯化影响很大，会大幅降低精肽收率。选择Leu-Gly之间的位点(如201310412014.X)，则单独一个甘氨酸作为片段，会造成偶联对接时，反应位阻较大，产物中缺甘氨酸杂质升高，给纯化带来不便。因此本申请选择Pro-Leu之间的位点。
发明内容
本发明一个方面涉及1、一种卡贝缩宫素的固相片段制备方法，其包括以下步骤：
1)以固相合成树脂为载体，通过连接受保护的氨基酸，脱除氨基保护基，再连接受保护的氨基酸的方法依次连接氨基和侧链经过保护的脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)，得到末端氨基经过保护的线性六肽片段树脂；
2)脱除末端氨基保护后，连接4-氯丁酸，得到全保护七肽片段树脂；
3)脱除半胱氨酸巯基保护基，得到裸露巯基的七肽片段树脂；
4)在碱性条件下，在缩合剂作用下，末端氯基团与半胱氨酸侧链巯基偶联成环，得到环七肽片段树脂；
5)裂解环七肽片段树脂，得到环七肽片段；
6)以固相合成树脂为载体，通过连接受保护的氨基酸，脱除氨基保护基，再连接受保护的氨基酸的方法依次连接氨基经过保护的甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)，得到二肽树脂；
7)将步骤5)所得环七肽片段连接到二肽树脂上，得到卡贝缩宫素肽树脂；
8)裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素。
进一步地，其中所述氨基和侧链经过保护的脯氨酸选自Fmoc-Pro-OH；所述氨基和侧链经过保护的半胱氨酸选自Fmoc-Cys(Mmt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的天冬酰胺选自Fmoc-Asn(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的谷氨酰胺选自Fmoc-Gln(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的异亮氨酸选自Fmoc-Ile-OH；所述氨基和侧链经过保护的酪氨酸选自Fmoc-Tyr(Me)-OH；所述氨基经过保护的甘氨酸选自Fmoc-Gly-OH；所述氨基经过保护的亮氨酸选自Fmoc-Leu-OH。
进一步地，步骤1)和/或步骤7)中所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A选自HOBt或HOAt，B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种或多种；优选地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比例计为DIPCDI:A＝1.1～1.5:1.0～1.4，DIPEA:A:B＝1.8～2.2:1.0～1.4:0.95～1.05；更优选为DIPCDI:A＝1.3:1.2，DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0。
进一步地，步骤3)的脱除试剂为三氟乙酸和三异丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸浓度为2～5％，三异丙基硅烷浓度为3～8％。
进一步地，步骤4)所用的碱为DBU或LiCl/DIPEA组合，优选DBU；步骤4)所述溶剂优选为DMF或N-甲基吡咯烷酮，反应终点采用Ellman反应检测。
进一步地，步骤1)所用的树脂为wang树脂、2-CTC树脂，步骤6)所用的树脂为RinkAmide树脂、Rink Amide-AM树脂，Rink Amide-MBHA树脂，优选地，步骤1)为wang树脂，步骤6)为Rink Amide树脂。，步骤6)所用的树脂为Rink Amide树脂，优选地，步骤6)中所述树脂替代度为0.2-0.9mmol/g，更优选0.4～0.6mmol/g。
进一步地，步骤5)和/或步骤8)获得产物，还包括纯化步骤，优选所述纯化步骤选自重结晶、反相高压液相方法；更优选地，重结晶方法为将粗肽溶于THF，然后向其中加入MTBE。
进一步地，步骤5)采用的裂解试剂为TFA：TIS：H2O＝85～95:2～8:2～8(V:V)。
本发明的反应流程如下所示：
具体实施方式
实施例1：制备Fmoc-Pro-Wang树脂
称取替代度为1.166mmol/L的Wang树脂11.949g(13.9mmol)，DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取DMAP 0.183g(1.39mmol)加入反应柱中。称取29.69g(83.4mmol)Fmoc-Pro-OH，加适量DCM溶解，冰水浴冷却下加入8.7ml(55.6mmol)DIPCDI,活化3分钟后将此溶液加入反应柱中，氮气鼓泡反应3h。抽除反应液，DMF洗涤3次，加23ml吡啶和28ml乙酐进行封闭反应过夜。抽除反应液，DMF洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，抽干树脂，得到Fmoc-Pro-Wang树脂22.51g,检测替代度为0.627mmol/g。
实施例2：七肽环肽的制备
称取实施例1所得的Fmoc-Pro-Wang树脂15.959g(10mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取18.47g(30mmol)Fmoc-Cys(Mmt)-OH和4.46g(33mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入5.2mL(36mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取17.90g(30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH和4.46g(33mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入5.2mL(36mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
按同样方法依次偶联Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH.
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，茚三酮检测树脂有颜色。称取12.26g(100mmol)4-氯丁酸用DCM溶解，冰水浴下加入7.2ml(50mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2.5小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。所得即为全保护七肽树脂。
脱除Mmt保护基：用DCM洗涤树脂6次,将DCM：TFA：TIS＝93:2:5的脱保护液加入固相反应柱中，氮气鼓气反应10分钟后，抽掉，再加入脱保护液氮气反应10分钟，抽掉，再重复两次脱保护反应。
固相环化：脱Mmt保护反应结束后，用DCM洗涤3次，DMF洗涤3次。称取22.4g(147mmol)DBU用适量DMF溶解加入固相反应柱中，室温反应2小时后，以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。
反应结束，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥得到七肽环肽树脂25.12g。
将七肽环肽树脂加入到500ml三口瓶中，氮气保护。加入预先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)250ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2500ml冰乙醚中沉淀、离心，乙醚洗涤2次，减压干燥得到粗肽8.0克，HPLC纯度88.3％。
将所得8.0g七肽环肽粗肽用40mlTHF搅拌溶解，边搅拌边滴加240mlMTBE，冰水浴搅拌1小时后，过滤，滤饼真空干燥，得到七肽环肽为白色固体7.3g,HPLC纯度98.1％。合成收率89.3％。
实施例3：卡贝缩宫素肽树脂的制备
称取替代度为0.557mmol/g的Rink Amide树脂5.40g(3.0mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取2.68g(9mmol)Fmoc-Gly-OH和1.34g(9.9mmol)HOBT用DMF溶解，加入1.55mL(10.8mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.18g(9mmol)Fmoc-Leu-OH和1.34g(9.9mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入1.55mL(10.8mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取7.3g(8.9mmol)七肽环肽和1.34g(9.9mmol)HOAT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入2.86g(8.9mmol)TBTU和3.1ml(18mmol)DIPEA活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
反应结束，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥得到g卡贝缩宫素肽树脂7.72，树脂增重2.32g,理论增重2.30g，增重率101％。
实施例4：卡贝缩宫素精肽的制备
将实施例3得到的卡贝缩宫素肽树脂7.72克加入到125ml三口瓶中，氮气保护。加入预先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)78ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入780ml冰乙醚\中沉淀、离心，乙醚洗涤2次，减压干燥得到粗肽2.83克，HPLC纯度96.23％。经过高压液相制备纯化，冻干得到卡贝缩宫素精肽2.53g，纯度99.12％，最大单杂0.15％。理论产量2.96g，总收率85.5％。
对比例：制备6环肽
投料12.49g Wang树脂，按照实施例1的方法制备Fmoc-Cys(Mmt)-Wang树脂，得树脂29.4g，替代度为0.26mmol/g。按照实施例2的方法依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH和4-氯丁酸，脱除Mmt保护基，DBU固相环化，裂解后未经重结晶检测，粗肽纯度64％，消旋杂质14％。与实施例2中的片段粗肽纯度88.3％有明显差异。
Claims (13)
1.一种卡贝缩宫素的固相片段制备方法，其包括以下步骤：
1）以固相合成树脂为载体，通过连接受保护的氨基酸，脱除氨基保护基，再连接受保护的氨基酸的方法依次连接氨基和侧链经过保护的脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、异亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr），得到末端氨基经过保护的线性六肽片段树脂；
2）脱除末端氨基保护后，连接4-氯丁酸，得到全保护七肽片段树脂；
3）脱除半胱氨酸巯基保护基，得到裸露巯基的七肽片段树脂；
4）在碱性条件下，在缩合剂作用下，末端氯基团与半胱氨酸侧链巯基偶联成环，得到环七肽片段树脂；
5）裂解环七肽片段树脂，得到环七肽片段；
6）以固相合成树脂为载体，通过连接受保护的氨基酸，脱除氨基保护基，再连接受保护的氨基酸的方法依次连接氨基经过保护的甘氨酸（Gly）和亮氨酸（Leu），得到二肽树脂；
7）将步骤5）所得环七肽片段连接到二肽树脂上，得到卡贝缩宫素肽树脂；
8）裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素；
其中，步骤4）所用的碱为DBU。
2.根据权利要求1所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，其中所述氨基和侧链经过保护的脯氨酸选自Fmoc-Pro-OH；所述氨基和侧链经过保护的半胱氨酸选自Fmoc-Cys(Mmt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的天冬酰胺选自Fmoc-Asn(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的谷氨酰胺选自Fmoc-Gln(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的异亮氨酸选自Fmoc-Ile-OH；所述氨基和侧链经过保护的酪氨酸选自Fmoc-Tyr(Me)-OH；所述氨基经过保护的甘氨酸选自Fmoc-Gly-OH；所述氨基经过保护的亮氨酸选自Fmoc-Leu-OH。
3.根据权利要求1或２任一项所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤1）和/或步骤6）中所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A选自HOBt或HOAt，B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，偶联剂中各成分的比例以摩尔比例计为DIPCDI:A=1.1~1.5:1.0~1.4，DIPEA:A:B=1.8~2.2:1.0~1.4:0.95~1.05。
5.根据权利要求4所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，偶联剂中各成分的比例以摩尔比例计为DIPCDI:A=1.3:1.2，DIPEA:A:B=2.0:1.2:1.0。
6.根据权利要求1-2任一项所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤3）的脱除试剂为三氟乙酸和三异丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸浓度为2~5%，三异丙基硅烷浓度为3~8%。
7.根据权利要求1-2任一项所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤1）所用的树脂为wang树脂、2-CTC树脂，步骤６）所用的树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide-AM树脂，Rink Amide-MBHA树脂。
8.根据权利要求7所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤1）为wang树脂，步骤６）为Rink Amide树脂。
9.根据权利要求8所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤6）中所述树脂替代度为0.2-0.9mmol/g。
10.根据权利要求9所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤6）中所述树脂替代度为0.4~0.6 mmol/g。
11.根据权利要求1-2任一项所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤５）和/或步骤８）获得产物后，还包括纯化步骤，所述纯化步骤选自重结晶、反相高压液相方法。
12.根据权利要求11所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，重结晶方法为将粗肽溶于THF，然后向其中加入MTBE。
13.根据权利要求1-2任一项所述的卡贝缩宫素的固相片段制备方法，步骤5）采用的裂解试剂以体积比计为TFA：TIS：H2O=85~95:2~8:2~8。
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