KR101237561B1 - Ｂｏｃ 및 Ｆｍｏｃ 고상 펩타이드 합성 - Google Patents

Ｂｏｃ 및 Ｆｍｏｃ 고상 펩타이드 합성 Download PDF

Info

Publication number
KR101237561B1
KR101237561B1 KR1020097012968A KR20097012968A KR101237561B1 KR 101237561 B1 KR101237561 B1 KR 101237561B1 KR 1020097012968 A KR1020097012968 A KR 1020097012968A KR 20097012968 A KR20097012968 A KR 20097012968A KR 101237561 B1 KR101237561 B1 KR 101237561B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
product
peptide
resin
cys
boc
Prior art date
Application number
KR1020097012968A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090100369A (ko
Inventor
캐서린 피오나 달튼
존 스튜어트 아이논
스티븐 알렌 잭슨
개리 알렉산더 시우루크
Original Assignee
입센 메뉴팩츄링 아일랜드 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 입센 메뉴팩츄링 아일랜드 리미티드 filed Critical 입센 메뉴팩츄링 아일랜드 리미티드
Publication of KR20090100369A publication Critical patent/KR20090100369A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101237561B1 publication Critical patent/KR101237561B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/003—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by transforming the C-terminal amino acid to amides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/063—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for alpha-amino functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/10—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using coupling agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/64—Relaxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/655—Somatostatins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/655—Somatostatins
    • C07K14/6555—Somatostatins at least 1 amino acid in D-form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Fmoc 및 Boc 모두로 보호된 아미노산 및 클로로메틸화된 폴리스티렌 레진을 이용한 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 합성하기 위한 고상 방법.
Fmoc, Boc, 클로로메틸화된 폴리스티렌 레진, 펩타이드

Description

Ｂｏｃ 및 Ｆｍｏｃ 고상 펩타이드 합성{Boc and Fmoc solid phase peptide synthesis}
본 발명은 N-터미널 아미노산, 상기 N-터미널 아미노산에 인접한 최종 아미노산의 다음 아미노산 및 C-터미널 아미노산을 갖는 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 제조 방법에 관한 것이다.
고상 펩타이드 합성은 액상 펩타이드 합성과 관련된 다수의 중간체 정제 문제를 극복할 목적으로 1963년에 소개되었다. Stewart, et al., 고상 펩타이드 합성(Pierce Chemical Co., 2d ed., 1984). 고상 합성 동안에 아미노산은 임의의 원하는 서열의 펩타이드에 조합(즉, 결합(coupled))되는 반면에 상기 사슬의 한 쪽 끝(즉, C-terminus)은 불용성 지지체에 붙는다. 상기 원하는 서열이 지지체에 함께 연결되면, 이어서 펩타이드는 지지체로부터 디블록(deblocked)(즉, 분열(cleaved)) 된다. 상기 결합된 아미노산의 α-아미노 기능을 위한 두 개의 표준 보호기(standard protecting group)는 Boc, 강산의 처리에 의해 제거되는, 및 Fmoc, 염기에 의해 제거되는, 이다. 본 발명은 저렴한 클로로메틸화된 폴리스티렌 레진(chloromethylated polystyrene resin)상의 단일 합성에서 이러한 두 개의 α-아미노 보호기의 조합을 사용하는 편리한 펩타이드 제조 방법에 관한 것이다.
상기 언급된 α-아미노 보호 계획중 하나를 사용하는 고상법에 의한 펩타이드 합성 설계에서, 구성요소 아미노산의 임의의 반응성“측쇄(side group)”가 사슬 조합(chain assembly)동안 원하지 않는 화학 반응으로부터 보호되는 것은 중요하다. 또한, 다양한 측쇄를 보호하기 위해 선택된 화학 그룹은 α-아미노 보호기를 제거하기 위해 사용되는 시약에 의한 제거에 내성이 있는 것이 바람직하다. 셋 째, 성장하는 펩타이드 사슬의 레진 입자와의 연결(linkage)이 사슬 조합동안에 α-아미노 보호기 중의 한 형태를 제거하기 위해 사용되는 시약에 안정한 것이 중요하다. Fmoc α-아미노 보호 계획의 경우에, 측쇄 보호 기능은 Fmoc를 제거하기 위해 사용되는 염기 시약에 내성을 가져야 한다. 실제로, 상기 측쇄 보호기는 펩타이드 사슬이 조합된 후에 일반적으로 마일드한 산성 시약에 의해 제거된다. Boc α-아미노 보호 계획을 사용했을 때는, 상기 측쇄 보호기는 모든 사이클에서 Boc 그룹을 탈보호(deprotect)시키기 위해 사용되는 마일드한 산성 시약에 의한 제거에 내성이 있어야만 한다. 실제로, Boc α-아미노 보호 계획을 위한 측쇄 보호그룹은 펩타이드 사슬이 조합된 후에 일반적으로 무수 HF 에 의해 제거된다. 그러므로, 실제로, Fmoc α-아미노 보호에 일반적으로 사용되는 측쇄 보호기는 Boc α-아미노 탈보호를 위해 사용되는 조건하에서 불안정하고 상기 두 형태의 α-아미노 보호 계획은 고상 펩타이드 합성에 의한 펩타이드 사슬의 조합에서 혼용되지 않는다. 추가적으로, 펩타이드 합성에 사용되는 가장 저렴한 폴리머 레진, 클로로메틸화된 폴리스티렌 또는“메리필드 레진(Merrifield resin)”이, Boc 보호된 아미노산에 가장 널리 쓰이고 있는 반면에, 문헌은 이의 염기 조건하에서의 불안정성(lability)때문에 α-아미노 그룹에 대한 Fmoc 보호에 사용되기에는 부적합하다고 제안한다. (Stewart, et al., 고상 펩타이드 합성(Pierce Chemical Co., 2d ed.,1984)). 본 발명은 입부 펩타이드의 고상 합성동안에“메리필드 레진”에 대한 Boc 및 Fmoc 아미노산 두 가지의 혼용을 위한 방법과 관련되어 있다.
Lanreotide?은 소마토스테틴(somatostatin)의 유사체이며 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon) 및 췌외분비(pancreatic exocrine secretion)를 저해할 뿐만 아니라 성장 호르몬 방출을 억제하는 것으로 알려져 있다.
미국 특허 No.4,853,371 은 Lanreotide?을 제조하는 방법 및 성장 호르몬, 인슐린, 글루카곤의 분비 및 췌외분비를 저해하는 방법을 개시하고 Lanreotide?를 청구하고 있다.
미국 특허 No. 5,147,856 은 재협착을 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
미국 특허 No. 5,411,943 은 간암을 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
미국 특허 No. 5,703,541 은 폐암을 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
1993 년 7월 9일에 출원된 미국 출원 No. 08/089,410 는 흑색종을 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
미국 특허 No. 5,504,069 는 고형 종양의 급성 성장을 저해하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
1997년 5월 13일에 출원된 미국 출원 No. 08/854,941 은 체중을 감소시키는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
1997년 5월 13일에 출원된 미국 출원 No. 08/854,943 은 인슐린 내성 및 신드롬 X 를 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
미국 특허 No. 5,688,418 은 췌장 세포의 생존을 연장시키는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
PCT 출원 No. PCT/US97/14154 는 섬유증의 치료를 위한 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
1997년 5월 13일에 출원된 미국 출원 No. 08/855,311 은 고지혈증을 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
1995년 5월 12일에 출원된 미국 출원 No. 08/440,061 은 아밀린 과잉혈증(hyperamylinemia)를 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
1997년 5월 7일에 출원된 미국 출원 No. 08/852,221 은 고프로락틴혈증 및 프로락틴혈증을 치료하는 Lanreotide?의 사용을 개시하고 있다.
상기 특허와 특허 출원의 내용은 여기에 참고로 삽입되어있다.
본 발명은 N-터미널 아미노산(N-terminal amino acid), 상기 N-터미널 아미노산에 인접한 최종 아미노산의 다음 아미노산 및 C-터미널 아미노산(C-terminal amino acid)을 갖는 3 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 제조하는 방법에 특징이 있으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 제1-결합(coupled)-생성물을 형성하기 위하여 제1 아미노산을 에스테르 결합으로 고체 지지체 레진에 붙이는 단계, 이는 (i) 제1 아미노산의 세슘염을 형성하기 위하여 세슘 카보네이트(cesium carbonate) 수용액을 제1 아미노산의 알코올 용액과 반응시키는 단계, (ii) 제1 아미노산의 유리 세슘염 용매를 얻는 단계, (iii) 제1-결합-생성물을 형성하기 위해 건조 극성 비양성자성 용매(aprotic solvent)에서 상기 고체 지지체 레진과 상기 제1 아미노산의 세슘염을 반응시키는 단계를 포함하고;
여기서 상기 제1 아미노산은 펩타이드의 C-터미널 아미노산에 해당되고, 상기 제1 아미노산의 비측쇄 아미노 그룹은 Boc에 의해 블록되며(blocked), 상기 제1 아미노산은 보호가 필요한 측쇄 기능기를 가지고 있지 않으며, 상기 고체 지지체 레진은 클로로메틸화된 폴리스티렌 레진이며;
(b) 제1-디블록된(deblocked)-결합-생성물을 형성하기 위하여 산(acid)으로 제1-결합-생성물로부터 Boc를 디블로킹(deblocking)하는 단계;
(c) 선택적으로 다음 아미노산과 제1-디블록된-결합-생성물을 결합시키는 단계, 이는 다음-블록된-결합-생성물(next-blocked-coupled-product)을 형성하기 위하여 펩타이드 커플링 시약을 포함하는 유기 용매에서 다음 아미노산과 제1-디블럭된-결합-생성물을 반응시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 다음 아미노산은 Boc 에 의해 블록되는 비측쇄 아미노 그룹을 가지고 있고, 상기 다음 아미노산이 하나 이상의 측쇄 기능기를 가지고 있다면 측쇄 기능기는 보호를 필요로하지 않거나 또는 상기 측쇄 기능기는 Boc 및 Fmoc 디블록하기 위해 사용되는 산 및 염기 시약 각각에 대해 안정한 보호기를 가지며;
(d) 다음-디블록된-결합-생성물을 생산하기 위하여 상기 다음-블록된-결합-생성물을 산과 반응시키는 단계를 포함하는 상기 다음-블록된-결합-생성물로부터 Boc를 디블로킹하는 단계;
(e) 선택적으로 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계, 각 사이클은 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 형성하고 여기서 X는 원하는 사이클의 반복 횟수이며;
(f) 다음-아미노산을 (b)에서 제조된 상기 제1-디블록된-결합-생성물 또는 선택적으로 (e)에서 제조된 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물과 결합시키는 단계, 이는 다음-블록된-결합-생성물을 형성하기 위해 펩타이드 커플링 시약을 포함하는 유기 용매에서 상기 다음-아미노산과 상기 제1-디블록된-결합-생성물 또는 상기 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 반응시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 다음-아미노산은 Fmoc에 의해 블록되는 비측쇄 아미노 그룹을 가지고 있고, 상기 다음-아미노산이 하나 이상의 측쇄 기능기를 가지고 있다면 측쇄 기능기는 보호를 필요로 하지 않거나 또는 상기 측쇄 기능기는 Fmoc를 디블록하기 위하여 사용되는 염기 시약에 안정한 보호기를 가지며;
(g) 다음-디블록된-결합-생성물을 생성하기 위하여 상기 다음-블록된-결합-생성물을 1차 또는 2차 아민과 반응시키는 단계를 포함하는 상기 다음-블록된-결합-생성물로부터 Fmoc를 디블로킹하는 단계;
(h) 선택적으로 (f) 및 (g) 단계를 반복하는 단계, 각 사이클은 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 생성하고 여기서 X 는 펩타이드의 최종 아미노산의 다음 아미노산이 결합되고 디블록될때까지의 반복 사이클의 원하는 횟수이며;
(i) N-터미널 아미노산을 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물과 결합시키는 단계, 이는 완성된(completed)-블록된-결합-생성물을 형성하기 위해 펩타이드 커플링 시약을 포함하는 유기 용매에서 N-터미널 아미노산과 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 N-터미널 아미노산은 Boc 또는 Fmoc에 의해 블록된 비측쇄 아미노 그룹을 가지며;
(j) Boc 또는 Fmoc 그룹을 완성된-블록된-결합-생성물로부터 디블로킹하는 단계, 이는 완성된-펩타이드-레진-생성물을 형성하기 위해, 완성된-블록된-결합-생성물을 Boc의 경우에는 산과, 또는 Fmoc의 경우에는 염기와 반응시키는 단계를 포함한다;
(k) 측쇄 기능기가 완성된-펩타이드-레진-생성물상에 존재한다면 완성된-펩타이드-레진-생성물의 측쇄 기능기를 선택적으로 탈보호하는 단계, 이는 탈보호된-완성된-펩타이드-레진-생성물을 형성하기 위하여 완성된-펩타이드-레진-생성물을 적절한 탈보호 시약과 반응시키는 단계를 포함하며; 그리고
(l) 펩타이드를 생성하기 위해 완성된-펩타이드-레진-생성물 또는 탈보호된-완성된-펩타이드-레진-생성물의 고체 지지체 레진으로부터 펩타이드를 분리시키는 단계, 이는 레진으로부터 펩타이드의 분리가 실제적으로 완결될 때까지 완성된-펩타이드-레진-생성물 또는 탈보호된-완성된-펩타이드-레진 생성물을 암모니아, 1차 아민 또는 2차 아민과 반응시키는 단계를 포함하고;
상기 (f) 및 (g) 단계는 펩타이드 합성에서 적어도 한 번 수행되어져야 한다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 단계 (l)의 상기 암모니아, 1차 아민 또는 2차 아민은 알코올, 및 선택적으로 비양성자성 극성 용매를 포함하는 용매내에 존재한다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 단계 (l)은 다음 단계를 더 포함한다:
용매로부터 상기 분리된 펩타이드를 침전시키는 단계;
상기 고체 지지체 레진과 상기 침전된 펩타이드를 여과하는 단계; 및
상기 펩타이드를 분리하기 위해 산성 용액에서 펩타이드를 추출하는 단계.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 제1 아미노산은 Boc-L-Thr 이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 제1 아미노산은 제1-결합-생성물로 Boc-L-Thr-레진을 생산하는 Boc-L-Thr-세슘 염이고 H-L-Thr-레진은 제1-디블록된-결합-생성물이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 단계 (j)에서 상기 Boc그룹을 디블록하기 위해 사용되는 산은 TFA이다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법에서, 상기 유기 용매는 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 클로로포름(chloroform), 또는 디메틸포름아미드(dimethylformamide)이고 상기 펩타이드 커플링 시약(coupling agent)은 디이소프로필카보디이미드(diisopropylcarbodiimide), 디시클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide), 또는 N-에틸-N′-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(N-ethyl-N′-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide)이다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법은 식 H-L-Thr-레진의 제1-디블록된-결합-생성물의 형성후에 (f) 및 (g) 단계를 6회 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 하기 아미노산들은 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-레진을 형성하기 위해 Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) 및 Fmoc-L-Cys-(Acm)의 순서로 결합된다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법은 Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-레진를 형성하기 위하여 (c) 단계에 따라 Boc-D-β-Nal을 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)에 결합시키는 단계를 포함한다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법은 식(formula) H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-레진의 완성된-펩타이드-레진 생성물을 생성하기 위하여 단계 (j)에 따라 D-β-Nal을 블로킹하는 Boc 그룹, Tyr을 보호하는 O-t-Bu 그룹 및 Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-레진의 Lys를 보호하는 Boc그룹을 동시에 디블로킹하는 단계를 포함한다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법은 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 를 생성하기 위하여 분열이 실질적으로 완결될 때까지 알코올, 및 선택적으로, 비양성자성 극성 용매를 포함하는 용매에서 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-레진을 암모니아와 반응시키는 것에 의해 고체 레진으로부터 상기 펩타이드, H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr, 를 분리시키는 단계를 포함한다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법에서 상기 알코올은 메탄올이고, 상기 극성 비양성자성 용매는 디메틸포름아미드이다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법은 H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 을 생산하기 위하여 탈보호와 고리화(cyclizing)가 실질적으로 완결될 때까지 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 를 알코올내 요오드의 용액과 반응시켜 Cys를 보호하는 Acm 그룹을 탈보호하는 단계 및 동시에 식 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 의 완성된-펩타이드-생성물의 결과적으로 탈보호된 Cys 잔기를 고리화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 방법에 의하면, 상기 펩타이드는 H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 이다.
바로 직전 방법의 바람직한 방법에서, 상기 펩타이드는 소마토스테틴 유사체이다.
본 발명의 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어의 정의는 다음과 같다:
“제1 아미노산(first amino acid)”: Boc에 의해 보호되는 비측쇄 아미노 그룹을 갖는 임의의 아미노산을 포함하며, 이는 상업적으로 시판되는 것을 사용하거나 또는 당업계에 알려진 방법에 따라 합성될 수 있으며, 예, Boc-L-Thr;
“제1-결합-생성물(first-coupled-product)”: 생성물을 나타내며, 이는 고체 지지체 레진에 부착되어 있고, 제1 아미노산을 상기 고체 지지체 레진에 결합시켜 얻어지며, 예, Boc-L-Thr-레진;
“제1-디블록된-결합-생성물(first-deblocked-coupled-product)”: 상기 제1-결합-생성물로부터 Boc 그룹의 제거 또는 디블로킹으로부터 생성되는 생성물을 나타내며, 예, H-L-Thr-레진, 여기서 상기“H”는 디블로킹 단계로부터 생성되는 비측쇄 아미노 그룹의 시판되는 수소를 나타내며;
“다음-아미노산(next-amino-acid)”: Boc 또는 Fmoc 에 의해 보호되는 비측쇄 아미노 그룹을 갖는 임의의 아미노산을 나타내며, 이는 상업적으로 구입하거나 당업계에 알려진 방법에 따라 합성될 수 있다. 단계 (c) 및 단계 (f)는 상기 단계가 1회 이상 수행되는 반복되는 사이클내에 있을 수 있으므로, 매번 단계 (c) 또는 단계 (f)는 각각 Boc 또는 Fmoc 에 의해 보호되는 비측쇄 아미노 그룹을 갖는 공지되고 합성 가능한 아미노산 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있는 다음-아미노산을 생성하며;
“(X+1)-다음-블록된-결합-생성물((X+1)-next-blocked-coupled-product)”: 고체 지지체 레진에 부착되어 있고, 다음-아미노산을 상기 다음-디블록된-결합-생성물과 결합시켜 생성되는 생성물을 나타낸다. 단계 (c) 및 (d) 그리고 단계 (f) 및 (g)는 추가적으로 다음-아미노산이 결합될 수 있는 반복되는 사이클내에 있을 수 있으므로, 상기 용어 (X+1)-다음-블록된-결합-생성물은 결합의 선행(previous) 사이클 각각으로부터 생성되는 생성물을 나타내며;
“(X+1)-다음-디블록된-결합-생성물((X+1)-next-deblocked-coupled-product)”: (X+1)-다음-블록된-결합-생성물로부터 Fmoc 그룹의 디블로킹으로부터 생성된 생성물을 나타내며;
“완성된-펩타이드-레진-생성물(completed-peptide-resin-product)”: 펩타이드 생성물을 나타내며, 이는 고체 지지체 레진에 부착되고, 상기 N-터미널 아미노산을 상기 펩타이드 사슬에 부착한 후에 그리고 상기 N-터미널 아미노산의 비측쇄 아미노 그룹을 제거 또는 디블록화한후에도 여전히 N-터미널 아미노산의 비측쇄 블로킹 그룹을 디블록하기 위해 반응에 의해 제거되지 않는 측쇄 기능성 보호기중의 어느 하나를 가지며; 및
“탈보호된-완성된-펩타이드-레진-생성물(deprotected-completed-peptide-resin-product)”: 고체 지지체 레진에 부착되고, 여기서 상기 아미노산의 측쇄 기능기의 임의의 보호기가 제거되거나 탈보호되는, 펩타이드 생성물을 나타낸다.
Boc를 디블록하기 위해 사용될 수 있는 산(acid)의 예는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 메탄 술폰산(methane sulfonic acid), 및 HCl을 포함하는 유기 용액이다.
Fmoc를 디블록하기 위해 사용될 수 있는 1차 및 2차 아민의 예는 4-(아미노디메틸)-피페리딘(4-(aminomethyl)piperidine), 피페리딘(piperidine), 디에틸아민(diethylamine), DBU 및 트리(2-아미노에틸)아민(tris(2-aminoethyl)amine)이다.
유리 아미노 그룹(RNH3 +CF3COO-, 이러한 염들은 다음 아미노산의 결합 전 또는 동안에“유리”아민(NH2)으로 전환되거나 또는 결합이 수행되지 않을 것이다)의 TFA 염을 중화하는데 사용될 수 있는 비-친핵성 염기의 예는 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine, DIEA) 및 트리에틸아민(triethylamine, TEA)이다.
아미노산의 결합 반응에 사용될 수 있는 유기 용매의 예로는 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 디클로로에탄(dicholoroethane), 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 1-메틸-2-피롤리디논(1-methyl-2-pyrrolidinone), 아세토니트릴(acetonitrile), 또는 이들의 혼합물등이 있다.
펩타이드 커플링 시약의 예에는 디이소프로필카보디이미드, 디시클로헥실카보디이미드 및 N-에틸-N′-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드와 같은 치환된 카보디이미드를 포함한다.
펩타이드 아미노 결합의 형성에 참여하는 카르복실 및 아미노 그룹은 각각“비-측쇄”카르복실 그룹 또는 아미노 그룹으로 불린다. 반면에, 펩타이드 아미노 결합의 형성에 참여하지 않는 아미노산의 임의의 작용기는“측쇄”기능기가라 불린다.
용어“염기-안정 그룹(base-stable group)”은 (1) 염기에 안정하고, 예를 들어, 4-아미노에틸-피페리딘, 피페리딘, 또는 트리-(2-아미노에틸)아민과 같은 염기, 보호기 Fmoc를 제거하기 위하여 일반적으로 사용되는 염기, 에 의해 제거되지 않을 수 있으며, (2) 트리플루오로아세트산과 같은 산, 또는, 촉매 수소화 같은, 다른 수단에 의해 제거될 수 있는, 아미노산의 기능기를 보호하기 위하여 사용되는 보호기를 나타내는 것이다.
기호“Fmoc”및“Boc”는 각각 9-플루오레닐 메톡시카르보닐(9-fluorenyl methoxycarbonyl) 및 t-부틸옥시카르보닐(t-butyloxycarbonyl)을 나타내기 위하여 여기와 부가된 청구항에서 사용하었다.
상기 설명된 방법은 펩타이드, 바람직하게는 다음 식 H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 를 갖는 옥타펩타이드(octapeptide) Lanreotide? 같은 소마토스테틴 유사체를 제조하는 데에 사용될 수 있다. H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 는 합성될 때, Cys, Lys 및 Tyr의 곁사슬 기능기를 블록하기 위하여 사용되는 염기-안정 보호기는 각각 아세트아미도메틸(acetoamidomethyl, Acm), Boc, 및 t-부틸일 수 있다. Acm 는 바람직하게는 Cys 이다.
“소마토스테틴”유사체가 의미하는 것은 소마토스테틴의 그것과 생물학적 활성이 유사(즉, 작용제, agonist) 또는 반대(즉, 길항체, antagonist)되는 것을 나타내는 펩타이드이다.
식 H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 에서, 통상적인 세 문자의 아미노산 기호(예, Lys)의 각각은 아미노산의 구조적 잔기를 나타낸다. 예를 들면, 상기 식에서 Lys 기호는 -NH-CH((CH2)4NH2)-CO- 를 나타낸다. 기호 D-β-Nal은 아미노산 잔기 D-2-나프틸알라닌일(naphthylalaninyl)을 나타낸다. 괄호는 괄호내의 펩타이드의 아미노산은 환형이라는 것을 나타내면서, 펩타이드의 두 개의 Cys 잔기의 자유 티올(free thiol)을 붙인 디설파이드 결합(disulfide bond)을 나타낸다.
당업자는 본 발명의 상세한 설명을 기초로 본 발명을 최대한 응용할 수 있다.
그 밖에 정의되지 않았다면, 여기서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 업계에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 공통적으로 이해되는것과 같은 의미를 가진다. 또한, 여기서 언급된 모든 공개물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고 자료들은 참고로 삽입되었다.
펩타이드는 본 발명의 방법에 의해 다음과 같은 과정으로 제조할 수 있다.
세슘 카보네이트 0.5 몰 당량의 수용액을 1 몰 당량의 Boc-AA1(Bachem California, Torrance, CA) 용액에 서서히 첨가하고, 여기서 AA1은 C-터미널 아미노산에 해당하고, 알코올, 바람직하게는 메탄올에 용해되어 있다. 결과 혼합물을 상온에서 약 한 시간동안 교반하고, 이어서 Boc-AA1의 세슘염 건조 분말을 생성한하면서 모든 알코올 및 물을 갑압하에 제거한다. 메리필드 레진, 1.0 당량(클로로메틸화된 폴리스티렌; 200 내지 400 메시(mesh), 1.3 meq/g의 염소 주입, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky or Polymer Laboratories, Church Stretton, England)을 염소화된 용매, 바람직하게는 디클로로메탄(DCM), 알코올, 바람직하게는 메탄올, 및 극성 비양성자성 용매, 바람직하게는 디메틸포름아미드(DMF)로 세척한다. 상기 Boc-AA1 세슘염 분말을 건조 극성 비양성자성 용매, 바람직하게는 DMF에 용해하고, 상기 용액을 상기 세척된 레진과 조합한다. 슬러리는 질소같은 불활성 대기하에 약 45 ~ 65 ℃, 바람직하게는 50 ~ 60 ℃ 에서 약 48 내지 106 시간, 바람직하게는 85 내지 90 시간동안 서서히 혼합한다. 상기 레진을 여과하고 극성 비양성자성 용매, 바람직하게는 DMF, 물, 및 마지막으로 메탄올과 같은 알코올로 잘 세척한다. 상기 Boc-AA1-레진을 감압하에 건조한다.
상기 Boc-AA1-레진은 굵게 소결된 글래스 필터 바닥을 가진 글래스 반응기에 첨가한다. 상기 레진을 DCM 같은 염소화된 용매로 세척하고, 유기산, 바람직하게는 25 % TFA/DCM 으로 디블록하고, DCM 같은 염소화된 용매 및 메탄올과 같은 알코올로 간단히 세척하고, 유기 염기, 바람직하게는 DCM 내 트리에틸아민으로 중화하고, 디블록된 AA1-레진을 생성하기 위해 다시 DCM 및 DMF 같은 극성 비양성자성 용매로 세척한다.
이어서 상기 디블록된 AA1-레진을 선택적으로 임의의 원하는 수의 아미노산과 결합한다. 이어지는 아미노산이 α-아미노 그룹상에서 보호된 Fmoc(Fmoc-AAx) 라면, 곁사슬 그룹은 보호를 필요로 하지 않거나(Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe 또는 Fmoc-Threonine 처럼) 곁사슬은 제거 염기에 내성이 있는 그룹에 의해 보호되어야 한다. 상기 Fmoc-AAx 의 몰 과잉(molar excess)(여기서 x 는 C-터미널로부터 세어진, 펩타이드내 아미노산의 서열 수이다.)은 약 60 분 동안 DCM/DMF 의 혼합물에서 디이소프로필카보디이미드(DIC)같은 펩타이드 커플링 시약을 사용하여 디블록된 AA1-레진과 결합된다. 상기 결합된 레진을 Fmoc-AAx-AA1-레진을 생산하기 위하여 DMF, 알코올 및 DCM으로 세척한다. 결합은 Kaiser ninhydrin 방법으로 체크될 수 있다. 이어서 Fmoc-AAx-AA1-레진을 DMF로 1회 세척한 뒤, AAx-AA1-레진을 생산하기 위하여 DMF내 피페리딘 같은 유기 용매내 염기 용액으로 디블록한다. 그리고나서, 상기 AAx-AA1-레진을 DMF로 세척하고 메탄올과 같은 알코올 및 DCM 모두로 수 회 세척한다. 상기 AAx-AA1-레진을 DMF 로 약 3 분 동안 1 회, 3 회, 바람직하게는 각각 약 2 분 동안 이소프로판올(IPA), 그리고 3 회, 바람직하게는 각각 약 2 분 동안 DCM 으로 세척한다. 그러면 상기 레진은 상기에서 설명된 바와 같이 Fmoc 보호된 아미노산 또는 아래에서 설명된 Boc 아미노산중의 하나와 더 결합할 준비가 된다.
유사하게, 상기 탈보호된 AA1-레진과 결합된 임의의 이어지는 아미노산이 α-아미노 그룹(Boc-AAx)상의 Boc 보호로 선택된다면, 또한 곁사슬 그룹은 보호를 필요로 하지 않거나(Boc-Gly, Boc-Ala, Boc-Phe 또는 Boc-Threonine 같은) 또는 상기 곁사슬은 Boc-Cys(S-Acm)과 같은 산 및 염기 모두에 의한 제거에 내성이 있는 그룹으로 보호되어야 한다. Boc-AAx 은, 선택되었다면, 상기에서 설명된 Fmoc 아미노산과 동일한 시약 및 용매와 결합되고 Kaiser ninhydrin 방법으로 결합의 완결을 체크할 수 있다. 이어서, 상기 Boc-AAx-AA1-레진은 CF3CO- H+AAx-AA1-레진을 생산하기 위해 DCM 내 TFA 와 같은 유기 용매내 산용액으로 디블록된다. 이어서, 이러한 레진을 DCM 같은 염소화된 용매 및 메탄올 같은 알코올로 수 회 세척하고, DCM에서 트리에틸아민과 같은 비친핵성 염기로 중화한 뒤, AAx-AA1-레진을 생성하기 위해 DCM 같은 염소화된 용매로 몇 회 더 세척한다. 그러면, 상기 레진은 상기에서 설명된대로 Boc 또는 Fmoc 보호된 아미노산중의 하나와 더 결합될 준비가 된다.
원하는 펩타이드 서열 및 사용된 α-아미노 블록된 아미노산의 형태에 따라, Fmoc 보호되든지 또는 Boc 보호되든지, α-아미노 그룹상에서 Fmoc를 디블록하기위하여 사용되는 염기 또는 α-아미노 그룹상에서 Boc를 디블록하기위하여 사용되는 산중의 하나에 의해 제거될 수 있는 보호기를 가진 곁사슬이 있는 서열에서 아미노산이 필요할 때까지, 앞의 결합 과정의 적절한 조합이 수행될 수 있다. 이러한 보호된 아미노산은 N-α-Boc-N′-ε-Fmoc-Lysine 또는 N-α-Fmoc-N′-ε-Boc-Lysine일 수 있다. 이러한 것이 일어날 때, 선택된 이어지는 아미노산의 α-아미노 블로킹 그룹은 N-터미널 아미노산까지 그 위치를 위해 선택된 측쇄 그룹 보호와 양립할 수 있다. 즉, 상기 측쇄 보호기는 상기 이어지는 α-아미노 블로킹 그룹을 디블록하기 위해 사용되는 디블로킹 시약에 대하여 안정해야 한다. 상기 N-터미널 아미노산에 대하여, 상기 N-터미널 아미노산의 디블로킹은 더 이상 아미노산이 첨가되지 않기 때문에 펩타이드 합성 전략에 대한 역효과 없이 상기 보호된 곁사슬의 일부를 동시에 탈보호할 수 있으므로 Boc 또는 Fmoc 중의 하나는 α-아미노 블로킹 그룹으로 사용될 수 있다.
그리고나서, 여전히 레진에 부착되어 있는 완성된 펩타이드 사슬은 탈보호되고 디블록되어야 한다. 보호기에 안정한 임의의 염기 및 N-터미널 아미노산의 α-아미노 블로킹 그룹을 제거하기 위하여, 적용가능하다면, 상기 펩타이드-레진은 DCM내 TFA 와 같은 유기 용매내 산으로 처리될 수 있다. 보호기에 안정한 임의의 산 및 N-터미널 아미노산의 α-아미노 블로킹 그룹을 제거하기 위하여, 적용가능하다면, 상기 펩타이드-레진은 DMF 내 피페리딘과 같은 유기 염기로 처리될 수 있다. 또는 산에 안정한 그룹은 암모니아 또는 아민 염기에 의한 펩타이드의 이어지는 분리에서 제거에 대하여 남아있을 수 있다. 그리고나서 상기 탈보호된 펩타이드-레진을 DCM 같은 염소화된 용매 및 메탄올과 같은 알코올로 세척하고, 감압하에 일정 질량까지 건조한다.
상기 펩타이드는 레진으로부터 분리되고 상기 C-터미널은 3:1 메탄올/DMF 에 펩타이드-레진을 부유시켜(suspending) 아민으로 전환될 수 있다. 상기 서스펜젼을 질소하에 약 <10 ℃ 로 냉각하고, 무수 암모니아 가스를 온도를 약 10 ℃이하로 유지하면서 상기 용액이 포화될 때까지 용매 표면 아래로 첨가한다. 슬러리는 온도가 약 20 ℃로 증가하도록 하면서 약 24 시간 동안 서서히 혼합한다. 상기 반응은 펩타이드에 따라 적당한 조건하에서 HPLC로 메틸 에스테르 중간체가 사라지는 것을 모니터링함으로써 완결을 확인할 수 있다. 상기 반응을 냉각하고, 필요하다면, HPLC상에서 메틸 에스테르의 면적이 원하는 생성물 피크의 면적에 대하여 10 %이하가 될 때까지, 무수 암모니아를 더 첨가한다. 상기 슬러리를 약 10 ℃이하로 냉각되고, 펩타이드가 침전되도록 하룻밤동안 혼합을 계속한다. 상기 침전물과 레진을 여과하고 냉각된 메탄올로 세척한다. 상기 침전물과 레진을 감압하에 건조하고, 상기 생성물을 아세트산 수용액으로 레진으로부터 추출한다.
펩타이드가 그 서열내에 보호된 Cys 잔기를 포함하고 있다면, 상기 Cys의 티올 그룹은 다음의 과정에 의해 탈보호 및 고리화될 수 있다. Acm-보호된 Cys 그룹을 갖는 펩타이드를 질소 대기하에 아세트산 수용액에 용해한다. 상기 용액을 빠르게 교반하고, 알코올내 요오드 용액을 일부분으로 첨가한다. 상기 혼합물을 교반하고 HPLC 로 탈보호의 완결을 확인하고 그리고나서 무색의 종말점까지 2 % 소듐 티오설페이드(sodium thiosulfate) 용액으로 적정하여 퀀칭(quenching)한다. 조 혼합물(crude mixture)을 0.1 암모늄 아세테이트/아세토니트릴 gradient 버퍼로 충진된 C8 상에서 preparative 크로마토그래피로 정제하고, 0.25 N 아세트산/아세토니트릴 gradient로 충진된 C8 에서 탈염하고, 원하는 펩타이드를 얻기위해 동결건조하였다.
하기 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것일 뿐 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
< 실시예 1>
H 2 -D-β- Nal -[ Cys - Tyr -D- Trp - Lys - Val - Cys ]- Thr - NH 2
A) Boc -L- Thr -레진
2.5 ㎖의 물에 2.58 g의 세슘 카보네이트가 용해된 용액을 7 ㎖의 메탄올에 용해된 Boc-L-Threonine(Bachem California, Torrance, CA) 3.48 g의 용액에 서서히 첨가하였다. 결과 혼합물을 약 1 시간 동안 상온에서 교반하였고, 이어서 Boc-L-Threonine 세슘 염의 건조 분말을 생성하면서 모든 메탄올과 물을 감압하에 제거하였다. 10 g의 메리필드 레진(클로로메틸화된 폴리스티렌; 200 내지 400 메시, 1.3 meq/g의 염소 주입, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky)을 디클로로메탄(DCM), 메탄올, 및 디메틸포름아미드(DMF)(각 2×70 ㎖)로 세척하였다. 상기 Boc-L-Threonine 세슘 염 분말을 건조 DMF 60 ㎖에 용해하였고, 상기 용액을 상기 세척된 레진과 조합하였다. 상기 슬러리를 질소 대기하에 약 85 내지 90 시간동안 50 내지 60 ℃에서 서서히 혼합하였다. 상기 레진을 여과하고, DMF, 탈이온수, 및 마지막으로 메탄올로 세척하였다. 상기 Boc-Threonine 레진을 약 40 ℃에서 감압하에 건조하였다(Threonine 주입=건조 레진에 대해 0.85±0.15 meq/g ).
B) H-D-β- Nal - Cys ( Acm )- Tyr -D- Trp - Lys - Val - Cys ( Acm )- Thr 레진
단계 A 에서 제조된 Boc-Threonine 레진 2.0 g을 굵게 소결된 글래스 필터 바닥을 가진 50 ㎖ 글래스 반응기(batch scale=1.74 mmole)에 첨가하였다. 상기 레진을 DCM(20 ㎖)으로 각각 5 분동안 2 회 세척하였고, 20 % TFA/DCM(30 ㎖)으로 약 2 분동안 1 회 및 약 25 분 동안 1 회 디블록하고, DCM(20 ㎖), 이소프로판올(IPA)(20 ㎖), 및 DCM(20 ㎖)로 약 2 분 동안 3 회 세척하고, 10 % 트리에틸아민/DCM(20 ㎖)으로 약 5 분 동안 2 회 중화하였으며, 약 2 분동안 DCM으로 3 회 세척하고, 약 5 분 동안 DMF(20 ㎖)로 1 회 세척하였다.
상기 디블록된 레진을 2:1 DCM/DMF 14 ㎖ 에서 약 1 시간 동안 1.8 grams (4.35 mmole, 2.5eq.)의 Fmoc-L-Cysteine(Acm)(Bachem, CA) 및 683 ㎕(4.35 mmole,
2.5 eq) 디이소프로필카보디이미드(DIC) 와 결합하였다. 상기 결합된 레진을 약 3 분 동안 DMF(20 ㎖)로 1 회, 약 2 분동안 이소프로판올(IPA)로 3 회, 및 약 2 분 동안 DCM(20 ㎖)로 3 회 세척하였다. 상기 결합은 Kaiser ninhydrin 방법으로 확인하였다.
상기 결합된 레진을 DMF 로 1 회 세척하고나서 DMF 내 피페리딘 용액으로 디블록하였다. 이어서, 상기 디블록된 결합 레진을 DMF 및 메탄올 및 DCM 모두로 수 회 세척하였다. 상기 결합 레진을 DMF(20 ㎖)로 약 3 분 동안 1 회, 이소프로판올(IPA)(20 ㎖)로 약 2 분 동안 3 회 및 각각 DCM(20 ㎖)으로 약 2 분 동안 3 회 세척하였다. 상기 결합은 Kaiser ninhydrin 방법으로 확인하였다.
하기의 보호된 아미노산의 각각은 DMF/DCM 내 DIC를 사용하여 세척된 레진으로 결합되고 상기에 설명한다음의 순서로 디블록된다: Fmoc-L-Valine, Fmoc-L-Lysine(Boc), Fmoc-D-Tryptophan, Fmoc-L-Tyrosine(O-t-Bu), 및 Fmoc-L-Cysteine(Acm)(모두 Bachem California 에서 구입), Boc-D-2-Naphthylalanine (Synthetech, Albany, OR).
상기 완성된 펩타이드 사슬을 디블록하고 약 2 분 및 약 25 분 동안 75:20:5 DCM/TFA/아니솔(anisole)(30 ㎖)로 2 번 탈보호하며, DCM(20 ㎖), IPA(10 ㎖), 및 DCM(20 ㎖) 각각으로 약 2 분 동안 3 회 세척하고, 10 % 트리에틸아민/DCM(20 ㎖)로 약 5 분 동안 2 회 중화하였고, DCM(20 ㎖) 및 메탄올(20 ㎖)로 약 2 분 동안 3 회 세척하였다. 상기 레진을 감압하에 건조하였다. 건조 중량=3.91 g (이론값의 103 %).
C) H-D-β- Nal - Cys -( Acm )- Tyr -D- Trp - Lys - Val - Cys ( Acm )- Thr - NH 2
단계 B 로부터 얻은 레진에 로드된(loaded) 2.93 g 의 펩타이드(1.3 mmole eq.)를 3:1 메탄올/DMF 50 ㎖ 에 서스펜드하였다. 상기 서스펜젼은 질소하에 약 <10 ℃ 로 냉각되고, 무수 암모니아 가스를 온도를 약 10 ℃이하로 유지하면서 포화될 때까지 기포화하였다. 슬러리를 온도를 약 20 ℃로 상승시키면서 약 24 시간 동안 서서히 혼합하였다. 상기 반응은 HPLC로 메틸 에스테르 중간체가 사라지는 것을 모니터링함으로써 완결을 확인하였다(메틸 에스테르의 Rt.~ 14 분 vs. 아미드 생성물에 대한 Rt.~9.3 분, VYDAC?, 5 μ 100 Å, 26 % CH3CN/0.1 % TFA Isocratic 의 C18, 1 ㎖/min, 220 nm). 상기 반응은 냉각되고, HPLC상에서 메틸 에스테르의 면적이 생성물 피크의 면적의 10 %이하가 될 때까지, 무수 암모니아를 더 첨가하였다. 상기 슬러리를 약 10 ℃이하로 냉각하였고, 펩타이드가 침전되도록 하룻밤동안 계속 혼합하였다. 상기 침전물과 레진을 여과하였고 냉각된 메탄올 15 ㎖로 세척하였다. 상기 침전물과 레진을 감압하에 건조하였고, 상기 생성물을 50 % 아세트산 수용액으로 레진으로부터 추출하였다. HPLC 분석은 혼합물내에 상기 제목의 생성물이 870 mg(0.70 mmoles)존재하는 것을 보였다(Isocratic HPLC system에서96% 순도).
D) H-D-β- Nal -[ Cys - Tyr -D- Trp - Lys - Val - Cys ]- Thr - NH 2
단계 C 에서 제조된 펩타이드 500 mg(0.40 mmole)을 4 % 아세트산 300 ㎖에 용해하였고 질소 대기하에서 약 55 ℃로 가열하였다. 상기 용액을 빠르게 혼합하고, 메탄올 7.7 ㎖(0.60 mmoles)내 요오드의 용액 2 % w/v 를 일부분으로 첨가하였다. 상기 혼합물을 약 15 분 동안 교반하고 이어서 무색의 종말점(~2 ㎖)까지 2 % 소듐 티오설페이트 용액으로 적정에 의해 퀀칭하였다. 상기 혼합물을 상온까지 냉각하였고 여과하였다. 조 혼합물(crude mixture)을 0.1 암모늄 아세테이트/아세토니트릴 gradient 버퍼로 충진된 C8 상에서 preparative 크로마토그래피로 정제하고, 0.25 N 아세트산/아세토니트릴 gradient로 충진된 YMC C8 에서 탈염한 뒤, 99% 순도로 원하는 펩타이드 350 ㎎을 얻기 위해 동결건조하였다.
상기 기재된 본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자는 본 발명의 근본적 특징을 용이하게 이해할 수 있고, 이의 기술적 사상을 해치지 않으면서 다양한 사용 및 조건에 적용시키기 위해 다양한 수정이나 변형을 할 수 있다. 그러므로, 그 밖에 다른 실시예도 청구범위에 포함된다.

Claims (15)

  1. 하기 식의 펩타이드를 제조하는 방법에 있어서,
    H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
    상기 방법은,
    (a) 제1-결합-생성물을 형성하기 위하여 제1 아미노산을 에스테르 결합으로 고체 지지체 레진에 부착하는 단계, 이는 (i) 제1 아미노산의 세슘염을 형성하기 위하여 세슘 카보네이트 수용액을 제1 아미노산의 알코올 용액과 반응시키는 단계, (ii) 상기 제1 아미노산의 유리 세슘염 용매를 얻는 단계; (iii) 제1-결합-생성물을 형성하기 위하여 극성 비양성자성 용매에서 상기 고체 지지체 레진과 상기 제1 아미노산의 세슘염을 반응시키는 단계를 포함하고;
    여기서 상기 제1 아미노산은 상기 펩타이드의 C-터미널 아미노산에 해당하는 Boc-L-Thr이고, 상기 고체 지지체 레진은 클로로메틸화된 폴리스티렌 레진이며;
    (b) 제1-디블록된-결합-생성물을 형성하기 위하여 산(acid)으로 상기 제1-결합-생성물로부터 Boc를 디블로킹하는 단계;
    (c) 다음 아미노산을 α-아미노기의 Boc 또는 Fmoc 보호로 상기 제1-디블록된-결합-생성물에 결합시키는 단계, 이는 다음-블록된-결합-생성물을 형성하기 위하여 펩타이드 커플링 시약을 포함하는 유기 용매에서 상기 다음-아미노산과 상기 제1-디블록된-결합-생성물을 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 다음-아미노산은 Boc 에 의해 블록된 비측쇄 아미노 그룹을 갖고, 상기 다음-아미노산이 하나 이상의 측쇄 기능기를 갖는다면 상기 측쇄 기능기는 보호가 필요없거나 또는 측쇄 기능기는 각각 Boc 및 Fmoc를 디블록하기 위하여 사용되는 산 및 염기 시약에 안정한 보호기를 갖으며;
    (d) 상기 다음-블록된-결합-생성물로부터 상기 Boc 를 디블로킹하는 단계, 이는 다음-디블록된-결합-생성물을 생성하기 위하여 상기 다음-블록된-결합-생성물과 산을 반응시키는 단계를 포함하며;
    (e) 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계, 각 사이클은 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 형성하고, 여기서 X 는 원하는 사이클 반복의 횟수이며;
    (f) 다음-아미노산을 (b)로부터 얻어진 상기 제1-디블록된-결합-생성물, 또는 (e)로부터 얻어진 상기 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물에 결합시키는 단계, 이는 다음-블록된-결합-생성물을 형성하기 위해 펩타이드 커플링 시약을 포함하는 유기 용매에서 상기 다음-아미노산과 상기 제1-디블록된-결합-생성물 또는 상기 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 반응시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 다음 아미노산은 Fmoc에 의해 블록된 비측쇄 아미노 그룹을 갖고, 상기 다음-아미노산이 하나 이상의 측쇄 기능기를 갖는다면 측쇄 기능기는 보호가 필요없거나 또는 상기 측쇄 기능기는 Fmoc를 디블록하기 위해 사용되는 염기 시약에 안정한 보호기를 갖으며;
    (g) 상기 다음-블록된-결합-생성물로부터 Fmoc를 디블로킹하는 단계, 이는 다음-디블록된-결합-생성물을 생성하기 위해 상기 다음-블록된-결합-생성물과 1 차 또는 2 차 아민을 반응시키는 단계를 포함하며;
    (h) 단계 (f) 및 (g) 를 반복하는 단계, 각 사이클은 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 형성하고, 여기서 X 는 상기 펩타이드의 N-터미널 아미노산 쪽의 끝에서 두번째 아미노산이 결합 및 디블록될때까지, 사이클 반복의 원하는 횟수이며;
    (i) N-터미널 아미노산을 상기 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물과 결합시키는 단계, 이는 완성된-블록된-결합-생성물을 형성하기 위하여 펩타이드 커플링 시약을 포함하는 유기 용매에서 N-터미널 아미노산과 (X+1)-다음-디블록된-결합-생성물을 반응시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 N-터미널-아미노산은 Boc 또는 Fmoc에 의해 블록되는 비측쇄 아미노 그룹을 가지며;
    (j) Boc 또는 Fmoc 그룹을 상기 완성된-블록된-결합-생성물로부터 디블로킹하는 단계, 이는 완성된-펩타이드-레진-생성물을 형성하기 위해, 완성된-블록된-결합-생성물을 Boc의 경우에는 산, 또는 Fmoc의 경우에는 염기와 반응시키는 단계를 포함하며;
    (k) 상기 완성된-펩타이드-레진-생성물상에 측쇄 기능기가 존재한다면 상기 완성된-펩타이드-레진-생성물의 측쇄 기능기를 탈보호하는 단계, 이는 탈보호된-완성된-펩타이드-레진-생성물을 형성하기 위하여 상기 완성된-펩타이드-레진-생성물을 적절한 탈보호 시약과 반응시키는 단계를 포함하며; 그리고
    (l) 펩타이드를 생성하기 위하여 상기 펩타이드를 상기 완성된-펩타이드-레진-생성물 또는 상기 탈보호된-완성된-펩타이드-레진-생성물의 고체 지지체 레진으로부터 분리시키는 단계, 이는 레진으로부터 펩타이드의 분리가 완결될때까지 상기 완성된-펩타이드-레진-생성물 또는 상기 탈보호된-완성된-펩타이드-레진 생성물을 암모니아, 1차 아민 또는 2차 아민과 반응시키는 단계를 포함하며;
    단계 (f) 및 (g)는 식 H-L-Thr-레진의 제1-디블록된-결합-생성물의 형성 후에 6 회 수행되고, 여기서 하기의 아미노산들이 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-레진을 형성하기 위하여 Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) 및 Fmoc-L-Cys(Acm)의 순서로 결합되고,
    Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-레진을 형성하기 위하여 상기 단계 (i)에 따라 Boc-D-β-Nal 을 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-레진에 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (l)의 암모니아, 1차 아민 또는 2차 아민은 알코올 및 비양성자성 극성 용매를 포함하는 용매내 존재하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (l)은 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법:
    (i) 용매로부터 분리된 펩타이드를 침전시키는 단계;
    (ii) 상기 고체 지지체 레진 및 상기 침전된 펩타이드를 여과하는 단계;
    (iii) 상기 펩타이드를 분리하기 위해 산성 용액에서 펩타이드를 추출하는 단계.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 아미노산이 제1-결합-생성물로 Boc-L-Thr-레진을 생성하는 Boc-L-Thr-세슘 염이고 H-L-Thr-레진이 제1-디블록된-결합-생성물인 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    단계 (j)에서 Boc 그룹을 디블록하기 위하여 사용되는 상기 산이 TFA 인 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유기 용매는 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 디메틸포름아미드이고 상기 펩타이드 커플링 시약은 디이소프로필카보디이미드, 디시클로헥실카보디이미드, 또는 N-에틸-N′-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드인 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    식 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-레진의 상기 완성된-펩타이드-레진-생성물을 생성하기 위하여 단계 (j)에 따라 D-β-Nal을 블로킹하는 Boc 그룹, Tyr을 보호하는 O-t-Bu 그룹 및 Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-레진의 Lys를 보호하는 Boc 그룹을 동시에 디블로킹하는 단계를 포함하는 펩타이드의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2를 생성하기 위하여 분리이 완결될 때까지 알코올 및 비양성자성 극성 용매를 포함하는 용매에서 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-레진을 암모니아와 반응시킴으로써 고체 레진으로부터 펩타이드, H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr, 를 분리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올이고 상기 극성 비양성자성 용매는 디메틸포름아미드인 것을 특징으로 하는 펩타이드의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 를 생성하기 위하여 상기 탈보호 및 고리화가 완결될 때까지 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 를 알코올내 요오드의 용액과 반응시킴으로써 Cys를 보호하는 Acm 를 탈보호하는 단계 및 식 H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 의 상기 완성된-펩타이드-레진-생성물의 결과적으로 탈보호된 Cys 잔기를 동시에 고리화하는 단계를 포함하는 펩타이드의 제조 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
KR1020097012968A 2006-11-21 2007-08-31 Ｂｏｃ 및 Ｆｍｏｃ 고상 펩타이드 합성 KR101237561B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IE20060841A IE20060841A1 (en) 2006-11-21 2006-11-21 Boc and fmoc solid phase peptide synthesis
IE2006/0841 2006-11-21
PCT/IE2007/000080 WO2008062391A2 (en) 2006-11-21 2007-08-31 Boc and fmoc solid phase peptide synthesis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090100369A KR20090100369A (ko) 2009-09-23
KR101237561B1 true KR101237561B1 (ko) 2013-02-27

Family

ID=39430143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097012968A KR101237561B1 (ko) 2006-11-21 2007-08-31 Ｂｏｃ 및 Ｆｍｏｃ 고상 펩타이드 합성

Country Status (21)

Country Link
US (3) US8383770B2 (ko)
EP (1) EP2084176B1 (ko)
JP (3) JP5281581B2 (ko)
KR (1) KR101237561B1 (ko)
CN (2) CN101541824A (ko)
AU (1) AU2007323057B2 (ko)
BR (1) BRPI0718996B8 (ko)
CA (1) CA2670209C (ko)
DK (1) DK2084176T3 (ko)
ES (1) ES2682103T3 (ko)
HK (1) HK1209433A1 (ko)
HU (1) HUE038926T2 (ko)
IE (2) IE20060841A1 (ko)
IL (2) IL198451A0 (ko)
MX (1) MX2009005377A (ko)
NO (1) NO344798B1 (ko)
NZ (1) NZ577395A (ko)
PL (1) PL2084176T3 (ko)
PT (1) PT2084176T (ko)
RU (1) RU2439075C2 (ko)
WO (1) WO2008062391A2 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602005023429D1 (de) 2004-10-19 2010-10-21 Lonza Ag Verfahren zur festphasen-peptidsynthese
IE20060841A1 (en) * 2006-11-21 2008-05-28 Ipsen Mfg Ireland Ltd Boc and fmoc solid phase peptide synthesis
CN101628929B (zh) * 2009-08-27 2014-09-17 中国人民解放军防化学院 一种固相合成侧链保护肽链的新方法
CN102286078A (zh) * 2011-07-13 2011-12-21 中国药科大学 一种多肽hm-3的制备方法
EP2664374A1 (en) * 2012-05-15 2013-11-20 F. Hoffmann-La Roche AG Lysin-glutamic acid dipeptide derivatives
ES2924473T3 (es) 2015-12-21 2022-10-07 Univ Texas Tech System Sistema y procedimiento de síntesis de péptidos GAP en fase de solución
WO2017212390A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Emcure Pharmaceuticals Ltd, Process for lanreotide acetate preparation
CN108059667B (zh) * 2018-02-10 2018-11-13 润辉生物技术（威海）有限公司 一种兰瑞肽的固相合成方法
CN108440654B (zh) * 2018-02-24 2020-09-04 暨南大学 一种抗菌活性环六肽Thermoactinoamide A的合成方法
WO2020159837A1 (en) 2019-02-01 2020-08-06 Gap Peptides Llc Synthesis strategy for gap protecting group
US12024537B2 (en) 2018-05-31 2024-07-02 Sederma Compositions and methods for chemical synthesis
MX2020012629A (es) 2018-05-31 2021-01-29 Sederma Sa Metodo para sintesis de peptido en fase de solucion y estrategias protectoras de la misma.
KR20230175279A (ko) 2021-04-23 2023-12-29 쎄데르마 펩티드의 화학적 합성을 위한 조성물
TW202402781A (zh) * 2022-04-08 2024-01-16 日商中外製藥股份有限公司 胜肽化合物的製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737487A (en) 1984-11-01 1988-04-12 Beecham Group P.L.C. VIP type peptides
WO2006119388A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Novetide, Ltd. Methods for the production of peptide having a c-terminal amide

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4411890A (en) * 1981-04-14 1983-10-25 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4307083A (en) * 1978-10-16 1981-12-22 The Salk Institute For Biological Studies LRF Antagonists
IE20060841A1 (en) * 2006-11-21 2008-05-28 Ipsen Mfg Ireland Ltd Boc and fmoc solid phase peptide synthesis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737487A (en) 1984-11-01 1988-04-12 Beecham Group P.L.C. VIP type peptides
WO2006119388A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Novetide, Ltd. Methods for the production of peptide having a c-terminal amide

Also Published As

Publication number Publication date
NO344798B1 (no) 2020-05-04
JP5798149B2 (ja) 2015-10-21
US20130338337A1 (en) 2013-12-19
JP2016000749A (ja) 2016-01-07
US9090654B2 (en) 2015-07-28
CN101541824A (zh) 2009-09-23
BRPI0718996B1 (pt) 2019-08-27
JP2013163693A (ja) 2013-08-22
RU2009122664A (ru) 2010-12-27
HK1209433A1 (en) 2016-04-01
AU2007323057B2 (en) 2011-07-28
MX2009005377A (es) 2009-09-28
JP5281581B2 (ja) 2013-09-04
JP2010510304A (ja) 2010-04-02
IES20070687A2 (en) 2008-05-14
CA2670209C (en) 2012-04-10
CN104530190A (zh) 2015-04-22
DK2084176T3 (en) 2018-08-27
ES2682103T3 (es) 2018-09-18
IE20060841A1 (en) 2008-05-28
WO2008062391A2 (en) 2008-05-29
NZ577395A (en) 2011-10-28
IL198451A0 (en) 2010-02-17
JP6141367B2 (ja) 2017-06-07
EP2084176A2 (en) 2009-08-05
US20150284424A1 (en) 2015-10-08
PL2084176T3 (pl) 2018-11-30
PT2084176T (pt) 2018-08-01
WO2008062391A3 (en) 2008-10-02
AU2007323057A1 (en) 2008-05-29
EP2084176B1 (en) 2018-05-30
BRPI0718996B8 (pt) 2021-05-25
KR20090100369A (ko) 2009-09-23
US20100160604A1 (en) 2010-06-24
RU2439075C2 (ru) 2012-01-10
IL243230A0 (en) 2016-02-29
CA2670209A1 (en) 2008-05-29
HUE038926T2 (hu) 2018-12-28
US8383770B2 (en) 2013-02-26
BRPI0718996A2 (pt) 2014-02-18
NO20092247L (no) 2009-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101237561B1 (ko) Ｂｏｃ 및 Ｆｍｏｃ 고상 펩타이드 합성
TW201024316A (en) Process for the preparation of Pramlintide
KR20100036326A (ko) 프람린타이드의 생산 방법
WO2005087794A1 (en) Process for octreotide synthesis
WO2021070202A1 (en) A method for preparing glp-1 analogue by solid-phase peptide synthesis
EP3414257B1 (en) Method for preparation of liraglutide using bal linker
EP3010930B1 (en) Peptide-resin conjugate and use thereof
IL173272A (en) Preparation of somatostatin peptides
CN107778351B (zh) 一种全固相合成奥曲肽的方法
CN114805480A (zh) 一种奥曲肽的制备方法
WO2021007703A1 (en) A method for preparing liraglutide via a solid phase peptide synthesis
KR100991096B1 (ko) 고체상 합성법을 이용한 옥트레오타이드의 제조방법
IES84882Y1 (en) Boc and fmoc solid phase peptide synthesis
IE20070687U1 (en) Boc and fmoc solid phase peptide synthesis
WO2019218382A1 (zh) 一种含丙氨酸的首尾环肽合成方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160119

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170119

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180118

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190116

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200115

Year of fee payment: 8