KR20090074316A - 고체상 합성법을 이용한 소마토스타틴 유사체 펩타이드의제조방법 - Google Patents

고체상 합성법을 이용한 소마토스타틴 유사체 펩타이드의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약리활성을 갖는 펩타이드인 소마토스타틴(somatostatin) 또는 그 유사체인 옥트레오타이드(octreotide)의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법은 고분자 지지체 상에서 아미노산을 순차적으로 결합시킨 후 최종적으로 고분자 지지체에서 유리시켜 고순도로 펩타이드를 제조할 수 있는 새로운 펩타이드 제조방법에 관한 것이다.
펩타이드, 소마토스타틴, 옥트레오타이드, 고체상

Description

고체상 합성법을 이용한 소마토스타틴 유사체 펩타이드의 제조방법 {A Method for preparing somatostatin analogues peptides using by solid phase synthesis}
본 발명은 약리 활성을 갖는 펩타이드인 소마토스타틴(somatostatin) 또는 그 유사체인 옥트레오타이드(octreotide)의 제조방법에 관한 것이다.
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본 발명은 약리활성을 갖는 펩타이드인 소마토스타틴(somatostatin) 또는 그 유사체인 옥트레오타이드(octreotide)의 제조방법에 관한 것이다.
소마토스타틴은 브라제아우 등에 의해 발견된, 14개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 뇌하수체, 췌장, 위장관 등과 같은 조직 내에서의 분비 과정에 강력한 억제 작용이 있음이 알려져 있다. 또한 소마토스타틴은 중추신경계에서 신경조절체로도 작용한다. 억제 작용에 있어 소마토스타틴의 생물학적 효과는 G 단백질 결합 수용체에 기인하는데, 여기에는 5종의 아류형(subtype)이 존재한다.
소마토스타틴은 호르몬 분비, 글루카곤, 인슐린, 아밀린, 신경전달물질 분비에 관여한다. 그 중 몇 가지는 소마토스타틴의 특이적 수용체와 연관되어 있는데, 예를 들면 성장 호르몬의 억제는 소마토스타틴 타입-2 수용체, 인슐린 억제는 타입-5 수용체와 연관되어있다(Lloyd, et al., Am. J. Physiol. 268, G102, 1995).
소마토스타틴은 다양한 질병의 처치에 사용되는데, 하기의 문헌들을 통해 확인할 수 있다: 쿠싱 신드롬(Clark, R.V. et al., Clin. Res. 38, 9943A, 1990); 생식샘수암(Ambrosi, B., et al., Acta Endocr. (Copenh.) 122, 569-576, 1990); 고부갑상선(Miller, D., et al., Canad. Med. Ass. J., 145, 227-228, 1991); 파제의 질병(Palmieri, G,M.A., et al., J. Bone & Mineral Res, 7 (Suppl.1), S240(Abs. 591), 1992); 바이포마(Koberstein, B. et al ., Gastroenterology, 28, 295-301, 1990); 고인슐린증(Laron, Z., Israel J. Med. Sci., 26(1), 1-2, 1990); 가스트리 노마 (Bauer, F.E., et al ., Europ. J. Pharmacol., 183, 55, 1990); 조린거-엘리슨 신드롬(Mozell, E., et al ., Surg. Gynec. Obstet., 170, p.476-484, 1990); 에이즈 및 기타 상태에 따른 과민성 설사증(AIDS, Cello, J. P., et al ., Gastroenterology, 98(5), Part 2, Suppl., A163 1990); 증가된 가스트린-유리 펩타이드(Alhindawi, R., et al ., Can. J. Surg., 33, 139-142, 1990); 화학치료와 동반된 설사증(Petrelli, N., et al ., Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol., 10, 138(Abs.417) 1991); 췌장염(Tulassay, Z., et al ., Gastroenterology, 98(5), Part 2, Suppl., A238, 1990); 크론의 질병(Fedorak, R. N., et al ., Can. J. Gastroenterology, 3(2), 53- 57, 1989); 전신 경화(Soudah, H., et al ., Gastroenterology, 98(5), Part 2, Suppl., A129, 1990); 갑상선암(Modigliani, E., et al ., Ann., Endocr. (Paris), 50, 483-488, 1989); 건선(Camisa, C., et al., Cleveland Clinic J. Med., 57(1), 71-76, 1990); 저혈압(Kooner, J. S., et al ., Brit. J. Clin. Pharmacol., 28, 735-736, 1989); 패닉(Abelson, J. L., et al ., Clin. Psychopharmacol., 10, 128-132, 1990); 피부경화증(Soudah, H., et al ., Clin. Res., 39, 303A, 1991); 작은창자 장애(Nott, D. M., et al., Brit. J. Surg., 77, A691, 1990); 위식도 역류(Branch, M. S., et al., Gastroenterology, 100(5), Part 2 Suppl., p. A425, 1991); 십이지장 역류(Hasler, W., et al., Gastroenterology, 100(5), Part 2, Suppl., p.A448, 1991); 그레이브의 질병(Chang, T. C., et al ., Brit. Med. J., 304, 158, 1992); 다낭성 난소질병(Prelevic, G. M., et al ., Metabolism Clinical and Experimental, 41, Suppl. 2, 76-79, 1992); 위장출혈(Jenkins, S. A., et al ., Gut., 33, p.404-407, 1992); 백혈병 및 수막종(Koper, J. W., et al ., J. Clin. Endocr. Metab., 74, p.543-547, 1992); 암 카헥시(Bartlett, D. L., et al ., Surg. Forum., 42, p.14-16, 1991).
말단비대증 환자에 대한 소마토스타틴 계 약물인 옥트레오타이드(octreotide)와 란레오타이드(lanreotide)의 효능은 이미 잘 알려져 있으며(Ezzat S., et al ., Ann Intern Med. 117, 711-718 , 1992), 이들의 서방형 제제를 사용하여 개선된 결과도 보고된바 있다(Flogstad A K, et al ., J Clin Endocrinol Metab. 82, 23-28, 1997).
펩타이드를 화학적으로 합성하는 방법은 크게 용액상 합성법과 고체상 합성법으로 나눌 수 있다. 용액상 합성법은 고전적인 화학 합성법으로 모든 시약을 용액에 녹인 상태에서 반응시키는 방법으로 반응 속도는 빠르지만 분리 정제가 어렵다는 단점이 있다. 고체상 합성법은 메리필드(R. B. Merrifield)가 고체상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis)에 관한 이론을 제기한 이래, 발전해온 방법으로 분리정제가 간편하며 자동화가 가능하다는 장점이 있다(Bodanszky et al ., In Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 1976).
메리필드의 연구 이후 수많은 펩타이드 합성용 수지들이 개발되어 왔고 또 이를 이용하여 많은 펩타이드들이 합성되어 왔다. 메리필드에 의하여 개발된 클로로메틸 폴리스티렌(chloromethyl polystyrene) 수지, 그리고 이 수지의 단점을 보완하여 개발된 4-알콕시벤질 알콜(4-alkoxybenzyl alcohol)의 구조를 갖는 왕(Wang) 수지가 비교적 초기에 개발되었다. 이후 이들의 단점을 보완하는 수지들이 지속적으로 개발되어 왔는데, 그 중 트리틸 구조가 도입된 2-클로로 트리틸 수지와 펩타이드의 카르복실 말단을 아미드 형태로 얻을 수 있는 링크아미드 수지가 대표적 수지이다.
이들 수지를 이용하여 초기에는 간단한 펩타이드들이 합성되었으나 점차 생리활성을 갖는 복잡한 펩타이드들이 합성되었다. 비천연 아미노산을 포함하는 펩타이드들은 효소에 의한 천연 합성이 불가능하므로 화학적 합성에 의해 제조되었고, 이 중 D-아미노산이나 아자아미노산(aza-amino acid)를 포함하는 펩타이드 중에는 강력한 생리활성 작용으로 의약품으로 사용되는 것들이 있어 많은 연구가 진행되었다(미국등록특허 제6,664,372호; 미국등록특허 제6,624,290호).
이에 본 발명자들은 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호된 아미노산 유도체들을 고분자 지지체와 순차적으로 결합시켜 펩타이드를 제조하는 방법으로 특히, 시스테인(Cys)의 측쇄를 고분자 지지체에 고정하는 방법을 사용하여 펩타이드를 고순도 및 고수율로 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고분자 지지체 수지에 시스테인의 측쇄 또는 C-말단을 결합시키는 제 1단계; 상기 수지에서 아미노산 유도체를 순차적으로 결합시키는 펩타이드를 합성하는 제 2단계; 상기 합성 펩타이드가 결합된 수지로부터 펩타이드의 유리 및 디설피드 사슬을 통한 고리화 반응을 반응 용매하 에서 수행하는 제 3단계의 공정을 포함함을 특징으로 하는 하기 구조식 (a)의 소마토스타틴 또는 구조식 (b)의 옥트레오타이드를 제조하는 제조 방법을 제공한다.
소마토스타틴:
Figure 112008000064462-PAT00001
(a)
옥트레오타이드:
Figure 112008000064462-PAT00002
(b)
본원에서 정의되는 서열에서, Ala는 알라닌(alanine), Gly는 글리(glycine), Cys는 시스테인(cysteine), Lys는 리신(lysine), Asn는 아스파라긴(asparganine), Phe는 페닐알라닌(phenylalanine), Trp는 트립토판(tryptophan), Thr는 트레오닌(threonine), Ser는 세린(serine), DPhe는 D-형 광학활성을 갖는 페닐알라닌, DTrp는 D-형 광학활성을 갖는 트립토판, Thr-ol은 트레오니놀로 트레오닌의 C-말단이 알코올 형태로 환원된 것을 의미한다.
본원에서 정의되는 고분자 지지체 수지는 폴리스티렌, 폴리아미드, 유리 또는 실리카로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 폴리스티렌인 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 아미노산 유도체는 아민 말단 및 측쇄가 Boc(tert-butoxycarbonyl), Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl), Cbz(benzyloxycarbonyl), tBu(tert-butyl), StBu(tert-butylthio), Trt(tri-phenylmethyl; trityl), Acm(acetamidomethyl) 또는 Tacm(trimethylacetamido-methyl)의 보호기로부터 선택되며, 바람직하게는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 보호기로 보호된 것임을 특징으로 한다.
상기 디설피드 사슬을 통한 고리화 반응은 TFA(trifluoroacetic acid), TFMSA(trifluoromethanesulfonic acid), Hg(수은) 2가 이온, Ag(은) 1가 이온, 요오드, Tl(탈륨) 3가 이온 또는 티올에서 선택된 시약으로 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 반응용매로는 화학반응에서 일반적으로 사용되는 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리디논, 테트라히드로푸란, 디옥산 또는 이들의 혼합용매를 반응용매로 사용하며, 바람직하게는, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 트리플루오르아세트산이다.
본원에 개시된 반응들의 반응 온도는 그 제한은 없으나, 바람직하게는 0℃ 내지 70℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 범위이다. 반응시간은 10분 내지 48시간의 범위이며, 바람직하게는 각 반응물질의 반응성과 반응 후 생성물의 생산성을 고려할 때, 1시간 내지 24시간의 범위이다. 단, 원하는 만큼 반응이 진행되지 않았을 경우에는 동일 반응을 2회 내지 5회 더 수행하여 반응 수율을 높일 수 있다.
또한 본원에 개시된 상기 공정은 상기 제 2단계 이후 필요에 따라 용액상에서 아미노산을 결합할 수 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 목적은 약리 활성을 갖는 펩타이드인 소마토스타틴 또는 그 유사체인 옥트레오타이드의 제조방법을 제공하는 것으로, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
하기의 반응식들은 본 발명의 화합물의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 본 발명의 화합물은 반응식의 합성과정에서 사용되는 시약, 용매 및 반응 순서를 바꾸는 등의 작은 변경으로 제조될 수 있다.
먼저 본 발명의 반응 단계는 하기한 반응식에 기재된 도식에 의하여 설명된다.
Figure 112008000064462-PAT00003
구체적으로, 상기 반응식 1은 소마토스타틴의 합성에 대한 것이다. 본원 발명은 상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, 먼저, 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 Fmoc-Cys(Acm)-OH 등과 같은 시스테인 유도체를 2-클로로트리틸 클로라이드 수지와 DMF(dimethyl formamide) 또는 DCM(dichloromethane) 등의 용매, DIEA(N,N-diisopropylethylamine) 등의 염기하에서 결합시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 단계의 활성형 수지에 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 또는 DMA(dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 2단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-Ala-OH을 DIC(diisopropyl carbodiimide) 또는 HOBt(N-hydroxylbenzotriazole)와 같은 반응시약으로 순차적으로 첨가한 후, 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 또는 DMA(dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 일반적인 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄(straight chain) 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 3단계; 상기 연결체에 DMF/아니솔 용액, Tl(tfa)3(thalium trifluoroacetate) 혼합액, 요오드, Hg(수은) 2가 이온 또는 Ag(은) 1가 이온 등의 설피드기 형성시약을 첨가하여 수지 상에서 이황화 브리지(disulfide bridge) 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 4단계; 상기 연결체에 TFA(trifluoroacetic acid): TIS(triisopropylsilane) 혼합수용액 또는 DCM(dichloromethane) 등의 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절 단하는 제 5단계를 포함하는 공정을 통하여 본 발명의 소마토스타틴을 제조할 수 있다. 상기의 PG는 보호기(protecting group)를 의미한다.
Figure 112008000064462-PAT00004
상기 반응식 2는 옥트레오타이드의 합성에 대한 구체적인 예이다. 상기 반응식 2에서 보는 바와 같이 옥트레오타이드는 소마토스타틴과 같이 이황화 브리지(disulfide bridge)를 포함하고 있으나, 시스테인의 위치가 소마토스타틴과는 달라 반응식 1 보다는 좀 더 복잡한 상기 반응식 2의 방법을 통해 얻을 수 있다. 반응식 2는 시스테인의 측쇄를 t-부틸 계열의 보호기가 수지에 고정된 것을 사용한 예이며, 보호기 제거 조건은 하기 참고예 1에 나타내었다. 보호기가 붙어있는 펩타이드를 각종 탈보호제를 처리한 후 침전, 여과 및 원심분리 등을 거친 후 HPLC로 분리하여 반응속도를 측정한다.
구체적으로 본 발명은 상기 반응식 2에서 보는 바와 같이, A 및 B 방법으로 본원 발명의 옥트레오티드를 제조할 수 있는 데, 먼저, 설프릴기(-SH)를 갖는 수지를 이용하는 A 방법으로서, 본 발명은 브로모왕 수지와 같은 수지에 3-메틸-3-부텐-1-올을 반응시킨 후, 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 Fmoc-Cys(SH)-OH 등과 같은 시스테인 유도체를 반응시켜 설피드(-S-)를 갖는 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 수지에 트레오니놀 아세탈(threoninol acetal)을 DIC(diisopropyl carbodiimide) 또는 HOBt(N-hydroxylbenzotriazole) 등의 시약 하에서 반응시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 2단계; 상기 단계의 활성형 수지에 20% 피페리딘/DMF (dimethyl formamide) 또는 DMA (dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 2단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Thr(tBu)-ol, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Boc-DPhe-OH을 DIC (diisopropyl carbodiimide) 또는 HOBt(N-hydroxylbenzotriazole)와 같은 반응시약으로 순차적으로 첨가한 후, 20% 피페리딘/DMF (dimethyl formamide) 또는 DMA (dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 일반적인 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄(straight chain) 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 3단계; 상기 연결체에 DMF/아니솔 용액, Tl(tfa)3 (thalium trifluoroacetate) 혼합액, 요오드, Hg(수은) 2가 이온 또는 Ag(은) 1가 이온 등의 설피드기 형성 시약을 첨가하여 수지상에서 이황화 브리지 (disulfide bridge) 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 4단계; 상기 연결체에 TFA(trifluoroacetic acid): TIS(triisopropylsilane) 혼합수용액 또는 DCM(dichloromethane) 등의 약산성 분해 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절단하는 제 5단계를 포함하는 공정을 통하여 본 발명의 옥트레오타이드를 제조가능하다.
상기 A 방법과 호환적인 방법이며 본 발명의 옥트레오타이드를 얻기 위한 디설프릴기(-S-S-)를 갖는 수지를 이용하는 B방법으로서, 본 발명은 브로모 왕 (Bromo wang) 수지와 같은 수지에 3-메틸-3-부텐-1-올을 반응 후, KSH(potassium hydrogen sulfide)와 같은 설프화제를 반응시킨 후에 얻어진 설프릴기(SH)를 갖는 수지에 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 Fmoc-Cys(SH)-OH 등과 같은 시스테인 유도체 를 반응시켜 디설피드(-S-S-)를 갖는 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 수지에 트레오니놀 아세탈(threoninol acetal)을 DIC(diisopropyl carbodiimide) 또는 HOBt (N-hydroxylbenzotriazole) 등의 시약하에서 반응시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 2단계; 상기 단계의 활성형 수지에 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 또는 DMA(dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 3단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(St-Bu)-OH, Boc-DPhe-OH을 DIC(diisopropyl carbodiimide) 또는 HOBt (N-hydroxylbenzotriazole)와 같은 반응시약으로 순차적으로 첨가한 후, 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 또는 DMA(dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 일반적인 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 4단계; 상기 연결체에 DMF/아니솔 용액, Tl(tfa)3 (thalium trifluoroacetate) 혼합액, 요오드, Hg(수은) 2가 이온 또는 Ag(은) 1가 이온 등의 설피드기 형성시약을 첨가하여 수지 상에서 이황화 브리지(disulfide bridge) 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 5단계; 상기 연결체에 TFA(trifluoroacetic acid): TIS(triisopropylsilane) 혼합수용액 또는 DCM(dichloromethane) 등의 약산성 분해 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절단하는 제 6단계를 포함하는 공정을 통하여 본 발명의 옥 트레오타이드를 제조가능하다.
Figure 112008000064462-PAT00005
상기 반응식 3은 시스테인의 측쇄를 트리틸 계열의 보호기가 수지에 고정된 것을 사용한 예이다.
구체적으로 본 발명은 상기 반응식 3에서 보는 바와 같은 C방법으로서, 본 발명은 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 Fmoc-Cys(SH)-OAct 등과 같은 시스테인 유도체를 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 등의 수지와 DIEA(N,N-didisopropylethylamine) 등의 용매하에서 결합시켜 설피드(-S-)를 갖는 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 수지에 트레오니놀 아세탈(threoninol acetal)을 DIC (Diisopropyl carbodiimide) 또는 HOBt(N-hydroxylbenzotriazole) 등의 시약하에서 반응시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 2단계; 상기 단계의 활성형 수지에 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 또는 DMA(dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 3단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Boc-DPhe-OH을 DIC(Diisopropyl carbodiimide) 및 HOBt(N-hydroxylbenzotriazole)와 같은 반응시약으로 순차적으로 첨가한 후, 20% 피페리딘/DMF(dimethyl formamide) 또는 DMA(dimethylacetamide) 등의 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 일반적인 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 4단계; 상기 연결체에 DMF/아니솔 용액, Tl(tfa)3(thalium trifluoroacetate) 혼합액, 요오드, Hg(수은) 2가 이온 또는 Ag(은) 1가 이온 등의 설피드기 형성시약을 첨가하여 수지 상에서 이황화 브리지 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 5단계; 상기 연결체에 TFA(trifluoroacetic acid): TIS(triisopropylsilane) 혼합수용 액 또는 DCM(dichloromethane) 등의 약산성 분해 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절단하는 제 6단계를 포함하는 공정을 통하여 본 발명의 옥트레오타이드를 제조가능하다.
상기 반응식 1 내지 3에서 나타내는 바와 같이, 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 아미노산 유도체들을 사용하게 되는데 Fmoc기는 20% 피페리딘/DMF 또는 DMA (dimethylacetamide)로 처리하여 제거함을 알 수 있다.
합성된 펩타이드 수지는 도입된 기능기의 종류에 따라 처리 방법이 달라지는데, 하기 표 1 (참고예 1 참조)에 그 경향성을 나타내었다. 최종적으로 얻은 펩타이드는 역상 컬럼 및 이온교환 수지를 이용하여 정제된 형태로 얻어진다.
상기 반응식 1 내지 3에서의 펩타이드 합성은 하기 문헌에 기재된 일반적으로 알려진 펩타이드 합성법을 이용할 수 있다(Synthetic Peptides : A User's Guide, G.R. Grant, ed., Freeman & Co.,1992, pp.77-183). 아미노산의 커플링은 각 아미노산의 활성에스테르를 이용하거나 DCC(dicyclohexyl carbodiimide), DIC (diisopropyl carbodiimide), BOP (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluoro- phosphate), PyBOP(Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate), HBTU(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl- uronium hexafluorophosphate), TBTU(O-(Benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'- tetramethyluronium tetrafluroborate), HATU(2-(1H-7-Azabenzotriaol-1- yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexfluorophospate), TATU (2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium ttrafluoro- borate) 및 CDI(carbonyl diimidazole)으로 구성된 군으로부터 선택적으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 DIC(diisopropyl carbodiimide)이 사용가능하다. 그 사용량은 아미노산 당량에 대해 약 1 내지 10 당량, 바람직하게는 1.5 내지 3 당량이 사용된다. 아미노산 유도체의 양은 수지의 치환율에 대해 약 1 내지 10 당량, 바람직하게는 1.5 내지 3 당량이 사용가능하다.
상기 아미노산 활성에스테르는 아미노산 유도체의 대칭 무수화물(symmetric anhydride), 혼합 무수화물(mixed anhydride), 펜타플루오르 페닐 에스테르 등 아미노산의 카르복시 말단을 활성화시킨 물질로서 고분자 수지에 결합된 아미노산 당량에 대해 약 1 내지 10 당량 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 개시된 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호된 아미노산 유도체들을 고분자 지지체와 순차적으로 결합시켜 펩타이드를 제조하는 방법으로 기존의 공지된 기술들과는 달리 측쇄가 보호된 형태의 아미노산 유도체들을 사용함으로서, 소마토스타틴 및 그 유사체인 옥트레오타이드 등의 펩타이드를 고순도 및 고수율로 제조할 수 있다.
본 발명의 고체상에서 소마토스타틴 또는 그 유사체인 옥트레오타이드의 제조방법에 관한 것으로, 개질된 폴리스티렌 수지에 아미노산 유도체들을 순차적으로 반응시켜 펩타이드 수지를 얻고 이 수지에서 펩타이드를 최종적으로 유리시켜 펩타이드를 제조하는 방법으로, 고체상 지지체 상에서 펩타이드를 유리시킴과 동시에 고리화 반응을 수행할 수 있어 용액상 합성법보다 간편하게 할 수 있으며, 종래기술상의 문제점인 고비용 및 소량 생산 등의 단점을 개선하여 목적물질을 고수율 및 저비용으로 대량 생산이 가능하도록 하였다.
이하, 본 발명은 하기 참고예 및 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다.
단, 하기 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 여기에 제한되거나 한정되고자 함은 아니다.
참고예 1. 시스테인 측쇄보호기에 따른 반응결과
하기 실시예 1 내지 실시예 4에서 사용되는 합성된 펩타이드 수지는 도입된 기능기의 종류에 따라 처리 방법이 달라지는데, 수지상의 시스테인 측쇄 보호기로는 다양한 것이 사용가능하므로 다양한 보호기 사용 및 그에 따른 용매조건에 따른 반응속도를 문헌의 방법들 (Tamamura, H. et al. Int. J. Pept. Pro. Res. 45, 321, 1995; Albericio, F. et al. In "Fmoc Solid Phase Synthesis: A Practical Approach", Chan, W.C. & White, P.D.(Eds.), Oxford Univ. Press, Oxford, 2000, 104; Beekman, N.J.C.M. et al. J. Pept. Res. 50, 357, 1997; Albericio, F. et al. Int. J. Pept. Pro. Res. 37, 402, 1991; Ranganathan, S & Jayaraman, N. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 934, 1991)을 이용하여 하기와 같이 실험하여 표 1에 나타내었다.
1-1. 수은 2가 이온(Hg II)을 사용한 아세타미도메틸(Acm)기 제거
측쇄가 Acm기로 보호된 펩타이드를 10% 초산 수용액에 녹이고(5~10 mg/mL), 빙초산으로 pH 4.0으로 조정하였다. Acm기에 대해 10당량의 Hg(OAc)2를 넣고 초산 또는 암모니아 수용액으로 pH 4.0으로 다시 맞추었다. 용액은 질소 분위기, 상온에서 천천히 교반하였다. Acm기에 대해 20당량의 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 넣고 5시간동안 방치하였다. 원심분리하여 침전을 제거하고 HPLC를 이용하여 상등액에서 염을 제거하였다.
1-2. 수은 2가 이온(Hg II)을 사용한 티부틸(tBu)기 제거
측쇄가 tBu기로 보호된 펩타이드를 얼음으로 냉각한 티플루로아세트산(TFA)에 녹이고(5~10 mg/mL), tBu기에 대해 10당량의 Hg(OAc)2를 넣고 질소 분위기, 상온에서 3시간 동안 천천히 교반하였다. 상온에서 감압하여 TFA를 제거하고 잔유물을 10% 초산 수용액에 다시 녹였다. tBu기에 대해 20당량의 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 넣고 5시간동안 방치하였다. 원심분리하여 침전을 제거하고 HPLC를 이용하여 상등액에서 염을 제거하였다.
1-3. 은 1가 이온(Ag I)을 사용한 아세타미도메틸(Acm)기 제거
측쇄가 Acm기로 보호된 펩타이드를 TFA/아니솔(99:1, v/v)에 녹였다(1 mg/mL). Acm기에 대해 100당량의 은 트리플로아세테이트(Ag trifluoroacetate)를 넣고 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 에테르를 가해 은염(silver salt) 형태의 펩 타이드를 얻고 원심분리하여 회수하였다. 환원된 형태의 펩타이드를 얻고자 할 경우, 1M 초산 용액에서 Acm기에 대해 40당량의 DTT(dithiothreitol)를 가하고 25℃에서 3시간 처리한다. 원심분리하여 침전을 제거하고 HPLC를 이용하여 상등액에서 염을 제거하였다. 산화된 형태의 펩타이드를 얻고자 할 경우, 상온에서 염산 수용액/DMSO(1:1, v/v)로 처리한 후 여과하여 AgCl을 제거하고 HPLC를 이용하여 분리하였다.
1-4. 티올(thiol)을 사용한 티부틸티오(StBU)기 제거
측쇄가 StBU기로 보호된 펩타이드를 최소량의 0.1 M 탄화수소 암모늄 (ammonium bicarbonate)에 녹였다. 잘 녹지 않을 경우 DMF 또는 MeCN을 첨가할 수도 있다. 아르곤하에서 5분동안 교반하여 용액에서 공기(특히 산소)를 제거하였다. 20당량의 DTT/0.1 M 탄화수소 암모늄 (ammonium bicarbonate)를 넣고 아르곤하에서 2시간 동안 교반하였다. 초산으로 pH 2로 조정하고 바로 HPLC로 정제하였다. 참고로, Cys(StBu)는 고체상에서 펩타이드가 결합된 수지를 베타-메르캅토에탄올 (β- mercaptoethanol)/DMF (1:1, v/v)로 상온에서 5시간동안 처리하면 탈보호되었다.
1-5. 포스핀(phosphine)을 사용한 티부틸티오(StBU)기 제거
측쇄가 StBU기로 보호된 펩타이드를 pH 7.8 암모늄 아세테이트 완충액(ammonium acetate buffer)/n-프로파놀(n-propanol)(1:1, v/v)에 녹였다. 아르곤하에서 5분동안 교반하여 용액에서 공기(특히 산소)를 제거하였다. 100당량의 0.6 M 트리-n-부틸포스핀(tri-n-butylphosphine)/n-프로파놀(n-propanol)을 가하고 아르곤하에서 30분동안 교반하였다. 감압하여 완전히 건조하고 탈기된(digassed) 완 충용액에 다시 녹인 후 연과하고 HPLC로 정제하였다.
상기 기능기의 종류에 따른 반응속도를 요약한 표 1에서 +는 반응이 잘 진행됨을, -는 그 반대를 뜻하며, n은 조사가 충분히 이루어지지 않았음을 나타낸다.
TFA TFMSA Hg2 + Ag+ I2 Tl3 + Thiols
tBu - + +1 - - +2 -
Trt + + + + +2 +2 -
StBu - n n n n n +
Acm - - + + +2 +2 -
Tacm - - + + +2 n -
(참고) 1. 반응은 TFA에서 진행되어야 함. 2. 반응 생성물은 disulfide bridge을 갖고 있음. 3. TFA(trifluoroacetic acid), TFMSA(trifluoromethanesulfonic acid), Acm(acetamidomethyl), Tacm(trimethylacetamidomethyl), Trt(triphenylmethyl; trityl), Hg(수은), Ag(은), Tl(thalium), I2(요오드), tBu(tert-butyl), StBu(tert-butylthio)
실시예 1. 소마토스타틴(Somatostatin)의 제조
1-1. Fmoc-Cys(Acm)-CTR
유리 필터가 부착된 반응기(주문제작품, KC Scientific, 한국)에 2-CTCR(2-chlorotrityl chloride resin; PRSC5055, 비드테크, 한국) 1 g(1.2 mmol/g, 1.2 mmol)을 넣고 디클로로메탄 15 mL을 넣어 팽윤시켰다. Fmoc-Cys(Acm)-OH 750 mg(1.8 mmol)을 넣고 녹인 후 DIEA(N,N-diisopropylethylamine) 313 μL(1.8 mmol)을 넣어 Fmoc-Cys(Acm)-OH와 2-CTCR을 결합시켰다. 수지는 무수 메탄올, 디메틸포름아미드, 디클로메탄으로 세척하였다. Fmoc 적정 결과 수지는 0.6 mmol/g의 치환율을 보였다.
1-2. 펩타이드(소마토스타틴 전구체)-CTR
상기 실시예 1-1에서 얻은 수지 1 g 을 20% 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 Fmoc을 제거하였다. DMF로 수지를 2회 세척한 후 DMF 10 mL에 팽윤시키고 Fmoc-Ser(tBu)-OH 345 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 넣고 1.5시간동안 반응시켰다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 상기와 같은 방법으로 Fmoc-Thr(tBu)-OH 358 mg (0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg (0.9 mmol)를 사용하여 반응시켰다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Phe-OH 349 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL (0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척한 후 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Thr(tBu)-OH 358 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL (0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하고 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Lys(Boc)-OH 422 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg (0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 같은 방법으로 Fmoc-Trp(Boc)-OH 474 mg (0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-Phe-OH 349 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-Phe-OH 349 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Asn(Trt)-OH 537 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL (0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-Lys(Boc)-OH 422 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg (0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-Cys(Acm)-OH 373 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc 기를 제거하고 Fmoc-Gly-OH 268 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 상기와 같은 방법으로 Boc-Ala-OH 170 mg(0.9 mmol), DIC 139 μL(0.9 mmol), HOBt 122 mg(0.9 mmol)를 사용하여 반응시키고 수지를 세척하였다.
펩타이드 수지 70 mg에 대해 DMF/아니솔 (19:1, v/v) 용액과 Tl(tfa)3 1.63 g (1.4 mmol)을 넣고 4시간 동안 반응시켰다. 수지를 세척한 후 TFA:TIS:물(90:5:5) 용액으로 처리하여 그 액을 모으고, 수지를 DCM과 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모았다. 모아진 용액을 감압 농축시키고 차가운 에테르에 농축액을 한방울씩 적가하여 침전을 유도하고 냉장실에 방치하여 펩타이드 378 mg (수율 55%)을 얻었다.
실시예 2. 옥트레오타이드(Octreotide)의 제조예 (A 방법)
2-1. Fmoc-Threoninol(tBu)-CTR
유리 필터가 부착된 반응기(주문제작품, KC Scientific, 한국)에 2-CTCR (2-chlorotrityl chloride resin) 1 g (1.2 mmol/g, 1.2 mmol)을 넣고 디클로로메탄 15 mL을 넣어 팽윤시켰다. Fmoc-Thr(tBu)-ol 1.38 g (3.6 mmol)을 넣고 녹인 후 DIEA 628 μL (3.6 mmol)을 넣어 Fmoc-Thr(tBu)-ol과 2-CTCR을 결합시켰다. 수지는 메탄올, 디메틸포름아미드, 디클로메탄으로 세척하였다. Fmoc 적정 결과 수지는 0.44 mmol/g의 치환율을 보였다.
2-2. 페타이드(옥트레오타이드 전구체)-CTR
상기 실시예 2-1에서 얻은 수지 1g 을 20% 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 Fmoc을 제거하였다. DMF로 수지를 2회 세척한 후 DMF 10 mL에 팽윤시키고 Fmoc-Cys(Acm)-OH 547 mg (1.32 mmol), DIC 204 μL(1.32 mmol), HOBt 178 mg (1.32 mmol)를 넣고 1.5 시간동안 반응시켰다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 상기와 같은 방법으로 Fmoc-Thr(tBu)-OH 525 mg (1.32 mmol), DIC 204 μL (1.32 mmol), HOBt 178 mg (1.32 mmol)를 사용하여 반응시켰다. 얻어진 수지를 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 상기와 같은 방법으로 Fmoc-Lys(Boc)-OH 618 mg (1.32 mmol), DIC 204 μL (1.32 mmol), HOBt 178 mg (1.32 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척한 후 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하였다. 같은 방법으로 Fmoc-DTrp(Boc)-OH 695 mg (1.32 mmol), DIC 204 μL (1.32 mmol), HOBt 178 mg (1.32 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하고 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 상기와 같은 방법으로 Fmoc-Phe-OH 511 mg (1.32 mmol), DIC 204 μL (1.32 mmol), HOBt 178 mg (1.32 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 같은 방법으로 Fmoc-Cys(Acm)-OH 547 mg (1.32 mmol), DIC 204 μL (1.32 mmol), HOBt 178 mg (1.32 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다. 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc기를 제거하고 Boc-DPhe-OH 350 mg (1.32 mmol), DIC 204 μL (1.32 mmol), HOBt 178 mg (1.32 mmol)를 사용하여 반응시키고 다시 수지를 세척하였다.
펩타이드 수지 70 mg에 대해 DMF/아니솔 (19:1, v/v) 용액과 Tl(tfa)3 490 mg (0.9 mmol)을 넣고 4시간 동안 반응시켰다. 수지를 세척한 후 TFA:TIS:물 (90:5:5) 용액으로 처리하여 그 액을 모으고, 수지를 DCM과 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모았다. 모아진 용액을 감압 농축시키고 차가운 에테르에 농축액을 한방울씩 적가하여 침전을 유도하고 냉장실에 방치하여 펩타이드 245 mg (수율 78%)을 얻었다.
실시예 3. 옥트레오타이드(Octreotide)의 제조예 (B 방법)
브로모 왕 (Bromo wang) 수지 1 g (1.0 mmol/g, 1 mmol)에 3-메틸-3-부텐-1-올 303 μL (3 mmol), DIEA 523 μL (3 mmol)을 넣고 반응시켰다. KSH 3.6 g(50 mmol)을 넣고 DMF 용매하에서 60 ℃에서 반응시킨 후 Fmoc-Cys-OH 1.7 g (5 mmol)을 넣고 공기를 불어넣어 반응시켰다. Fmoc 적정 결과, 상기 수지는 0.35 mmol/g의 치환율을 보였다.
Fmoc-트레오닐(threoninol) 3 g(15.7 mmol)과 무수 아세톤을 산 촉매하에서 반응시켜 아세탈을 얻고 정제한 TFA로 10분간 처리하고 정제 에테르를 가해 트레오니놀 아세탈(threoninol acetal) 2.7 g (75%)을 얻었다.
앞에서 얻은 수지에 트레오니놀 아세탈 243 mg(1.05 mmol), DIC 163 μL (1.05 mmol), HOBt 142 mg (1.05 mmol)를 넣고 3시간 동안 반응시켰다. 이후 반응은 상기 실시예 2와 동일한 공정으로 수행하였다. 단, 사용 아미노산 유도체는 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Boc-DPhe-OH 였으며 당량 비율은 실시예 2에 준하여 실시하였다.
펩타이드 수지 70 mg에 대해 DMF/아니솔 (19:1, v/v) 용액 및 Tl(tfa)3 381 mg (0.7 mmol)을 넣고 4시간 동안 반응시켰다. 수지를 세척한 후 TFA:TIS:물 (90:5:5) 용액으로 처리하여 그 액을 모으고, 수지를 DCM 및 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모았다. 모아진 용액을 감압 농축시키고 차가운 에테르에 농축액을 한방울씩 적가하여 침전을 유도하고 냉장실에 방치하여 펩타이드 167 mg (수율 67%)을 얻었다.
실시예 4. 옥트레오타이드 ( Octreotide )의 제조예 (C 방법)
트리틸 수지 (PRSC5055, 비드테크) 1 g (1.2 mmol/g, 1.2 mmol)에 DMF 용매하에서 Fmoc-Cys-OH 1.24 g(3.6 mmol), DIEA 628 μL (3.6 mmol)을 넣어 반응시켜 2-CTCR와 결합시켰다. Fmoc 적정 결과, 상기 수지는 0.50 mmol/g의 치환율을 보였다.
Fmoc-트레오니놀 (#37201, GL Biochem, 15.7 mmol) 3 g 과 무수 아세톤을 산 촉매하에서 반응시켜 아세탈을 얻고 정제한 TFA로 10분간 처리하고 정제 에테르를 가해 트레오니놀 아세탈 (threoninol acetal)을 2.7 g (수율 75%)얻었다.
앞에서 얻은 수지에 트레오니놀 아세탈 347 mg (1.5 mmol), DIC 232 μL (1.5 mmol), HOBt 203 mg (1.5 mmol)를 넣고 3시간동안 반응시켰다. 이후 반응은 실시예 2와 같은 방법으로 진행하였다. 단, 사용 아미노산 유도체는 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Boc-DPhe-OH 였으며 당량 비율은 실시예 2에 준하여 실시하였다.
펩타이드 수지 70 mg에 대해 DMF/아니솔 (19:1, v/v) 용액 및 Tl(tfa)3 1.63 g (3 mmol)을 넣고 4시간 동안 반응시켰다. 수지를 세척한 후 TFA:TIS:물 (90:5:5) 용액으로 처리하여 그 액을 모으고, 수지를 DCM과 메탄올로 세척하여 그 여액까지 같이 모았다. 모아진 용액을 감압 농축시키고 차가운 에테르에 농축액을 한방울씩 적가하여 침전을 유도하고 냉장실에 방치하여 펩타이드 257 mg (수율 72%)을 얻었다.

Claims (9)

  1. 고분자 지지체 수지에 시스테인(Cys)의 측쇄 또는 C-말단을 결합시키는 제 1단계; 상기 수지에서 아미노산 유도체를 순차적으로 결합시키는 펩타이드를 합성하는 제 2단계; 상기 합성 펩타이드가 결합된 수지로부터 펩타이드의 유리 및 디설피드 사슬을 통한 고리화 반응을 반응 용매하에서 수행하는 제 3단계의 공정을 포함함을 특징으로 하는 하기 구조식 (a)의 소마토스타틴 또는 구조식 (b)의 옥트레오타이드를 제조하는 제조 방법:
    소마토스타틴:
    Figure 112008000064462-PAT00006
    (a)
    옥트레오타이드:
    Figure 112008000064462-PAT00007
    (b)
  2. 제 1항에 있어서, 상기 고분자 지지체는 폴리스티렌, 폴리아미드, 유리 또는 실리카인 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 아미노산 유도체는 아민 말단 및 측쇄가 Boc(tert-butoxycarbonyl), Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl), Cbz(benzyl-oxycarbonyl), tBu(tert-butyl), StBu(tert-butylthio), Trt(triphenyl-methyltrityl), Acm(acetamidomethyl) Tacm(trimethylacetamidomethyl) 또는 Tmob(2,4,6-trimethoxybenzyl)의 보호기로 보호된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서 상기 디설피드 사슬을 통한 고리화 반응은 TFA(trifluoroacetic acid), TFMSA(trifluoromethanesulfonic acid), Hg(수은) 2가 이온, Ag(은) 1가 이온, 요오드, Tl(탈륨) 3가 이온 또는 티올에서 선택된 시약으로 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 반응 용매가 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리디논, 테트라히드로푸란, 디옥산 단독용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 제조방 법.
  6. 제 1항에 있어서, 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 시스테인 유도체를 2-클로로트리틸 클로라이드 수지와 반응용매를 염기하에서 결합시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 단계의 활성형 수지에 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 2단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Gly-OH, Boc-Ala-OH을 순차적으로 첨가한 후 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄(straight chain) 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 3단계; 상기 연결체에 설피드기 형성시약을 첨가하여 수지 상에서 이황화 브리지(disulfide bridge) 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 4단계; 상기 연결체에 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절단하는 제 5단계를 포함하는 공정을 통하여 제조함을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서, 브로모 왕 수지와 같은 수지에 3-메틸-3-부텐-1-올을 반응시킨 후, 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 시스테인 유도체를 반응시켜 설피드(-S-)를 갖는 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 수지에 트레오니놀 아세탈(threoninol acetal)을 반응시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 2단계; 상기 단계의 활성형 수지에 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 2단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Thr(tBu)-ol, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Boc-DPhe-OH을 순차적으로 첨가한 후, 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄(straight chain) 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 3단계; 상기 연결체에 설피드기 형성 시약을 첨가하여 수지 상에서 이황화 브리지(disulfide bridge) 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 4단계; 상기 연결체에 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절단하는 제 5단계를 포함하는 공정을 통하여 제조함을 특징으로 하는 옥트레오타이드의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서, 브로모 왕 수지와 같은 수지에 3-메틸-3-부텐-1-올을 반응 후, 설프화제를 반응시킨 후에 얻어진 설프릴기(SH)를 갖는 수지에 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 시스테인 유도체를 반응시켜 디설피드(-S-S-)를 갖는 수지를 제조 하는 제 1단계; 상기 수지에 트레오니놀 아세탈(threoninol acetal)을 시약하에서 반응시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 2단계; 상기 단계의 활성형 수지에 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 3단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(St-Bu)-OH, Boc-DPhe-OH을 순차적으로 첨가한 후, 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄 (straight chain) 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 4단계; 상기 연결체에 설피드기 형성시약을 첨가하여 수지 상에서 이황화 브리지(disulfide bridge) 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 5단계; 상기 연결체에 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절단하는 제 6단계를 포함하는 공정을 통하여 제조함을 특징으로 하는 옥트레오타이드의 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서, 아민 말단이 Fmoc기로 보호된 시스테인 유도체를 수지와 용매하에서 결합시켜 설피드(-S-)를 갖는 수지를 제조하는 제 1단계; 상기 수지에 트레오니놀 아세탈(threoninol acetal)을 반응시켜 아미노산이 결합된 수지를 제조하는 제 2단계; 상기 단계의 활성형 수지에 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 제 3단계; 상기 탈보호화된 수지에 아민 말단 및 측쇄 가 모두 보호기로 보호된 아미노산 유도체들인 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Boc-DPhe-OH을 순차적으로 첨가한 후, 반응용매로 처리하는 탈보호기 반응으로 Fmoc 보호기를 제거하는 단계를 반복하는 고체상 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드를 합성하여 직쇄(straight chain) 형태의 펩타이드-수지 연결체를 얻는 제 4단계; 상기 연결체에 설피드기 형성시약을 첨가하여 수지 상에서 이황화 브리지(disulfide bridge) 형성을 통한 고리화 반응을 시키는 제 5단계; 상기 연결체에 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 절단하는 제 6단계를 포함하는 공정을 통하여 제조함을 특징으로 하는 옥트레오타이드의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2013132505A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Natco Pharma Limited Improved process for preparation of octreotide by solution phase peptide synthesis
WO2017018835A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. Method of preparing tdm-621
CN106631900A (zh) * 2016-09-21 2017-05-10 吉尔生化（上海）有限公司 一种Fmoc‑O‑叔丁基‑L‑苏氨醇的合成方法
CN112500450A (zh) * 2019-09-16 2021-03-16 翰宇药业（武汉）有限公司 一种奥曲肽的合成方法

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