KR101046846B1

KR101046846B1 - 고체상 합성법을 이용한 펩타이드의 제조방법

Info

Publication number: KR101046846B1
Application number: KR1020070102700A
Authority: KR
Inventors: 차경회; 임대성; 이한원; 김경민; 유선종
Original assignee: 동국제약 주식회사
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2007-10-11
Publication date: 2011-07-06
Also published as: KR20080033120A

Abstract

본 발명은 약리활성을 갖는 펩타이드인 고세렐린(goserelin), 부세렐린(buserelin) 및 루프롤라이드(leuprolide)의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법은 고분자 지지체 상에서 아미노산을 순차적으로 결합시킨 후 최종적으로 고분자 지지체에서 유리시켜 고순도로 펩타이드를 제조할 수 있는 새로운 펩타이드 제조방법에 관한 것이다.

펩타이드, 고세렐린, 부세렐린, 루프롤라이드

Description

고체상 합성법을 이용한 펩타이드의 제조방법{A Method for preparing peptides using by solid phase synthesis}

본 발명은 약리 활성을 갖는 펩타이드인 고세렐린(goserelin), 부세렐린(buserelin) 및 루프롤라이드(leuprolide)의 제조방법에 관한 것이다.

[문헌 1] Timothy J. Perren et al., Pharmacokinetic and endocrinological parameters of a slow-release depot preparation of the GnRH analogue ICI 118630 (Zoladex) compared with a subcutaneous bolus and continuous subcutaneous infusion of the same drug in patients with prostatic cancer, Cancer Chemother . Pharmacol, 18, p.39, 1986.

[문헌 2] G. Tolis et al., Tumor Growth Inhibition in Patients with Prostatic Carcinoma Treated with Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Agonists, Proc . Natl . Acad . Sci ., 79, p.1658, 1982.

[문헌 3] Bodanszky et al, In Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 1976.

[문헌 4] 미국특허 제6,664,372호

[문헌 5] 미국특허 제6,624,290호

[문헌 6] 미국특허 제6,069,163호

[문헌 7] 미국특허 제5,965,538호

[문헌 8] 미국특허 제4,634,715호

[문헌 9] 미국특허 제5,602,231호

[문헌 10] 유럽특허 제0518655호

[문헌 11] 미국특허 제 6,879,289호

[문헌 12] 미국특허 제 3,914,412호

고세렐린(goserelin) 및 루프롤라이드(leuprolide)는 호르몬성 항암제로써, GnRH 아날로그(Gonadorelin releasing hormone agonists)계열의 약물이며, 이들의 작용기전은 내인성 GnRH보다 펩티다아제(peptidase)에 대해서 강하고, 수용체에 대한 친화력이 더 높은 합성 아날로그로 투여시 뇌하수체 세포막의 GnRH 수용체의 수를 감소시키고 (down regulation), GnRH 수용체 복합체가 세포내 과정(intracellular process)으로 연결되지 않게 하거나(uncoupling), 탈감작(desensitization)을 시켜 항암효과를 나타낸다(Timothy J. Perren et al., Pharmacokinetic and endocrinological parameters of a slow-release depot preparation of the GnRH analogue ICI 118630 (Zoladex) compared with a subcutaneous bolus and continuous subcutaneous infusion of the same drug in patients with prostatic cancer, Cancer Chemother . Pharmacol, 18, p.39, 1986) 부세렐린(buserelin)은 합성 GRH(gonadotropin-releasing hormone) 작동제(agonist)로 뇌하수체 전엽에 있는 GRH 수용체(recepter)에 특이하게 결합하여 자동조절(autoregulation)을 통해 뇌하수체에 있는 수용체의 숫자를 증가시키거나 감소시키는 작용을 한다(G. Tolis et al., Tumor Growth Inhibition in Patients with Prostatic Carcinoma Treated with Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Agonists, Proc . Natl . Acad . Sci ., 79, p.1658, 1982).

펩타이드를 화학적으로 합성하는 방법은 크게 용액상 합성법과 고체상 합성법으로 나눌 수 있다. 용액상 합성법은 고전적인 화학 합성법으로 모든 시약을 용액에 녹인 상태에서 반응시키는 방법으로 반응 속도는 빠르지만 분리 정제가 어렵다는 단점이 있다. 고체상 합성법은 메리필드(R. B. Merrifield)가 고체상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis)에 관한 이론을 제기한 이래, 발전해온 방법으로 분리정제가 간편하며 자동화가 가능하다는 장점이 있다(Bodanszky et al, In Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 1976).

메리필드(Merrifield)의 연구 이후 수많은 펩타이드 합성용 수지들이 개발되어 왔고 또 이를 이용하여 많은 펩타이드들이 합성되어 왔다. 메리필드에 의하여 개발된 클로로메틸 폴리스티렌(chloromethyl polystyrene)수지, 그리고 이 수지의 단점을 보완하여 개발된 4-알콕시벤질 알콜(4-alkoxybenzyl alcohol)의 구조를 갖는 왕(Wang) 수지가 비교적 초기에 개발되었다. 이후 이들의 단점을 보완하는 수지들이 지속적으로 개발되어 왔는데, 그 중 트리틸 구조가 도입된 2-클로로 트리틸 수지와 펩타이드의 카르복실 말단을 아미드 형태로 얻을 수 있는 링크아미드 수지가 대표적 수지이다.

이들 수지를 이용하여 초기에는 간단한 펩타이드들이 합성되었으나 점차 생리활성을 갖는 복잡한 펩타이드들이 합성되었다. 비천연 아미노산을 포함하는 펩타이드들은 효소에 의한 천연 합성이 불가능하므로 화학적 합성에 의해 제조되었고, 이 중 D-아미노산이나 아자아미노산(aza-amino acid)를 포함하는 펩타이드 중에는 강력한 생리활성 작용으로 의약품으로 사용되는 것들이 있어 많은 연구가 진행되었다(미국특허 제6,664,372호; 미국특허 제6,624,290호; 미국특허 제6,069,163호; 미국특허 제5,965,538호; 미국특허 제4,634,715호). 그러나 고세렐린과 같은 LH-RH, GnRH 계열 펩타이드를 고체상에서 합성하는데 있어 기존에 알려진 방법(미국특허 제5,602,231호; 유럽특허 제0518655호; 미국특허 제 6,879,289호; 미국특허 제 3,914,412호)으로는 만족할만한 순도의 물질을 얻을 수 없어 이를 해결하기 위한 제조 방법의 개발이 요청되고 있다.

이에 본 발명자들은 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호된 아미노산 유도체들을 고분자 지지체와 순차적으로 결합시켜 펩타이드를 제조하는 방법으로 기존의 특허와 달리 측쇄가 보호된 형태의 아미노산 유도체들을 사용하여 펩타이드를 고순도 및 고수율로 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 링크아미드 링커(rink amide linker)가 도입된 고분자 지지체 수지 및 트리틸기가 도입된 수지에 반응용매를 이용하여 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호된 아미노산 유도체들을 순차적으로 결합시키는 제 1단계; 상기 제 1단계의 수지에서 펩타이드를 분리하고 측쇄 보호기들을 선택적으로 제거하는 제 2단계의 공정을 수행함을 특징으로 하는 하기 구조식 (a) 내지 (c)의 서열로 표기되는 고세렐린, 부세렐린 및 루프롤라이드의 제조 방법을 제공한다.

고세렐린 : Pyr-His-Trp-Ser-Tyr_D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH₂ (acetate salt) (a)

부세렐린 : Pyr-His-Trp-Ser-Tyr_D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂CH₃ (acetate salt) (b)

루프롤라이드 : Pyr-His-Trp-Ser-Tyr_D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂CH₃ (acetate salt) (c)

본원에서 정의되는 서열에서, Pyr는 피로글루타민산(pyroglutamic acid), His는 히스티딘, Trp는 트립토판, Ser는 세린, Tyr은 타이로신, D-Ser(tBu)는 D-형 광학활성을 갖는 세린으로 측쇄가 3급 부틸(tertiary butyl)기로 보호된 것을 의미한다. 그리고 D-Leu는 D-형 광학활성의 로이신, Leu는 로이신, Arg는 아르기닌, Pro는 프롤린, Azagly는 글리신의 알파 탄소가 질소로 치환된 것을 의미한다.

본원에서 정의되는 고분자 지지체 수지는 폴리스티렌, 폴리아미드, 유리 또는 실리카로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 폴리스티렌인 것을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 아미노산 유도체는 N-말단 및 측쇄가 Boc(tert- butoxycarbonyl), Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 Cbz(benzyloxycarbonyl)의 보호기로부터 선택되며, 바람직하게는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 보호기로 보호된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 반응용매로는 화학반응에서 일반적으로 사용되는 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리디논, 테트라히드로푸란, 트리플루오르아세트산, 디옥산 또는 이들의 혼합용매를 반응용매로 사용하며, 바람직하게는, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 트리플루오르아세트산이다.

본원에 개시된 반응들의 반응 온도는 그 제한은 없으나, 바람직하게는 0℃ 내지 70℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 범위이다. 반응시간은 10분 내지 48시간의 범위이며, 바람직하게는 각 반응물질의 반응성과 반응 후 생성물의 생산성을 고려할 때, 1시간 내지 24시간의 범위이다. 단, 원하는 만큼 반응이 진행되지 않았을 경우에는 동일 반응을 2회 내지 5회 더 수행하여 반응 수율을 높일 수 있다.

본 발명의 목적은 약리 활성을 갖는 펩타이드인 고세렐린, 부세렐린 및 루프롤라이드의 제조방법을 제공하는 것으로, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

하기의 반응식들은 본 발명의 화합물의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 본 발명의 화합물은 반응식의 합성과정에서 사용되는 시약, 용매 및 반응 순서를 바꾸는 등의 작은 변경으로 제조될 수 있다.

먼저 본 발명의 반응 단계는 하기한 반응식에 기재된 도식에 의하여 설명된다.

상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, 본 발명은 먼저 "9-fluorenylmethoxycarbonyl"(이하 'Fmoc'라 약칭한다)기로 보호된 히드라진 유도체를 카르보닐화합물과 결합시키고 여기에 링크 아미드 수지(Link amide resin)를 반응시켜 N-말단을 활성화시켜 세미카바자이드(Semicarbazide)형 수지를 제조하는 제 1단계;

상기 반응식 1에서, X는 각종 이탈기(leaving group)들 중에서 선택적으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 할로겐, 이미다졸(imidazole), 숙신이미드(succinimide)기 등을 들 수 있다.

상기 반응식 1에서 링크 아미드 수지(Link amide resin)의 링크(Link)는 하기와 구조식 (d)와 같은 구조를 갖는 링크 아미드(Rinkamide)임을 특징으로 한다.

(d)

(A)

(B)

상기 반응식은 2가지의 다른 합성방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 첫 번째 방법 (A)는 상기 제 1단계의 Fmoc-azagly-링크아미드 수지(azagly : azaglycyl, -NH-NH-CO-)의 질소 말단에 부착된 보호기인 Fmoc 기는 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 보호기를 제거하는 제 2단계; 여기에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들 Fmoc-Arg(NO₂: nitro), Fmoc-Leu, Fmoc-D-Ser(tBu : tertiary butyl), Fmoc-Tyr(Bzl : benzyl), Fmoc-Ser(Bzl), Fmoc-Trp, Fmoc-His(Fmoc), Pyr(pyroglutamic acid)을 순차적으로 첨가하여 반응시키는 제 3단계; 상기 펩타이드의 Fmoc기를 상기 제 2단계의 탈보호기 반응으로 제거하여 펩타이드 수지를 얻는 제 4단계:

두 번째 방법 (B)는 Fmoc-His(Fmoc) 대신 Fmoc-His(Mmt)를 대체 사용함으로서 약산으로 펩타이드를 수지로부터 유리시킬 때, His의 보호기인 Mmt(4-methoxyltrityl)가 같이 제거되므로 pd/c(palladium/catalyst)를 사용한 수소분해 반응시에 좀더 수율을 높일 수 있다. 이 방법은 하기한 부세렐린 제조방법에서도 동일하게 적용될 수 있다.

상기 제 4단계의 펩타이드 수지에 2% TFA(trifluoroacetic acid)/DCM(dichloromethane) 등의 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 수지에서 펩타이드를 떼어낸 뒤 수지를 제거하는 제 5단계; 이 펩타이드에 히드라진용액을 가한 후 pd/c(palladium/catalyst) 및 시클로헥사디엔 등의 시약을 이용한 촉매 수소전이 반응으로 측쇄 보호기 중 벤질기, 니트로기(NO₂) 및 Cbz(benzyloxyl carbonyl)를 제거하고 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼으로 정제 및 이온교환 수지를 이용한 정제단계를 수행하는 제 6단계를 포함하는 공정을 수행함으로서 본원 발명의 아세테이트 염의 형태인 고세렐린을 제조할 수 있다.

부세렐린 및 루프롤라이드의 제조는 하기 반응식 3 및 반응식 4에 각각 나타내었으며 화학적 반응은 상기 고세렐린의 제조법을 준용하여 사용할 수 있는데,

예를 들어, 부세렐린은 카르복시 말단에 에틸아미드기를 포함하고 있는데 이 부분은 고체상 반응에서는 도입하기 어려운 면이 있다. 따라서 고분자 수지에서 펩타이드를 합성할 때 아르기닌 유도체가 연결된 링크-아르기닌형 수지를 이용하여 이 수지에 펩타이드를 합성하는 방식을 선택가능하다. 상기 고세렐린 제조의 제 1단계에 개시된 링크-아미드 수지를 제조하는 방법과 유사한 방법으로 2-염화 클로로트리틸(chlorotrityl chloride) 형 링크-아르기닌형 수지를 제조하는 제 1단계; Fmoc-Arg(NO₂)를 상기 수지에 붙인 후, 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 등의 반응용매로 Fmoc 기를 제거하여 탈보호 반응을 수행하는 제 2단계; 이 펩타이드에 Fmoc-Leu, Fmoc-D-Ser(tBu), Fmoc-Tyr(Bzl), Fmoc-Ser(Bzl), Fmoc-Trp, Fmoc-His(Mmt)(또는 Fmoc-His(Fmoc)), Pyr 을 순차적으로 첨가하여 반응시키는 제 3단계; 상기 펩타이드의 Fmoc기를 상기 제 1단계의 탈보호기 반응으로 제거하여 펩타이드 수지를 얻는 제 4단계:

상기에서 얻은 펩타이드 수지에 2% TFA(trifluoroacetic acid)/DCM(dichloromethane) 등의 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 수지에서 펩타이드를 떼어낸 뒤 수지를 제거하여, 상기 펩타이드에 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DSer(tBu)-Leu-Arg(NO₂)를 얻은 후 Pro- NH-CH₂CH₃및 커플링시약을 사용하여 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DSer(tBu)- Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃를 얻는 제 5단계; 이를 Pd/c(palladium/catalyst) 및 시클로헥사디엔 등의 시약을 이용한 촉매 수소전이 반응으로 측쇄 보호기 중 벤질기, 니트로기 및 Cbz(benzyloxyl carbonyl)를 제거하고 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼으로 정제 및 이온교환 수지를 이용하는 정제공정을 수행하는 제 6단계를 포함하는 공정을 통하여 본원 발명의 아세테이트 염의 형태인 부세렐린을 제조할 수 있다.

루프롤라이드 또한 부세렐린과 마찬가지로 카르복시 말단에 에틸아미드기를 포함하고 있는데 이 부분은 고체상 반응에서는 도입하기 어려운 면이 있다. 따라서 고분자 수지에서 펩타이드를 합성할 때 아르기닌 유도체가 연결된 링크-아르기닌형 수지를 이용하여 이 수지에 펩타이드를 합성하는 방식을 선택가능하다. 상기 고세렐린 제조의 제 1단계에 개시된 링트-아미드 수지를 제조하는 방법과 유사한 방법으로 2-염화 클로로트리틸(chlorotrityl chloride) 형 링크-아르기닌형 수지를 제조하는 제 1단계; Fmoc-Arg(NO₂)를 상기 수지에 붙인 후, 이 펩타이드에 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 등의 반응용매로 Fmoc 기를 제거하여 탈보호 반응을 수행하는 제 2단계; 이 펩타이드에 Fmoc-Leu, Fmoc-D-Leu, Fmoc-Tyr(Bzl), Fmoc-Ser(Bzl), Fmoc-Trp, Fmoc-His(Mmt)(또는 Fmoc-His(Fmoc)), Pyr 을 순차적으로 첨가하여 반응시키는 제 3단계; 상기 펩타이드의 Fmoc기를 상기 제 1단계의 탈보호기 반응으로 제거하여 펩타이드 수지를 얻는 제 4단계:

상기에서 얻은 펩타이드 수지에 2%~50% TFA(trifluoroacetic acid)/DCM(dichloromethane) 등의 산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 수지에서 펩타이드를 떼어낸 뒤 수지를 제거하여, 펩타이드 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DLeu-Leu-Arg(NO₂)를 얻은 후, Pro- NH-CH₂CH₃와 커플링시약을 사용하여 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DLeu- Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₂CH₃를 얻는 제 5단계; 이 펩타이드를 Pd/c(palladium/catalyst) 및 시클로헥사디엔 등의 시약을 이용한 촉매 수소전이 반응으로 측쇄 보호기 중 벤질기 및 니트로기를 제거하고 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼으로 정제 및 이온교환 수지를 이용하는 정제공정을 수행하는 제 6단계를 포함하는 공정을 통하여 본원 발명의 아세테이트 염의 형태인 루프롤라이드를 제조할 수 있다.

상기 반응식 1 내지 3에서의 펩타이드 합성은 하기 문헌에 기재된 일반적으로 알려진 펩타이드 합성법을 이용할 수 있다(Synthetic Peptides : A User's Guide, G.R. Grant, ed., Freeman & Co.,1992, pp.77-183).

상기 루프롤라이드 및 부세렐린을 제조하는 제조공정의 1 단계에서 사용되는 2-염화 클로로트리틸(chlorotrityl chloride) 형 링크-아르기닌형 수지에서의 링크(Link)는 하기의 구조식 (e)와 같은 구조를 갖는 링크 2-클로로트리틸 클로로라이드(2-chlorotrityl chloride)임을 특징으로 한다.

(e)

루프롤라이드 및 부세렐린을 제조하는 제조공정의 5 단계에 개시된 아미노산의 커플링 반응은 각 아미노산의 활성에스테르를 이용하거나, DCC(dicyclohexyl carbodiimide), DIC(diisopropyl carbodiimide), BOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate), PyBOP(Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate), HBTU(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphate), TBTU(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl- uronium tetrafluoroborate), HATU(2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium), TATU(2-(1H-7- Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium tetrafluoroborate Methanaminium) 및 CDI(carbonyl diimidazole)으로 구성된 군으로부터 선택적으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 DIC(diisopropyl carbodiimide)을 사용가능하다. 그 사용량은 아미노산 당량에 대해 약 1 내지 10당량, 바람직하게는 약 1.5 내지 3당량이 사용된다. 아미노산 유도체의 양은 수지의 치환율에 대해 약 1 내지 10 당량, 바람직하게는 약 1.5 내지 3당량이 사용가능하다. 상기한 아미노산 활성 에스테르로는 아미노산 유도체의 대칭 무수화 물(symmetric anhydride), 혼합 무수화물(mixed anhydride), 펜타플루오르 페닐 에스테르 등 아미노산의 C 말단을 활성화시키는 물질로서 고분자 수지에 결합된 아미노산 당량에 대해 약 1 내지 10당량 사용하는 것이 바람직하다.

본원에 개시된 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호된 아미노산 유도체들을 고분자 지지체와 순차적으로 결합시켜 펩타이드를 제조하는 방법으로 기존의 공지된 기술들과는 달리 측쇄가 보호된 형태의 아미노산 유도체들을 사용함으로서, 고세렐린, 루프롤라이드 및 부세렐린 등의 펩타이드를 고순도 및 고수율로 제조할 수 있다.

본 발명의 고체상에서 고세렐린, 부세렐린 및 루프롤라이드의 제조방법에 관한 것으로, 링크 아미드링커가 도입된 개질된 폴리스티렌 수지에 아미노산 유도체들을 순차적으로 반응시켜 펩타이드 수지를 얻고 이 수지에서 펩타이드를 최종적으로 유리시켜 펩타이드를 제조하는 방법으로, 전 제조 공정을 고체상 지지체 상에서 실시하여 펩타이드 합성을 용액상합성법보다 간편하게 할 수 있으며, 종래기술상의 문제점인 고비용 및 소량 생산 등의 단점을 개선하여 목적물질을 고수율 및 저비용으로 대량 생산이 가능하도록 하였다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 여기에 제한되거 나 한정되고자 함은 아니다.

실시예 1. Fmoc - NHNH ₂ 의 제조

1-1. Fmoc - NHNH ₂ (1)

자력 교반기가 설치된 100mL 둥근바닥 플라스크에 디에틸 에테르 150 mL에 Fmoc-ONSu 12.6g을 넣어 녹이고, NH₂NH₂.H₂O 10.0g/디에틸 에테르 100 mL 용액을 1시간 동안 적가한 후 12시간 동안 반응시켰다. 용매를 회전증발하여 제거한 후 얻어진 백색 고체를 에탄올 250 mL에 환류하여 녹이고 냉각시켜 백색의 Fmoc-NHNH₂ 0.95g (수율 10%)을 얻었다.

1-2. Fmoc - NHNH ₂ (2)

상기 실시예 1-1과 동일 방법으로 Fmoc-Cl 9.7g과 테트라히드로푸란 용매를 사용하여 Fmoc-NHNH₂(2) 2.47g (수율 26%)을 얻었다.

실시예 2. 세미카바자이드 ( Semicarbazide ) 수지의 제조

2-1. 세미카바자이드 ( Semicarbazide ) 수지(1)

앞에서 제조한 상기 실시예 1-2의 Fmoc-NHNH₂(2)를 세미카바자이드 형태로 수지에 도입하기 위해 먼저 Fmoc-NHNH₂에 대해 1.1 당량의 CDI (carbonyl diimidazole)를 이용하여 링크 아미드 수지를 활성화시키고 Fmoc-NHNH₂를 가하여 세미카바자이드 수지(1)를 제조하였다. (Fmoc 정량에 의한 치환율은 0.27 mmol/g이었다; 수율 59%).

2-2. 세미카바자이드 ( Semicarbazide ) 수지(2)

상기 실시예 2-1과 동일 방법으로 디숙시닐 카보네이트(disuccinyl carbonate)를 이용하여 링크 아미드 수지를 활성화시키고 Fmoc-NHNH₂ 를 가하여 세미카바자이드 수지(2)를 제조하였다. (Fmoc 정량에 의한 치환율은 0.58 mmol/g이었다; 수율 > 95%).

실시예 3. 고세렐린 수지의 제조

3-1. Fmoc - His ( Fmoc ) 사용의 실시예

실시예 2-2에서 제조한 Fmoc-azagly-링크 아미드 수지(2) 1g 을 20% 피페리딘(piperidine)/DMF(dimethyl formamide) 용액으로 2회 처리하여 Fmoc을 제거하였다. DMF(dimethyl formamide)로 수지를 2회 세척한 후 DMF 10 mL에 팽윤시키고 Fmoc-Pro-OH 585 mg(1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol), HOBt 235 mg(1.74 mmol)를 넣고 1.5시간동안 반응시켰다. DMF(dimethyl formamide)로 세척한 후 Fmoc-Pro-OH, DIC, HOBt를 사용하여 이 반응을 1회 더 실시하였다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 상기와 같은 방법으로 Fmoc-Arg(NO₂)-OH 768 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시켰다. 수지 세척 후 Fmoc-Arg(NO₂)-OH 384 mg (0.87 mmol), DIC 136 μL(0.87 mmol)를 사용하여 한번 더 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Leu-OH 615 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 레진을 세척한 후 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-D-Ser(tBu)-OH 670 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하고 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Tyr(OBzl)-OH 859 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 같은 방법으로 Fmoc-Ser(OBzl) -OH 726 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-Trp-OH 742 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-His(Fmoc)-OH 1.078 g (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다. 같은 방법으로 Pyr-OH 244 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다.

펩타이드 수지 70 mg에 대해 2% TFA(trifluoroacetic acid)/DCM(dichloromethane) 2 mL 를 수지에 넣고 용출(elution)하여 펩타이드를 수지에서 유리시키고 그 여액을 TEA(triethylamine) 160 μL로 회수하였다. 이 공정을 3회 반복하였다. 수지를 DCM(dichloromethane)과 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모으고 모아진 용액을 증발 농축시키고 NH₂NH₂/물 (1/200) 용액 4 mL을 가한 후 2시간 동안 교반하였다. 이를 메탄올 용매 하에서 pd/c(palladium/catalyst)와 시클로헥사디엔(cyclohexadiene)을 이용하여 촉매 수소전이 반응(catalytic hydrogen transfer)을 이용하여 측쇄 보호기 중 벤질기 및 Cbz를 제거하였다. 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼을 이용하여 분리하여 고세렐린을 60%의 수율로 얻었다.

3-2. Fmoc - His ( Mmt ) 사용의 실시예

실시예 2-2에서 제조한 Fmoc-azagly-링크 아미드 수지(2) 1g 을 20% 피페리딘(piperidine)/DMF(dimethyl formamide) 용액으로 2회 처리하여 Fmoc을 제거하였다. DMF(dimethyl formamide)로 수지를 2회 세척한 후 DMF 10 mL에 팽윤시키고 Fmoc-Pro-OH 585 mg(1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol), HOBt 235 mg(1.74 mmol)를 넣고 1.5시간동안 반응시켰다. DMF(dimethyl formamide)로 세척한 후 Fmoc-Pro-OH, DIC, HOBt를 사용하여 이 반응을 1회 더 실시하였다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 상기와 같은 방법으로 Fmoc-Arg(NO₂)-OH 768 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시켰다. 수지 세척 후 Fmoc-Arg(NO₂)-OH 384 mg (0.87 mmol), DIC 136 μL(0.87 mmol)를 사용하여 한번 더 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Leu-OH 615 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 레진을 세척한 후 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-D-Ser(tBu)-OH 670 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하고 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Tyr(OBzl)-OH 859 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 같은 방법으로 Fmoc-Ser(OBzl) -OH 726 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-Trp-OH 742 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-His(Mmt)-OH 1.13 g (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다. 같은 방법으로 Pyr-OH 244 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다.

펩타이드 수지 70 mg에 대해 2% TFA(trifluoroacetic acid)/DCM(dichloromethane) 2 mL 를 수지에 넣고 용출(elution)하여 펩타이드를 수지에서 유리시키고 그 여액을 TEA 160 μL에 받았다. 이 공정을 3회 반복하였다. 수지를 DCM(dichloromethane)과 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모으고 모아진 용액을 증발 농축시키고 NH₂NH₂/물 (1/200) 용액 4 mL을 가한 후 2시간 동안 교반하였다. 이를 메탄올 용매 하에서 pd/c(palladium/catalyst)와 시클로헥사디엔(cyclohexadiene)을 이용하여 촉매 수소전이 반응을 이용하여 측쇄 보호기 중 벤질기 및 Cbz를 제거하였다. 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼(Shimadzu H-kit, acetonitrile:water = 22:78 -> 32:68, 1% increase/min)을 이용하여 분리하여 고세렐린을 65%의 수율로 얻었다.

실시예 4. 부세렐린 수지의 제조

치환율 0.9 mmol/g인 2-클로로 트리틸 클로라이드 수지 1 g을 DMF(dimethyl formamide) 10 mL에 팽윤시키고 Fmoc-Arg(NO₂)-OH 768 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시켰다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Leu-OH 615 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척한 후 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-D-Ser(tBu)-OH 670 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하고 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Tyr(OBzl)-OH 859 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 같은 방법으로 Fmoc-Ser(OBzl) -OH 726 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 Fmoc-Trp-OH 742 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-His(Fmoc)-OH 1.078 g (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Pyr-OH 244 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다.

펩타이드 수지 70 mg에 대해 1% TFA(trifluoroacetic acid)/DCM(dichloromethane) 2 mL 를 수지에 넣고 용출(elution)하여 펩타이드를 수지에서 유리시키고 그 여액을 피리딘 200 μL에 받았다. 이 공정을 5회 반복하였다. 수지를 DCM(dichloromethane)과 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모으고 모아진 용액을 증발 농축시키고 에테르를 가하여 펩타이드 침전을 얻었다. 침전을 걸러 Pro-NH-CH₂CH₃ 305 mg (2.4 mmol)와 DIC 303 mg (2.4 mmol)를 이용하여 DCM(dichloromethane) 용매 하에서 커플링시켰다. 용액을 증발 농축시키고 EtOAc에 녹인 후 포화 NaHCO₃ 용액, 증류수, 5% 구연산 수용액으로 세척하고 무수 MgSO₄ 로 건조하였다. MgSO₄ 를 여과하여 제거하고 증발 농축시켰다. 이를 메탄올 용매 하에서 pd/c(palladium/catalyst)와 포름산 암모늄(ammonium formate)을 사용하여 촉매 수소전이 반응을 이용하여 측쇄 보호기 중 벤질기 및 Cbz를 제거하였다. 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼을(Shimadzu H-kit, acetonitrile:water = 22:78 -> 32:68, 1% increase/min) 이용하여 분리하여 부세렐린을 40%의 수율로 얻었다.

실시예 5. 루프롤라이드 수지의 제조

치환율 0.9 mmol/g인 2-클로로 트리틸 클로라이드 수지 1 g을 DMF(dimethyl formamide) 10 mL에 팽윤시키고 Fmoc-Arg(NO₂)-OH 768 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시켰다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Leu-OH 615 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척한 후 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-D-Leu-OH 615 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하고 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Tyr(OBzl)-OH 859 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 같은 방법으로 Fmoc-Ser(OBzl) -OH 726 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-Trp-OH 742 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 Fmoc- His(Fmoc)-OH 1.078 g (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Pyr-OH 244 mg (1.74 mmol), DIC 271 μL(1.74 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다.

펩타이드 수지 70 mg에 대해 1% TFA(trifluoroacetic acid)/DCM(dichloromethane) 2 mL 를 수지에 넣고 용출(elution)하여 펩타이드를 수지에서 유리시키고 그 여액을 피리딘 200 μL에 받았다. 이 공정을 5회 반복하였다. 수지를 DCM(dichloromethane)과 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모으고 모아진 용액을 증발 농축시키고 에테르를 가하여 펩타이드 침전을 얻었다. 침전을 걸러 Pro-NH-CH₂CH₃ 305 mg (2.4 mmol)와 DIC 303 mg (2.4 mmol)를 이용하여 DCM(dichloromethane) 용매 하에서 커플링시켰다. 용액을 증발 농축시키고 EtOAc에 녹인 후 포화 NaHCO₃ 용액, 증류수, 5% 구연산 수용액으로 세척하고 무수 MgSO₄ 로 건조하였다. MgSO₄ 를 여과하여 제거하고 증발 농축시켰다. 이를 메탄올 용매 하에서 pd/c(palladium/catalyst)와 포름산암모늄(ammonium formate)을 사용하여 촉매 수소전이 반응을 이용하여 측쇄 보호기 중 벤질기 및 Cbz를 제거하였다. 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼을 이용하여 분리하여 루프롤라이드를 37%의 수율로 얻었다.

Claims

링크아미드 수지에 반응용매를 이용하여 아민말단 및 측쇄가 모두 보호된 아미노산 유도체들을 순차적으로 결합시키는 제 1단계; 상기 제 1단계의 수지에서 펩타이드를 분리하고 측쇄 보호기들을 선택적으로 제거하는 제 2단계의 공정을 수행함을 특징으로 하는 하기 구조식 (a)의 서열로 표기되는 고세렐린을 제조하는 제조 방법; 또는 트리틸기가 도입된 수지에 반응용매를 이용하여 아민말단 및 측쇄가 모두 보호된 아미노산 유도체들을 순차적으로 결합시키는 제 1단계; 상기 제 1단계의 수지에서 펩타이드를 분리하고 측쇄 보호기들을 선택적으로 제거하는 제 2단계의 공정을 수행함을 특징으로 하는 하기 구조식 (b) 내지 (c)의 서열로 표기되는 부세렐린 및 루프롤라이드를 제조하는 제조 방법.

고세렐린 : Pyr-His-Trp-Ser-Tyr_D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH₂ (acetate salt) (a)

부세렐린 : Pyr-His-Trp-Ser-Tyr_D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂CH₃ (acetate salt) (b)

루프롤라이드 : Pyr-His-Trp-Ser-Tyr_D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂CH₃ (acetate salt) (c)
제 1항에 있어서, 상기 수지는 폴리스티렌 또는 폴리아미드인 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 아미노산 유도체는 N-말단 및 측쇄가 Boc(tert-butoxycarbonyl), Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 및 Cbz(benzyloxycarbonyl)로 구성된 군으로부터 선택된 기로 보호된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 1단계의 반응 용매가 디클로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리디논, 테트라히드로푸란, 트리플루오르아세트산, 디옥산 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, Fmoc기로 보호된 히드라진 유도체를 카르보닐화합물과 결합시키고 여기에 링크 아미드 수지(Link amide resin)를 반응시켜 N-말단을 활성화시켜 세미카바자이드(Semicarbazide)형 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 제 1단계의 Fmoc-azagly-링크아미드 수지(azagly : azaglycyl, -NH-NH-CO-)의 질소 말단에 부착된 보호기인 Fmoc 기를 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 보호기를 제거하는 제 2단계; 여기에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들 Fmoc-Arg(NO₂: nitro), Fmoc-Leu, Fmoc-D-Ser(tBu : tertiary butyl), Fmoc-Tyr(Bzl : benzyl), Fmoc-Ser(Bzl), Fmoc-Trp, Fmoc-His(Fmoc), Pyr(pyroglutamic acid)을 순차적으로 첨가하여 반응시키는 제 3단계; 상기 펩타이드의 Fmoc기를 상기 제 2단계의 탈보호기 반응으로 제거하여 펩타이드 수지를 얻는 제 4단계: 제 4단계의 펩타이드 수지에 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 수지에서 펩타이드를 떼어낸 뒤 수지를 제거하는 제 5단계; 이 펩타이드에 히드라진용액을 가한 후 촉매 수소전이 반응으로 측쇄 보호기 중 벤질기, 니트로기(NO₂) 및 Cbz(benzyloxyl carbonyl)를 제거하고 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼으로 정제 및 이온교환 수지를 이용하여 정제하는 제 6단계를 포함하는 제 1항의 구조식 (a)의 서열로 표기되는 고세렐린을 제조하는 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 Fmoc-His(Fmoc) 대신 Fmoc-His(Mmt)를 사용하는 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 제 1단계에서 링크 아미드 수지(Link amide resin)의 링크(Link)는 하기 구조식 (d)의 링크 아미드(Rinkamide)임을 특징으로 하는 방법:

(d)
제 1항에 있어서, 상기 트리틸기가 도입된 수지로서 2-염화 클로로트리틸(chlorotrityl chloride) 형 링크-아르기닌형 수지(link-Arg-Resin)를 제조하는 제 1단계; Fmoc-Arg(NO₂)를 상기 수지에 붙인 후, 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 반응용매로 Fmoc 기를 제거하는 탈보호 반응을 수행하는 제 2단계; 이 펩타이드에 Fmoc-Leu, Fmoc-D-Ser(tBu), Fmoc-Tyr(Bzl), Fmoc-Ser(Bzl), Fmoc-Trp, Fmoc-His(Mmt)(또는 Fmoc-His(Fmoc)), Pyr 을 순차적으로 첨가하여 반응시키는 제 3단계; 상기 펩타이드의 Fmoc기를 상기 제 1단계의 탈보호기 반응으로 제거하여 펩타이드 수지를 얻는 제 4단계: 상기에서 얻은 펩타이드 수지에 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 수지에서 펩타이드를 떼어낸 뒤 수지를 제거하여, 상기 펩타이드에 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DSer(tBu)-Leu-Arg(NO₂)를 얻은 후 Pro- NH-CH₂CH₃및 커플링시약을 사용하여 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DSer(tBu)- Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃를 얻는 제 5단계; 이를 촉매 수소전이 반응으로 측쇄 보호기 중 벤질기, 니트로기 및 Cbz(benzyloxyl carbonyl)를 제거하고 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼으로 정제 및 이온교환 수지를 이용하는 정제공정을 수행하는 제 6단계를 포함하는 제 1항의 구조식 (b)의 서열로 표기되는 부세렐린을 제조하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 2-염화 클로로트리틸(chlorotrityl chloride) 형 링크-아르기닌형 수지(link-Arg-Resin)를 제조하는 제 1단계; Fmoc-Arg(NO₂)를 상기 수지에 붙인 후, 이 펩타이드에 반응용매로 Fmoc 기를 제거하는 탈보호 반응을 수행하는 제 2단계; 이 펩타이드에 Fmoc-Leu, Fmoc-D-Leu, Fmoc-Tyr(Bzl), Fmoc-Ser(Bzl), Fmoc-Trp, Fmoc-His(Mmt)(또는 Fmoc-His(Fmoc)), Pyr 을 순차적으로 첨가하여 반응시키는 제 3단계; 상기 펩타이드의 Fmoc기를 상기 제 1단계의 탈보호기 반응으로 제거하여 펩타이드 수지를 얻는 제 4단계: 상기에서 얻은 펩타이드 수지에 산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 수지에서 펩타이드를 떼어낸 뒤 수지를 제거하여, 펩타이드 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DLeu-Leu-Arg(NO₂)를 얻은 후, Pro- NH-CH₂CH₃와 커플링시약을 사용하여 Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-DLeu- Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₂CH₃를 얻는 제 5단계; 이 펩타이드를 촉매 수소전이 반응으로 측쇄 보호기 중 벤질기 및 니트로기를 제거하고 얻어진 펩타이드를 역상 컬럼으로 정제 및 이온교환 수지를 이용하는 정제공정을 수행하는 단계를 포함하는 제 1항의 구조식 (c)의 서열로 표기되는 루프롤라이드를 제조하는 제조방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 제 1단계에서 2-염화 클로로트리틸(chlorotrityl chloride) 형 링크-아르기닌형 수지(link-Arg-Resin)의 링크는 하기 구조식 (e)의 링크 2-클로로트리틸 클로로라이드(2-chlorotrityl chloride)인 방법.

(e)
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 커플링 시약은 각 아미노산의 활성에스테르, DCC(dicyclohexyl carbodiimide), DIC(diisopropyl carbodiimide), BOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate), PyBOP(Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate), HBTU(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphate), TBTU(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl- uronium tetrafluoroborate), HATU(2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium), TATU(2-(1H-7- Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium tetrafluoroborate Methanaminium) 및 CDI(carbonyl diimidazole)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.