TW202402781A - 胜肽化合物的製造方法 - Google Patents

Abstract

一種藉由固相法製造胜肽化合物的方法，該方法包括：準備擔載於固相，具有胺基的第一胺基酸或具有胺基的第一胜肽之準備步驟；以及將第一胺基酸或第一胜肽、與具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胺基酸、或者具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胜肽，在預定的碳二亞胺系縮合劑及添加劑的存在下進行縮合之縮合步驟。

Description

胜肽化合物的製造方法

本發明關於一種胜肽化合物的製造方法。

胜肽為連結多個胺基酸的分子，其對生物在進行生命活動上具有不可欠缺的作用。伴隨著生物學、化學的發展加深對胜肽的理解，同時盛行著旨在開發新穎醫藥的天然胜肽的利用、或藉由胜肽的人工設計進行機能性胜肽的研究、開發等(非專利文獻1)。尤其是，已有胜肽的環化、或構成胺基酸的N-烷基化，特別是N-甲基化有助於提高膜通透性或代謝穩定性等(非專利文獻2、非專利文獻3)、或者作為細胞內移動或口服劑開發關鍵之類藥物(drug-like)的環狀胜肽結構的見解或考察的報告，因而越來越提高該結構在胜肽新創藥物中的重要性的認知度(專利文獻1)。

胜肽合成是藉由醯胺鍵的形成以延長成期望的序列而達成。作為更具體的方法，可舉出液相法與固相法(非專利文獻4)。其中的固相法是將高分子樹脂(固相合成用樹脂)作為固定相，依序地結合胺基酸以合成目標胜肽之方法(非專利文獻5)。再者，近年來隨著將纖維素等膜作為固定相之胜肽陣列(peptide array)技術的進化，作為迅速地自動合成少量多個檢體的胜肽之技術而受到關注(非專利文獻6)。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：WO2013/100132 專利文獻2：WO2018/225851 [非專利文獻]

非專利文獻1：Future Med. Chem., 2009, 1, 1289-1310. 非專利文獻2：Acc Chem. Res., 2008, 41, 1331-1342. 非專利文獻3：Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 254-269. 非專利文獻4：Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry: Building Blocks, Catalysis and Coupling Chemistry, Volume 3, 2011. 非專利文獻5：Solid phase peptide synthesis (Bachem社發行) [2022年1月18日檢索]、網址＜URL: https://www.bachem.com/wp-admin/admin-ajax.php?juwpfisadmin=false&action=wpfd&task=file.download&wpfd_category_id=180&wpfd_file_id=213490&token=&preview=1＞ 非專利文獻6：Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2016, 21, 119-127. 非專利文獻7：Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174. 非專利文獻8：Org. Lett. 2021, 23, 6900-6904.

[發明欲解決之課題]

胜肽固相合成中，隨著將纖維素等膜作為固定相之胜肽陣列技術的進化，作為迅速地自動合成少量多個檢體的胜肽之技術而受到關注(非專利文獻6)。因此本發明者們為了合成類藥物胜肽，而嘗試將其應用在將膜作為固定相之胜肽陣列技術。然而，由於類藥物的胜肽包含很多N-烷基胺基酸因而醯胺化反應的合成難易度高，使用胜肽陣列的合成中，發現應用既存的醯胺化條件時皆產率低，而不存在充分滿足的醯胺化條件。例如，結合至膜固相的N-甲基苯丙胺酸與接著的Fmoc-正白胺酸的醯胺化反應中，使用非專利文獻7所載的反應條件時，反應轉換率的結果為3~4%。又，參考包含N-取代胺基酸的胜肽之合成方法(專利文獻2)中所載的使用二異丙基碳二亞胺(DIC)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)的條件實施時，反應轉換率的結果為50~64%。

詳細檢查反應後，確認到反應系統中的活性酯失活。以提升反應轉換率為目的而進行將試劑濃度設成2倍的探討後，N,N’-二異丙基脲的結晶析出。雖然在胜肽陣列技術中藉由自動化送液以提升速度及效率，但因結晶析出而造成堵塞及/或清洗不足導致的雜質增加，而難以將既存條件直接應用高試劑濃度條件。

一方面中，本發明的課題在於，胜肽合成法的、特別是縮合反應的步驟中，使反應轉換率提升。又，一方面中，本發明的課題在於，提供一種使用避免結晶析出而可應用在自動合成的醯胺化條件，以效率良好地製造高純度胜肽化合物之方法。 [用於解決課題之手段]

有鑑於上述情事，本發明者們潛心研究的結果進而完成本發明。本發明的方法並不限於將膜作為固定相之胜肽陣列技術，亦可應用在將高分子樹脂(固相合成用樹脂)作為固定相之固相合成的方法。

例如，本發明提供以下[A1]~[A64]。 [A1] 一種藉由固相法製造胜肽化合物的方法，該方法包括： 準備擔載於固相，具有胺基的第一胺基酸或具有胺基的第一胜肽之準備步驟；以及 將第一胺基酸或第一胜肽、與具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胺基酸、或者具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胜肽，在下述通式(A)表示的至少1種碳二亞胺系縮合劑、以及添加劑的存在下進行縮合之縮合步驟， R ^A-N=C=N-R ^B･･･(A) (式中，R ^A為C ₄~C ₁₀二級或三級烷基，R ^B為C ₂~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^A及R ^B中的各基可獨立選自由鹵素、C ₁~C ₆烷氧基、二C ₁~C ₆烷胺基、或4~8員環狀胺基中的1或複數個基所取代)。 [A2] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為C ₄~C ₁₀二級烷基。 [A2-1] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為C ₄~C ₈二級烷基。 [A2-2] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為具有不對稱碳的C ₄~C ₈二級或三級烷基。 [A2-3] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為具有不對稱碳的C ₄~C ₈二級烷基。 [A2-4] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為具有不對稱碳的C ₄~C ₆二級烷基。 [A2-5] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為1-甲基庚基、1-甲基丁基、1-乙基丙基或二級丁基。 [A2-6] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為二級丁基。 [A3] 如[A1]或[A2]所載之方法，其中R ^B為C ₃~C ₁₀二級或三級烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^B中的各基可獨立選自由鹵素、C ₁~C ₆烷氧基、二C ₁~C ₆烷胺基、或4~8員環狀胺基中的1或複數個基所取代。 [A3-1] 如[A1]或[A2]所載之方法，其中R ^B為C ₃~C ₁₀二級或三級烷基。 [A3-2] 如[A1]或[A2]所載之方法，其中R ^B為C ₃~C ₁₀二級或三級烷基、或者C ₇~C ₁₄芳基烷基。 [A3-3] 如[A1]或[A2]所載之方法，其中R ^B為C ₃~C ₁₀二級烷基、或者C ₇~C ₁₀芳基烷基。 [A3-4] 如[A1]或[A2]所載之方法，其中R ^B為C ₃~C ₆二級烷基。 [A3-5] 如[A1]或[A2]所載之方法，其中R ^B為1-甲基苄基、1-甲基庚基、1-甲基丁基、1-乙基丙基或二級丁基。 [A3-6] 如[A1]或[A2]所載之方法，其中R ^B為二級丁基。 [A4] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為C ₄~C ₈二級或三級烷基，R ^B為C ₄~C ₁₀二級或三級烷基、或者C ₇~C ₁₄芳基烷基。 [A4-1] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為C ₄~C ₈二級烷基，R ^B為C ₄~C ₁₀二級烷基、或C ₇~C ₁₄芳基烷基。 [A4-2] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為C ₄~C ₆二級烷基，R ^B為C ₄~C ₈二級烷基、或C ₇~C ₁₀芳基烷基。 [A5] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為具有不對稱碳的C ₄~C ₈二級或三級烷基，R ^B為C ₃~C ₁₀二級或三級烷基。 [A5-1] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為具有不對稱碳的C ₄~C ₈二級烷基，R ^B為C ₄~C ₁₀二級烷基、或C ₇~C ₁₄芳基烷基。 [A5-2] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為具有不對稱碳的C ₄~C ₈二級烷基，R ^B為C ₄~C ₁₀二級烷基、或C ₇~C ₁₀芳基烷基。 [A5-3] 如[A1]所載之方法，其中R ^A為具有不對稱碳的C ₄~C ₆二級烷基，R ^B為C ₄~C ₈二級烷基、或C ₇~C ₁₀芳基烷基。 [A6] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑包含選自由N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)以及N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)所組成之群組中的至少1種。 [A6-1] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑包含選自由N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、或者N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)所組成之群組中的至少1種。 [A6-2] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、或N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)。 [A6-3] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)。 [A6-4] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)。 [A6-5] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)。 [A6-6] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)。 [A6-7] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)。 [A6-8] 如[A1]至[A5]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)。 [A7] 如[A1]至[A6]中任一項所載之方法，其中添加劑為選自由1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、3，4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1，2，3-苯并三𠯤(HOOBt)、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯(Oxyma)、以及5-(羥基亞胺基)-1，3-二甲基嘧啶-2，4，6(1Ｈ，3Ｈ，5Ｈ)-三酮(Oxyma B)所組成之群組中的至少1種。 [A8] 如[A1]至[A6]中任一項所載之方法，其中添加劑為選自由HOAt、HOOBt、以及Oxyma所組成之群組中的至少1種。 [A9] 如[A1]至[A6]中任一項所載之方法，其中添加劑為HOAt、HOOBt、或Oxyma。 [A10] 如[A1]至[A9]中任一項所載之製造方法，其中縮合步驟是在溶媒中進行，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑濃度為0.4mol/L以上、0.5mol/L以上、0.6mol/L以上、或0.7mol/L以上。 [A11] 如[A1]至[A10]中任一項所載之製造方法，其中縮合步驟是在溶媒中進行，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑濃度為4.0mol/L以下、3.0mol/L以下、2.0mol/L以下、或1.0mol/L以下。 [A12] 如[A1]至[A11]中任一項所載之製造方法，其中縮合步驟是在溶媒中進行，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑濃度為0.4~4.0mol/L、0.5~3.0mol/L、0.6~2.0mol/L、或0.7~1.0mol/L。 [A13] 如[A1]至[A11]中任一項所載之製造方法，其中縮合步驟是在溶媒中進行，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑濃度為0.7~1.0mol/L。 [A14] 如[A1]至[A13]中任一項所載之製造方法，其中固相為膜或固相合成用樹脂。 [A15] 如[A1]至[A13]中任一項所載之製造方法，其中固相為膜。 [A16] 如[A15]所載之方法，其中膜為纖維素膜、聚丙烯膜、或聚胺乙基甲基丙烯醯胺(polyaminoethyl methacrylamide)膜。 [A17] 如[A15]所載之方法，其中膜為纖維素膜。 [A18] 如[A1]至[A13]中任一項所載之製造方法，其中固相為固相合成用樹脂。 [A19] 如[A18]所載之方法，其中固相合成用樹脂為氯三苯甲基(CTC)樹脂、三苯甲基(Trt)樹脂、SASRIN樹脂、Rink醯胺樹脂、Merrifield樹脂、或Wang樹脂。 [A20] 如[A18]所載之方法，其中固相合成用樹脂為氯三苯甲基(CTC)樹脂。 [A21] 如[A1]至[A20]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽是透過光裂解性部位、雙硫鍵、或酸不穩定部位結合。 [A21-1] 如[A1]至[A20]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽是透過光裂解性部位結合。 [A21-2] 如[A1]至[A20]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽是透過雙硫鍵結合。 [A21-3] 如[A1]至[A20]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽是透過酸不穩定部位結合。 [A22] 如[A21-1]所載之方法，其中光裂解性部位具有硝基藜蘆基氧基羰基(nitroveratryloxycarbonyl)殘基、或香豆素(coumarin)殘基。 [A22-1] 如[A21-1]所載之方法，其中光裂解性部位為硝基藜蘆基氧基羰基殘基。 [A23] 如[A21-3]所載之方法，其中酸不穩定部位具有三苯甲基酯結構、氯三苯甲基酯結構、烷氧基苄基醚結構、三烷氧基苄基胺羰基結構、二烷氧基苯基-烷氧基苯甲基胺羰基結構、或烷氧基 -9-基胺羰基結構。 [A23-1] 如[A21-3]所載之方法，其中酸不穩定部位具有氯三苯甲基酯結構。 [A24] 如[A1]至[A23]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.0當量以上、1.1當量以上、或1.2當量以上的碳二亞胺系縮合劑。 [A25] 如[A1]至[A24]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用5.0當量以下、4.0當量以下、3.0當量以下、2.0當量以下、或1.5當量以下的碳二亞胺系縮合劑。 [A26] 如[A1]至[A25]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.0~5.0當量、1.1~4.0當量、1.1~3.0當量、1.2~2.0當量、或1.2~1.5當量的碳二亞胺系縮合劑。 [A27] 如[A1]至[A25]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.2~1.5當量的碳二亞胺系縮合劑。 [A28] 如[A1]至[A27]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用0.01當量、0.05當量、0.1當量、0.2當量以上、或0.3當量以上的添加劑。 [A29] 如[A1]至[A28]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.0當量以下、0.9當量以下、0.8當量以下、或0.7當量以下的添加劑。 [A30] 如[A1]至[A29]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用0.05~1.0當量、0.1~0.9當量、0.2~0.8當量、或0.3~0.7當量的添加劑。 [A31] 如[A1]至[A29]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用0.3~0.7當量的添加劑。 [A32] 如[A1]至[A31]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為非天然胺基酸。 [A33] 如[A1]至[A32]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為α,α-二取代胺基酸、β-支鏈胺基酸、或N-烷基胺基酸(但N-烷基胺基酸中的烷基可由獨立選自C ₃~C ₆環烷基、C ₂~C ₆烯基、C ₂~C ₆炔基、或C ₆~C ₁₀芳基的1或複數個基所取代)。 [A34] 如[A1]至[A32]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為烷基碳數為1~8的N-烷基胺基酸(但烷基可由獨立選自鹵素、氰基、C ₃~C ₆環烷基、C ₂~C ₆烯基、C ₂~C ₆炔基、或C ₆~C ₁₀芳基的1或複數個基所取代。 [A35] 如[A1]至[A32]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為N-烷基胺基酸、烷基碳數為1~8的N-烷基胺基酸、烷基碳數為1~6的N-烷基胺基酸、烷基碳數為1~3的N-烷基胺基酸、或N-甲基胺基酸。 [A36] 如[A1]至[A32]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為N-甲基胺基酸。 [A37] 如[A1]至[A36]中任一項所載之方法，其中第二胺基酸或第二胜肽的C端的胺基酸為非天然胺基酸。 [A38] 如[A1]至[A37]中任一項所載之方法，其中第二胺基酸或第二胜肽的C端的胺基酸為α,α-二取代胺基酸、β-支鏈胺基酸、或N-烷基胺基酸。 [A39] 如[A1]至[A38]中任一項所載之方法，其中經保護的胺基中的保護基是以下述式(1)表示的基； [化1] (式中，R ₁~R ₈為獨立選自由氫、C ₁-C ₈烷基、C ₁-C ₈氟烷基、鹵素、磺酸基、以及三甲矽基所組成之群組，R ₉~R ₁₀獨立為氫或甲基)。 [A40] 如[A1]至[A38]中任一項所載之方法，其中經保護的胺基中的保護基為9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)基、Fmoc(2,7tb)基、Fmoc(1Me)基、Fmoc(2F)基、Fmoc(2,7Br)基、mio-Fmoc基、dio-Fmoc基、tdf-Fmoc基、Fmoc(2TMS)基、Fmoc(2so3h)基、sm-Fmoc基、或rm-Fmoc基。 [A41] 如[A1]至[A38]中任一項所載之方法，其中經保護的胺基中的保護基為Fmoc基。 [A42] 如[A1]至[A41]中任一項所載之方法，其中縮合步驟在溶媒中進行。 [A43] 如[A42]所載之方法，其中溶媒包含選自由醯胺系溶媒、脲系溶媒、醚系溶媒、鹵素系溶媒、腈系溶媒、以及苯系溶媒所組成之群組中的至少1種。 [A44] 如[A43]所載之方法，其中溶媒為醯胺系溶媒。 [A45] 如[A44]所載之方法，其中醯胺系溶媒選自由N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-乙基-2-吡咯啶酮(NEP)、N-丁基-2-吡咯啶酮(NBP)、以及甲醯胺所組成之群組。 [A46] 如[A43]所載之方法，其中溶媒為脲系溶媒。 [A47] 如[A46]所載之方法，其中脲系溶媒選自由1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMI)、以及N,N’-二甲基丙烯脲(DMPU)所組成之群組。 [A48] 如[A43]所載之方法，其中溶媒為醚系溶媒。 [A49] 如[A48]所載之方法，其中醚系溶媒選自由四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、4-甲基四氫哌喃所組成之群組。 [A50] 如[A43]所載之方法，其中溶媒為鹵素系溶媒。 [A51] 如[A50]所載之方法，其中鹵素系溶媒選自由二氯甲烷、1，2-二氯乙烷所組成之群組。 [A52] 如[A43]所載之方法，其中溶媒為腈系溶媒。 [A53] 如[A52]所載之方法，其中腈系溶媒為乙腈。 [A54] 如[A43]所載之方法，其中溶媒為苯系溶媒。 [A55] 如[A54]所載之方法，其中苯系溶媒選自由苯、甲苯、二甲苯所組成之群組。 [A56] 如[A1]至[A55]中任一項所載之方法，其中縮合步驟是在0℃~100℃、10℃~80℃、10℃~60℃、10℃~50℃、10℃~40℃、10℃~35℃、15℃~60℃、20℃~60℃、20℃~40℃、或25℃~40℃下進行。 [A57] 如[A1]至[A55]中任一項所載之方法，其中縮合步驟是在20℃~60℃下進行。 [A58] 如[A1]至[A57]中任一項所載之方法，其中縮合步驟重複2次以上。 [A59] 如[A1]至[A57]中任一項所載之方法，其中縮合步驟重複2次。 [A60] 如[A1]至[A59]中任一項所載之方法，其更包括在縮合步驟之後，將擔載於固相的第二胺基酸或第二胜肽中的經保護的胺基及/或經保護的羥基的保護基進行脫保護之脫保護步驟。 [A61] 如[A60]所載之方法，其更包括在縮合步驟與脫保護步驟之間清洗固相之清洗步驟。 [A62] 如[A60]或[A61]所載之方法，其中縮合步驟與脫保護步驟重複複數次(但於複數次縮合步驟使用的複數個第二胺基酸及/或第二胜肽各自可相同亦可不同)。 [A63] 一種[A1]至[A62]中任一項所載之方法中的上述式(A)表示的碳二亞胺系縮合劑的用途。 [A64] 一種[A1]至[A62]中任一項所載之方法中的DsBC的用途。 關於上述通式(A)中R ^A及R ^B的組合，自反應系統中可使活性酯長時間維持高濃度，在縮合反應的步驟中，可更提升反應轉換率的觀點而言，以[A4]~[A4-2]為佳，自即使在高濃度下高度藉由避免源自碳二亞胺的脲析出，以在自動合成中可效率良好地醯胺化的觀點而言，以[A5]~[A5-3]為佳。

[A1]至[A64]中，雖針對藉由固相法製造胜肽化合物的方法進行說明，但該等製造方法亦可應用於液相法。亦即，本發明的一方面提供以下[A1’]。[A1’]可包括關於[A2]至[A64]中固相以外的特徵。 [A1’] 一種方法，其為藉由液相法製造胜肽化合物的方法，其包括： 準備具有胺基的第一胺基酸或具有胺基的第一胜肽之準備步驟；以及 將第一胺基酸或第一胜肽、與具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胺基酸、或者具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胜肽在上述通式(A)表示的至少1種碳二亞胺系縮合劑及添加劑的存在下進行縮合之縮合步驟。 根據該方法，可以高反應轉換率獲得目標的胜肽化合物。

例如，本發明可又提供以下[B1]~[B63]。 [B1] 一種方法，其為藉由固相法製造胜肽化合物的方法，其包括： 準備擔載於固相，具有N-烷基胺基的第一胺基酸、或N端具有N-烷基胺基的第一胜肽之準備步驟；以及 將第一胺基酸或第一胜肽、與具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胺基酸、或者具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胜肽，在下述通式(A’)表示的至少1種碳二亞胺系縮合劑、及添加劑的存在下，在溶媒中進行縮合，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑的濃度為0.4~4.0mol/L之縮合步驟， R ^A’-N=C=N-R ^B’･･･(A’) (式中，R ^A’為C ₃~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^B’為C ₁~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^A’及R ^B’中的各基可獨立選自由鹵素、C ₁~C ₆烷氧基、二C ₁~C ₆烷胺基、或4~8員環狀胺基中的1或複數個基所取代，但R ^A’中的總碳數為4以上)。 [B2] 如[B1]所載之方法，其中R ^A’為C ₄~C ₁₀烷基、C ₄~C ₆烷基、或C ₄烷基。 [B3] 如[B1]或[B2]所載之方法，其中R ^B’為C ₁~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基。 [B3-1] 如[B1]或[B2]所載之方法，其中R ^B’為C ₁~C ₁₀烷基。 [B3-2] 如[B1]或[B2]所載之方法，其中R ^B’為C ₂~C ₆烷基。 [B3-3] 如[B1]或[B2]所載之方法，其中R ^B’為C ₄烷基。 [B4] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑選自由DsBC、1-三級丁基-3-乙基碳二亞胺(tBEC)、二-碳二亞胺(DtBC)、1-(3-二甲基胺丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDCI)、N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)、以及N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)所組成之群組中的至少1種。 [B4-1] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑選自由DsBC、1-三級丁基-3-乙基碳二亞胺(tBEC)、二-碳二亞胺(DtBC)、以及1-(3-二甲基胺丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDCI)所組成之群組中的至少1種。 [B5] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑包含選自由N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)、以及N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)所組成之群組中的至少1種。 [B5-1] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑包含選自由N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、或N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)所組成之群組中的至少1種。 [B5-2] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、或N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)。 [B5-3] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為DsBC。 [B5-4] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)。 [B5-5] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)。 [B5-6] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)。 [B5-7] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)。 [B5-8] 如[B1]至[B3]中任一項所載之方法，其中碳二亞胺系縮合劑為N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)。 [B6] 如[B1]至[B5]中任一項所載之方法，其中添加劑選自由HOAt、HOBt、HOOBt以及Oxyma所組成之群組中的至少1種。 [B7] 如[B1]至[B5]中任一項所載之方法，其中添加劑選自由HOAt、HOOBt、以及Oxyma所組成之群組中的至少1種。 [B8] 如[B1]至[B5]中任一項所載之方法，其中添加劑為HOAt、HOOBt、或Oxyma。 [B9] 如[B1]至[B8]中任一項所載之方法，其中溶媒中的碳二亞胺系縮合劑的濃度為0.5mol/L以上、0.6mol/L以上、或0.7mol/L以上。 [B10] 如[B1]至[B9]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑的濃度為3.0mol/L以下、2.0mol/L以下、或1.0mol/L以下。 [B11] 如[B1]至[B10]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑的濃度為0.5~3.0mol/L、0.6~2.0mol/L、或0.7~1.0mol/L。 [B12] 如[B1]至[B10]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑的濃度為0.7~1.0mol/L。 [B13] 如[B1]至[B12]中任一項所載之方法，其中固相為膜或固相合成用樹脂。 [B14] 如[B1]至[B12]中任一項所載之方法，其中固相為膜。 [B15] 如[B14]所載之方法，其中膜為纖維素膜、聚丙烯膜、或聚胺乙基甲基丙烯醯胺膜。 [B16] 如[B14]所載之方法，其中膜為纖維素膜。 [B17] 如[B1]至[B12]中任一項所載之製造方法，其中固相為固相合成用樹脂。 [B18] 如[B17]所載之方法，其中固相合成用樹脂為氯三苯甲基(CTC)樹脂、三苯甲基(Trt)樹脂、SASRIN樹脂、Rink醯胺樹脂、Merrifield樹脂、或Wang樹脂。 [B19] 如[B17]所載之方法，其中固相合成用樹脂為氯三苯甲基(CTC)樹脂。 [B20] 如[B1]至[B19]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽透過光裂解性部位、雙硫鍵、或酸不穩定部位結合。 [B20-1] 如[B1]至[B19]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽透過光裂解性部位進行擔載。 [B20-2] 如[B1]至[B19]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽透過雙硫鍵結合。 [B20-3] 如[B1]至[B19]中任一項所載之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽透過酸不穩定部位結合。 [B21] 如[B20-1]所載之方法，其中光裂解性部位具有硝基藜蘆基氧基羰基殘基、或香豆素殘基。 [B21-1] 如[B20-1]所載之方法，其中光裂解性部位為硝基藜蘆基氧基羰基殘基。 [B22] 如[B20-3]所載之方法，其中酸不穩定部位具有三苯甲基酯結構、氯三苯甲基酯結構、烷氧基苄基醚結構、三烷氧基苄基胺羰基結構、二烷氧基苯基-烷氧基苯甲基胺羰基結構、或烷氧基 -9-基胺羰基結構。 [B22-1] 如[B20-3]所載之方法，其中酸不穩定部位具有氯三苯甲基酯結構。 [B23] 如[B1]至[B22]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.0當量以上、1.1當量以上、或1.2當量以上的碳二亞胺系縮合劑。 [B24] 如[B1]至[B23]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用5.0當量以下、4.0當量以下、3.0當量以下、2.0當量以下、或1.5當量以下的碳二亞胺系縮合劑。 [B25] 如[B1]至[B24]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.0~5.0當量、1.1~4.0當量、1.1~3.0當量、1.2~2.0當量、或1.2~1.5當量的碳二亞胺系縮合劑。 [B26] 如[B25]所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.2~1.5當量的碳二亞胺系縮合劑。 [B27] 如[B1]至[B26]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用0.01當量以上、0.05當量以上、0.1當量以上、0.2當量以上、或0.3當量以上的添加劑。 [B28] 如[B1]至[B27]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用1.0當量以下、0.9當量以下、0.8當量以下、或0.7當量以下的添加劑。 [B29] 如[B1]至[B28]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用0.05~1.0當量、0.1~0.9當量、0.2~0.8當量、或0.3~0.7當量的添加劑。 [B30] 如[B1]至[B28]中任一項所載之方法，其中縮合步驟中，相對於第二胺基酸或第二胜肽，使用0.3~0.7當量的添加劑。 [B31] 如[B1]至[B30]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為非天然胺基酸。 [B32] 如[B1]至[B31]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸的N-烷基胺基中的烷基、或第一胜肽的N端的胺基酸的N-烷基胺基中的烷基為C ₁~C ₁₀烷基、C ₁~C ₆烷基、或C ₁~C ₃烷基(在此的烷基可由獨立選自鹵素、氰基、C ₁~C ₆烷氧基、C ₃~C ₆環烷基、C ₂~C ₆烯基、C ₂~C ₆炔基、或C ₆~C ₁₀芳基的1或複數個基所取代)。 [B33] 如[B1]至[B32]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為烷基碳數為1~8的N-烷基胺基酸(但烷基可由獨立選自鹵素、氰基、C ₁~C ₆烷氧基、C ₃~C ₆環烷基、C ₂~C ₆烯基、C ₂~C ₆炔基、或C ₆~C ₁₀芳基的1或複數個基所取代)。 [B34] 如[B1]至[B32]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為N-烷基胺基酸、烷基碳數為1~8的N-烷基胺基酸、1~6的N-烷基胺基酸、烷基碳數為1~3的N-烷基胺基酸、或N-甲基胺基酸。 [B35] 如[B1]至[B34]中任一項所載之方法，其中第一胺基酸的N-烷基胺基中的烷基、或第一胜肽的N端的胺基酸的N-烷基胺基中的烷基為甲基。 [B36] 如[B1]至[B35]中任一項所載之方法，其中第二胺基酸或第二胜肽的C端的胺基酸為非天然胺基酸。 [B37] 如[B1]至[B36]中任一項所載之方法，其中第二胺基酸或第二胜肽的C端的胺基酸為α,α-二取代胺基酸、β-支鏈胺基酸、或N-烷基胺基酸。 [B38] 如[B1]至[B37]中任一項所載之方法，其中經保護的胺基中的保護基為下述式(1)表示的基； [化2] (式中，R ₁~R ₈獨立選自由氫、C ₁-C ₈烷基、C ₁-C ₈氟烷基、鹵素、磺酸基、以及三甲矽基所組成之群組，R ₉~R ₁₀獨立為氫或甲基)。 [B39] 如[B1]至[B37]中任一項所載之方法，其中經保護的胺基中的保護基為Fmoc基、Fmoc(2,7tb)基、Fmoc(1Me)基、Fmoc(2F)基、Fmoc(2,7Br)基、mio-Fmoc基、dio-Fmoc基、tdf-Fmoc基、Fmoc(2TMS)基、Fmoc(2so3h)基、sm-Fmoc基、或rm-Fmoc基。 [B40] 如[B1]至[B37]中任一項所載之方法，其中經保護的胺基中的保護基為Fmoc基。 [B41] 如[B1]至[B40]中任一項所載之方法，其中縮合步驟在溶媒中進行。 [B42] 如[B41]所載之方法，其中溶媒包含選自由醯胺系溶媒、脲系溶媒、醚系溶媒、鹵素系溶媒、腈系溶媒、以及苯系溶媒所組成之群組中的至少1種。 [B43] 如[B42]所載之方法，其中溶媒為醯胺系溶媒。 [B44] 如[B43]所載之方法，其中醯胺系溶媒選自由DMF、NMP、DMA、NEP、NBP、以及甲醯胺所組成之群組。 [B45] 如[B42]所載之方法，其中溶媒為脲系溶媒。 [B46] 如[B45]所載之方法，其中脲系溶媒選自由DMI、以及DMPU所組成之群組。 [B47] 如[B42]所載之方法，其中溶媒為醚系溶媒。 [B48] 如[B47]所載之方法，其中醚系溶媒選自由四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、4-甲基四氫哌喃所組成之群組。 [B49] 如[B42]所載之方法，其中溶媒為鹵素系溶媒。 [B50] 如[B49]所載之方法，其中鹵素系溶媒選自由二氯甲烷、1，2-二氯乙烷所組成之群組。 [B51] 如[B42]所載之方法，其中溶媒為腈系溶媒。 [B52] 如[B51]所載之方法，其中腈系溶媒為乙腈。 [B53] 如[B42]所載之方法，其中溶媒為苯系溶媒。 [B54] 如[B53]所載之方法，其中苯系溶媒選自由苯、甲苯、二甲苯所組成之群組。 [B55] 如[B1]至[B54]中任一項所載之方法，其中縮合步驟是在0℃~100℃、10℃~80℃、10℃~60℃、10℃~50℃、10℃~40℃、10℃~35℃、15℃~60℃、20℃~60℃、20℃~40℃、或25℃~40℃下進行。 [B56] 如[B1]至[B54]中任一項所載之方法，其中縮合步驟是在20℃~60℃下進行。 [B57] 如[B1]至[B56]中任一項所載之方法，其中縮合步驟重複2次以上。 [B58] 如[B1]至[B56]中任一項所載之方法，其中縮合步驟重複2次。 [B59] 如[B1]至[B58]中任一項所載之方法，其更包括在縮合步驟之後，將擔載於固相的第二胺基酸或第二胜肽中的中的經保護的胺基及/或經保護的羥基的保護基進行脫保護之脫保護步驟。 [B60] 如[B59]所載之方法，其更包括縮合步驟與脫保護步驟之間清洗固相之清洗步驟。 [B61] 如[B59]或[B60]所載之方法，其中縮合步驟與脫保護步驟重複複數次(但於複數次縮合步驟使用的複數個第二胺基酸及/或第二胜肽各自可相同亦可不同)。 [B62] 一種[B1]至[B61]中任一項所載之方法中的上述式(A’)表示的碳二亞胺系縮合劑的用途。 [B63] 一種[B1]至[B61]中任一項所載之方法中的DsBC的用途。 [B63-1] 一種[B1]至[B61]中任一項所載之方法中的N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)的用途。 [B63-2] 一種[B1]至[B61]中任一項所載之方法中的N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)的用途。 [B63-3] 一種[B1]至[B61]中任一項所載之方法中的N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)的用途。 [B63-4] 一種[B1]至[B61]中任一項所載之方法中的N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)的用途。

[B1]至[B63]中，雖針對藉由固相法製造胜肽化合物的方法進行說明，但該等製造方法亦可應用於液相法。亦即，本發明的一方面提供以下[B1’]。[B1’]可包括關於[B2]至[B63]中固相以外的特徵。 [B1’] 一種方法，其為藉由液相法製造胜肽化合物的方法，其包括： 準備具有N-烷基胺基的第一胺基酸、或N端具有N-烷基胺基的第一胜肽之準備步驟；以及 將第一胺基酸或第一胜肽、與具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胺基酸、或者具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胜肽在上述通式(A’)表示的至少1種碳二亞胺系縮合劑及添加劑的存在下，於溶媒中進行縮合，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑的濃度為0.4~4.0mol/L之縮合步驟。 根據該方法，可以高反應轉換率獲得目標的胜肽化合物。

例如，本發明可又提供以下[C1]~[C16]。 [C1] 一種擔載於膜的胜肽化合物的製造方法，其包括[A1]至[A64]或[B1]至[B63]中任一項所載之方法。 [C2] 如[C1]所載之方法，其中擔載於膜的胜肽化合物具有2個以上源自N-烷基胺基酸的構成單元。 [C3] 如[C1]或[C2]所載之方法，其中擔載於膜的胜肽化合物具有3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、或7個以上源自N-烷基胺基酸的構成單元。 [C4] 如[C1]至[C3]中任一項所載之方法，其中擔載於膜的胜肽化合物具有7個以上源自N-烷基胺基酸的構成單元。 [C5] 如[C1]至[C4]中任一項所載之方法，其中擔載於膜的胜肽化合物具有總計7個以上、8個以上、9個以上、或10個以上源自胺基酸的構成單元。 [C6] 如[C1]至[C5]中任一項所載之方法，其中胜肽化合物具有總計10個以上源自胺基酸的構成單元。 [C7] 如[C1]至[C6]中任一項所載之方法，其中胜肽化合物具有總計30個以下、25個以下、20個以下、18個以下、17個以下、16個以下、或15個以下源自胺基酸的構成單元。 [C8] 如[C1]至[C7]中任一項所載之方法，其中胜肽化合物具有總計15個以下源自胺基酸的構成單元。 [C9] 一種擔載於膜的胜肽庫的製造方法，其包括根據如[C1]至[C8]中任一項所載之方法，獲得擔載於膜的10種以上胜肽化合物之步驟。 [C10] 一種擔載於膜的胜肽庫的製造方法，其包括根據如[C1]至[C8]中任一項所載之方法，獲得擔載於膜的20種以上、40種以上、80種以上、100種以上、200種以上、或384種以上胜肽化合物之步驟。 [C11] 一種擔載於膜的胜肽庫的製造方法，其包括根據如[C1]至[C8]中任一項所載之方法，獲得擔載於膜的384種以上胜肽化合物之步驟。 [C12] 如[C1]至[C11]中任一項所載之方法，其中使用自動合成機。 [C13] 如[C1]至[C12]中任一項所載之方法，其更包括自擔載於膜的胜肽化合物切出胜肽化合物之步驟。 [C14] 如[C13]所載之方法，其中藉由光照射切出胜肽化合物。 [C15] 一種環狀胜肽或環狀胜肽庫的製造方法，其包括將根據如[C13]或[C14]所載之方法切出的胜肽化合物進行環化之步驟。 [C16] 如[C15]所載之方法，其中使用自動合成機。

例如，本發明可又提供以下[D1]~[D6]。 [D1] 一種胜肽化合物，其為透過連接子結合至膜的胜肽化合物，其具有2個以上源自N-烷基胺基酸的構成單元。 [D2] 如[D1]所載之胜肽化合物，其中胜肽化合物具有3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、或7個以上源自N-烷基胺基酸的構成單元。 [D3] 如[D1]或[D2]所載之胜肽化合物，其中胜肽化合物具有總計7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、或11個以上源自胺基酸的構成單元。 [D4] 如[D1]至[D3]中任一項所載之胜肽化合物，其中胜肽化合物具有總計30個以下、25個以下、20個以下、18個以下、17個以下、16個以下、或15個以下源自胺基酸的構成單元。 [D5] 一種胜肽庫，其包括10種以上的如[D1]至[D4]中任一項所載之透過連接子結合至膜的胜肽化合物。 [D6] 如[D5]所載之胜肽庫，其包括20種以上、40種以上、80種以上、100種以上、200種以上、或384種以上的透過連接子結合至膜的胜肽化合物。

例如，本發明可又提供以下[E1]~[E3]。 [E1] 一種方法，其為篩選結合至目標分子之化合物的方法，其包括： (1) 根據如[C9]至[C16]中任一項所載之方法合成胜肽庫、或環狀胜肽庫； (2) 使該胜肽庫、或環狀胜肽庫與目標分子接觸； (3) 選擇結合至目標分子的胜肽化合物。 [E2] 如[E1]所載之方法，其中目標分子為蛋白質、核酸、多胜肽、或糖鏈。 [E3] 如[E1]或[E2]所載之方法，其中結合至目標分子的化合物的選擇是藉由表面電漿子共振(Surface plasmon resonance)或ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)實施。

例如，本發明可又提供以下[F1]~[F5]。 [F1] 一種胜肽合成的析出抑制劑，其包括DsBC。 [F2] 一種胜肽合成的析出抑制劑，其包括N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)。 [F3] 一種胜肽合成的析出抑制劑，其包括N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)。 [F4] 一種胜肽合成的析出抑制劑，其包括N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)。 [F5] 一種胜肽合成的析出抑制劑，其包括N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)。

例如，本發明可又提供以下[G1]~[G4]。 [G1] 一種N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26) [G2] 一種N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27) [G3] 一種N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28) [G4] 一種N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)

例如，本發明可又提供以下[H1]~[H7]。 [H1] 一種化合物的製造方法，其包括使用N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)、或N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)作為縮合劑，形成醯胺鍵之步驟。 [H2] 一種化合物的製造方法，其包括使用N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)作為縮合劑，形成醯胺鍵之步驟。 [H3] 一種化合物的製造方法，其包括使用N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)作為縮合劑，形成醯胺鍵之步驟。 [H4] 一種化合物的製造方法，其包括使用N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)作為縮合劑，形成醯胺鍵之步驟。 [H5] 一種化合物的製造方法，其包括使用N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)作為縮合劑，形成醯胺鍵之步驟。 [H6] 一種化合物的製造方法，其包括使用N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)、或N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)作為縮合劑，形成醯胺鍵之步驟。 [H7] 一種化合物的製造方法，其包括使用N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)作為縮合劑，形成醯胺鍵之步驟。 [H8] 如[H1]至[H7]中任一項所載之製造方法，其中前述形成醯胺鍵之步驟是在固相或液相下進行。 在上述編號中，除非另有說明，附屬項引用的編號包括子編號。例如，附屬項引用[A2]表示包含[A2]、以及其子編號的[A2-1]~[A2-6]。其同樣適用於其他編號。 [發明之效果]

根據本發明的一方面，胜肽固相合成法的、特別是在縮合反應的步驟中，可提升反應轉換率。又，根據本發明的一方面，提供一種胜肽固相合成法的、特別是在縮合反應的步驟中，藉由避免結晶析出而可應用在自動合成的醯胺化條件，以效率良好地製造高純度胜肽化合物之方法。

下文，針對用於實施本發明的形態進行詳細說明。然而，本發明不限於以下實施形態。

(用語的定義等) 本說明書中，「一或複數個」是指1個或2個以上的數目。「一或複數個」在內文中用於關於某個基團的取代基時，此用語是指從一個到該基團所允許的取代基最大數目之數目。具體而言，作為「一或複數個」可舉出例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及/或較其更大的數目。

本說明書中，表示數值範圍的「～」包含其兩端的值，例如，「A~B」是指A以上，且B以下的數值範圍。

本說明書中，「下限」包含「以上」以及「更多」兩者的意義，「上限」包含「以下」以及「更少」兩者的意義。

本說明書中，「約」之用語在與數值組合使用時，表示其數值的+10%及-10%的數值範圍。

本說明書中，「及/或」的用語意義包含「以及」與「或」適當組合的所有組合。具體而言，例如「A、B及/或C」包含以下7種的變體： (i)A、(ii)B、(iii)C、(iv)A及B、(v)A及C、(vi)B及C、(vii)A、B及C。

本說明書中，「室溫」是指約20℃~約25℃的溫度。

作為本說明書中的「鹵素」，可例示F、Cl、Br或I。

本說明書中「烷基」，是指從脂肪族烴將任意1個氫原子去除所衍生的一價的基，在骨架中不含有雜原子(是指碳及氫原子以外的原子)或不飽和的碳-碳鍵結，具有含有氫及碳原子的烴基(Hydrocarbyl)或烴基結構的部分集合。烷基不只包含直鏈狀者，亦包含支鏈狀者。作為烷基的具體例，可舉出碳原子數1~20(C ₁~C ₂₀，下文「C _p~C _q」是指碳原子數為p~q個)的烷基，較佳為C ₁~C ₁₀烷基、更佳為C ₁~C ₆烷基。作為烷基，具體而言，可舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、三級丁基、異丁基(2-甲基丙基)、正戊基、二級戊基(1-甲基丁基)、三級戊基(1,1-二甲基丙基)、新戊基(2,2-二甲基丙基)、異戊基(3-甲基丁基)、3-戊基(1-乙基丙基)、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、正己基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-1-甲基丁基等。

作為「C ₃~C ₁₀二級烷基」的具體例，可舉出異丙基、二級丁基、二級戊基、3-戊基、1,2-二甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1-乙基丁基等。作為「具有不對稱碳的C ₄~C ₁₀二級烷基」的具體例，可舉出二級丁基、二級戊基、1,2-二甲基丙基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1-乙基丁基等。

作為「C ₄~C ₁₀三級烷基」的具體例，可舉出三級丁基、三級戊基、1,1,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1-乙基-1-甲基丁基等。作為「具有不對稱碳的C ₄~C ₁₀三級烷基」的具體例，可舉出1-乙基-1-甲基丁基等。

本說明書中「烯基」，是指具有至少1個雙鍵(2個鄰接SP2碳原子)的一價基。根據雙鍵及取代部分(如果存在時)的配置，雙鍵的幾何學形態可採反側(entgegen)(E)或同側(zusammen)(Z)、順式或反式配置。烯基包含直鏈狀者，亦包含支鏈狀者。作為烯基，較佳可舉出C ₂~C ₁₀烯基，更佳為C ₂~C ₆烯基，具體而言，可舉出例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包含順式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、3-甲基-2-丁烯基、己烯基等。

本說明書中的「炔基」為具有至少1個三鍵(2個鄰接SP碳原子)的一價基。炔基包含直鏈狀者，亦包含支鏈狀者。作為炔基，較佳可舉出C ₂~C ₁₀炔基，更佳為C ₂~C ₆炔基，具體而言，可舉出例如乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基、3-苯基-2-丙炔基、3-(2'-氟苯基)-2-丙炔基、2-羥基-2-丙炔基、3-(3-氟苯基)-2-丙炔基、3-甲基-(5-苯基)-4-戊炔基等。

本說明書中「環烷基」表示飽和或部分飽和的環狀一價脂肪族烴基，包含單環、雙環、螺環。作為環烷基較佳可舉出C ₃-C ₈環烷基。具體而言，可舉出例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、雙環[2.2.1]庚基、螺[3.3]庚基等。

本說明書中「芳基」是指一價的芳香族烴環、以及芳香族烴環基。作為芳基較佳可舉出C ₆-C ₁₀芳基。具體而言，可舉出例如苯基、萘基(例如，1-萘基、2-萘基)等。

本說明書中的「雜芳基」是指除碳原子外含有1~5個雜原子的芳香族性的環狀一價基、以及芳香族雜環基。環可為單環，也可和其他環縮合的環，也可以部分被飽和。構成雜芳基的環的原子數可為5~10(5~10員雜芳基)，較佳為5~7(5~7員雜芳基)。作為雜芳基，具體而言，可舉出例如呋喃基(furyl)、噻吩基(thienyl)、吡咯基(pyrrolyl)、咪唑基(imidazolyl)、吡唑基(pyrazolyl)、噻唑基(thiazolyl)、異噻唑基(isothiazolyl)、㗁唑基(oxazolyl)、異㗁唑基(isoxazolyl)、㗁二唑基(oxadizolyl)、噻二唑基(thiadizolyl)、三唑基(triazolyl)、四唑基(tetrazolyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基(pyrimidyl)、嗒𠯤基(pyridazinyl)、吡𠯤基(pyrazinyl)、三𠯤基(triazinyl)、苯并呋喃基(benzofuranyl)、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并噻二唑基(benzothiadiazolyl)、苯并噻唑基(benzothiazolyl)、苯并㗁唑基(benzoxazolyl)、苯并㗁二唑基(benzoxadiazolyl)、苯并咪唑基(benzoimidazolyl)、苯并三唑基、吲哚基(indolyl)、異吲哚基(isoindolyl)、吲唑基(indazolyl)、氮雜吲哚基(azaindolyl)、喹啉基(quinolyl)、異喹啉基(isoquinolyl)、噌啉基(cinnolinyl)、喹唑啉基(quinazolinyl)、喹㗁啉基(quinoxalinyl)、苯并間二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、吲哚𠯤基(indolizinyl)、咪唑并吡啶基(imidazopyridyl)、吡唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、三唑并吡啶基(triazolopyridyl)、吡咯并吡𠯤基(pyrrolopyrazinyl)、呋喃吡啶基(furopyridyl)等。

本說明書中的「芳烷基(芳基烷基)」是指前述定義的「烷基」的至少一個氫原子被前述定義的「芳基」所取代的基，作為芳烷基較佳為C ₇~C ₁₄芳烷基，更佳為C ₇~C ₁₀芳烷基。作為芳烷基，具體而言，可舉出例如苄基、苯乙基、3-苯丙基等。

本說明書中「烷氧基」是指與前述定義的「烷基」鍵結的氧基。作為烷氧基較佳可舉出C ₁-C ₆烷氧基。作為烷氧基，具體而言，可舉出例如甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、二級丁氧基、三級丁氧基、戊氧基、3-甲基丁氧基等。

本說明書中的「胺基」，狹義是指-NH ₂，廣義是指-NRR'，此處R及R'獨立選自由氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基、或雜芳基，或者R及R'和該等鍵結的氮原子共同形成環。胺基較佳為NH ₂、單C ₁~C ₆烷胺基、二C ₁~C ₆烷胺基、4~8員環狀胺基等。

本說明書中的「單烷胺基」是指前述定義的「胺基」之中的R為氫原子，且R'為前述定義的「烷基」的基。作為單烷胺基較佳可舉出單C ₁~C ₆烷胺基。作為單烷胺基，具體而言，可舉出例如甲胺基、乙胺基、正丙胺基、異丙胺基、正丁胺基、二級丁胺基、三級丁胺基等。

本說明書中的「二烷胺基」是指前述定義的「胺基」之中的R及R'獨立為前述定義的「烷基」的基。作為二烷胺基，較佳可舉出二C ₁~C ₆烷胺基。作為二烷基胺基，具體而言，可舉出例如二甲胺基、二乙胺基等。

本說明書中的「環狀胺基」是指前述定義的「胺基」之中R及R'和與該等鍵結的氮原子共同形成環的基。作為環狀胺基，較佳可舉出4~8員環狀胺基。作為環狀胺基，具體而言，可舉出例如1-氮雜環丁烷基(1-azetidyl)、1-吡咯烷基(1-pyrrolidyl)、1-哌啶基(1-piperidyl)、1-哌𠯤基(1-piperazyl)、4-嗎啉基(4-morpholinyl)、3-㗁唑啶基(3-oxazolidyl)、1,1-二氧化硫代嗎啉-4-基(1,1-dioxidethiomorpholinyl-4-yl)、3-氧雜-8-氮雜雙環[3.2.1]辛烷-8-基(3-oxa-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl)等。

在本說明書所載的製造方法中，當所定義的基團在實施方法的條件下受到不欲的化學變換時，可經由使用例如官能基的保護、脫保護等的手段，製造該化合物。此處保護基的選擇及脫接操作可舉出例如「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis” (第5版，John Wiley & Sons 2014)」所載之方法，視反應條件適當使用此等。又，也可視需要變換取代基導入等的反應步驟的順序。

本說明書中「胺基的保護基」，可舉出胺甲酸酯型的保護基、醯胺型的保護基、芳基磺醯胺型的保護基、烷基胺型的保護基、醯亞胺型的保護基等。具體而言，例示為Fmoc、Boc、Alloc、Cbz、Teoc、三氟乙醯基、五氟丙醯基、鄰苯二甲醯基、苯磺醯基、甲苯磺醯基(tosyl)、對硝基苯磺醯基(nosyl)、二硝基對硝基苯磺醯基、三級丁基、三苯甲基(trityl)、異丙苯基、苯亞基(benzylidene)、4-甲氧基苯亞基、二苯基亞甲基(diphenylmethylidene)等。

本說明書中的「經保護的胺基」是指以任意的保護基所保護的胺基。作為經保護的胺基，具體而言，可舉出例如以上述胺基的保護基所保護的胺基。

本說明書中「羥基的保護基」，可舉出烷基醚型的保護基、芳烷基醚型的保護基、矽基醚型、碳酸酯型的保護基等。作為羥基的保護基，具體而言，例示為甲氧基甲基基、芐基氧基甲基、四氫哌喃基、三級丁基、烯丙基、2,2,2-三氯乙基、芐基、4-甲氧基芐基、三甲基矽基、三乙基矽基、三異丙基矽基、三級丁基二甲基矽基、三級丁基二苯基矽基、甲氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基等。

本說明書中「經保護的羥基」是指以任意的保護基所保護的羥基。作為經保護的羥基，具體而言，可舉出例如以上述羥基的保護基所保護的羥基。

本說明書中「羧基的保護基」，可舉出烷基酯型的保護基、苄基酯型的保護基、經取代的烷基酯型的保護基等。作為羧基的保護基，具體而言，例示為甲基、乙基、三級丁基、苄基、三苯甲基、異丙苯基、甲氧基三苯甲基、2-(三甲矽基)乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基等。

本說明書中，「經保護的羧基」是指以任意的保護基所保護的羧基。作為經保護的羧基，具體而言，可舉出例如以上述羧基的保護基所保護的羧基。

本說明書中的「胜肽」為天然胺基酸及/或非天然胺基酸以醯胺鍵或酯鍵鍵結形成的胜肽，則未特別限定。作為胜肽，較佳為5~30個殘基、更佳為7~15個殘基、再更佳為9~13個殘基的胜肽。胜肽可為直鏈胜肽亦可為環狀胜肽。

本說明書中的「胜肽化合物」為天然胺基酸及/或非天然胺基酸藉由醯胺鍵且一部分藉由酯鍵連結的胜肽化合物則並未特別限定，較佳為5~30殘基，更佳為8~15殘基，再更佳為9~13殘基的胜肽化合物。本實施形態中合成的胜肽化合物，以1個胜肽中包含至少3個N取代胺基酸為佳，以包含至少5個以上N取代胺基酸更佳。該等的N取代胺基酸於胜肽化合物中可連續存在，亦可不連續存在。本實施形態中的胜肽化合物可為直鏈狀亦可為環狀，以環狀胜肽化合物為佳。作為胜肽化合物，較佳為5~30殘基，更佳為8~15殘基、再更佳為9~13殘基的胜肽化合物。又，作為胜肽化合物，以1個胜肽化合物包含至少3個N取代胺基酸為佳，以包含至少5個以上N取代胺基酸更佳。該等的N取代胺基酸於胜肽化合物中可連續存在，亦可不連續存在。本實施形態中的胜肽化合物可為直鏈狀亦可為環狀，以環狀胜肽化合物為佳。

本說明書中的「環狀胜肽化合物」是能夠將直鏈胜肽化合物任意的基彼此鍵結環化而獲得的環狀的胜肽化合物。作為環狀胜肽化合物的環化態樣，可為藉由醯胺鍵等碳-氮鍵的環化、酯鍵或醚鍵等碳-氧鍵的環化、硫醚鍵等碳-硫鍵的環化、碳-碳鍵的環化或雜環結構的環化等如此的形態。其中，以透過醯胺鍵、碳-硫鍵或碳-碳鍵等共價鍵結等的環化為佳。以藉由醯胺鍵的環化特佳，環化使用的羧基或胺基的位置可在主鏈上亦可在側鏈上。較佳地，透過側鏈的羧基與N端主鏈的胺基之醯胺鍵的環化。

胜肽化合物的「環化」是指形成包含4個以上的胺基酸殘基之環狀部。本說明書中環狀胜肽化合物的環狀部所含的胺基酸數目並未特別限定，例示為4~20個殘基、5~15個殘基、6~13個殘基。將直鏈狀的胜肽化合物轉換為環狀胜肽化合物的方法，可根據Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition(R. C. Larock著)、或者March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition、(M. B. Smith, J. March著)等所記載之方法，經由在分子內進行鍵形成反應而實施。在鍵形成反應之後，也可再進行官能基轉換反應。鍵形成反應，例示為由羧酸和胺所形成的C(O)-N鍵；利用氧原子的C-O-C鍵、C(O)-O鍵、C(S)-O鍵；利用硫原子的C(O)-S鍵、C(S)-S鍵、C-S-S-C鍵、C-S-C鍵、C-S(O)-C鍵、C-S(O ₂)-C鍵；利用氮原子的C-N-C鍵、C=N-C鍵、N-C(O)-N鍵、N-C(S)N鍵、C(S)-N鍵等。再者，可舉出鈴木反應、Heck反應、Sonogashira反應等的以過渡金屬為觸媒的C-C鍵的形成反應等。作為鍵形成反應之後，再進行的官能基轉換反應，例示為氧化反應或還原反應。具體而言，例示為使硫原子氧化，轉換成亞碸基或磺酸基的反應。又，例示為碳-碳鍵之中，使三鍵或雙鍵還原，轉換成雙鍵或單鍵的還原反應。當2個胺基酸在胺基酸的主鏈鍵結時，因胜肽鍵而形成閉環結構，但透過2個胺基酸的側鏈彼此、側鏈和主鏈的鍵結等，2個胺基酸間也可形成共價鍵結。

本說明書中的「膜」為能夠於固相法的胜肽化合物合成使用的膜則並未特別限定。作為如此的膜，具體而言，可舉出例如纖維素膜、聚丙烯膜、或聚胺乙基甲基丙烯醯胺膜等，以纖維素膜為佳。

本說明書中的「胺基修飾膜」是指例如在纖維素膜或聚丙烯膜的表面具有胺基等進行化學修飾的膜，為能夠於固相法的胜肽化合物合成使用的膜則並未特別限定。作為如此的胺基修飾膜，具體而言，能夠例如根據Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174等所載的習知手法(Preparation of a Cellulose Membrane for Spot Synthesis)等，將纖維素膜具有的羥基與β-丙胺酸等羧基等酯鍵結而進行製備。又，作為經胺基修飾的膜，具體而言，能夠購自例如CEM社(舊名Intavis社)的Amino-PEG500-UC540 Sheets、進一步安裝於加工成盤(disc)狀的框(frame)而作成的CelluSpots 384 frame with acid stable discs等市售品。再者，本說明書中，「膜盤」亦有記載成「膜」的情況。

本說明書中，對於包含膜的固相的擔載量及擔載率為能夠於固相法的胜肽化合物合成使用者則並未特別限定。在部分態樣中，可在延長胺基酸之際降低擔載量及擔載率。例如，可為將Fmoc-Photo-Linker與4-苯氧丁酸以任意比例混合延長等，使擔載量及擔載率適當降低等方法，該方法並未特別限定。

本說明書中「固相合成用樹脂」只要能夠於固相法的胜肽化合物合成使用者即可，並無特別限定。作為如此的固相合成用樹脂，具體而言，可舉出例如，CTC樹脂、NovaSyn TGT樹脂(TGT樹脂)、Wang樹脂、SASRIN樹脂、三苯甲基氯樹脂(Trt樹脂)、4-甲基三苯基氯甲烷(4-methyltrityl chloride)樹脂(Mtt樹脂)、4-甲氧基三苯基氯甲烷樹脂(Mmt樹脂)等在酸性條件可去除者。樹脂可配合所使用的胺基酸的官能基適當選擇。例如，作為胺基酸的官能基，使用羧基(主鏈羧基，或以Asp、Glu為代表的側鏈羧基)，或者，芳香環上的羥基(以Tyr為代表的苯酚基)時，作為樹脂，以使用三苯甲基氯樹脂(Trt樹脂)或2-氯代三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂)為佳。作為胺基酸的官能基，使用脂肪族羥基(以Ser或Thr為代表的脂肪族醇基)時，作為樹脂，以使用三苯甲基氯樹脂(Trt樹脂)、2-氯代三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂)或4-甲基三苯基氯甲烷樹脂(Mtt樹脂)為佳。再者，本說明書中，樹脂亦有記載成resin的情況。

關於構成樹脂的聚合物的種類並無特別限定。藉由聚苯乙烯所構成的樹脂的情況時，可使用100~200 mesh或200~400 mesh的任一種。此外，關於交聯率雖然無特別限定，但以1%DVB(二乙烯苯，divinylbenzene)交聯者為佳。此外，作為構成樹脂的聚合物的種類，可舉出TentaGel(註冊商標)或是ChemMatrix(註冊商標)。

本說明書所載的化合物可為其鹽或其溶媒合物。化合物的鹽，例如包含鹽酸鹽；氫溴酸鹽；氫碘酸鹽、磷酸鹽；膦酸鹽；硫酸鹽；甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等的磺酸鹽；乙酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、水楊酸鹽等的羧酸鹽；或鈉鹽、鉀鹽等的鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等的鹼土類金屬鹽；銨鹽、烷基銨鹽、二烷基銨鹽、三烷基銨鹽、四烷基銨鹽等的銨鹽等。此等的鹽例如藉由使化合物與酸或鹼接觸而製造。化合物的溶劑合物是指化合物與溶媒一起形成一個分子集團者，藉由溶媒所形成的溶媒合物者，並未特別限制。作為此例，不只和水合物、醇合物(乙醇合物、甲醇合物、1-丙醇合物、2-丙醇合物等)、二甲基甲醯胺等的單獨的溶劑的溶媒合物，也可舉出針對化合物1分子與複數個溶媒形成溶媒合物者、或者針對化合物1分子與複數種溶媒形成溶媒合物者。溶媒為水時，則稱為水合物。本發明之化合物的溶媒合物，較佳為水合物，如此的水合物可舉出例如1~10水合物，較佳為1~5水合物，更佳為1~3水合物。

本說明書中的「胺基酸」，包含天然胺基酸及非天然胺基酸(亦有稱為胺基酸衍生物的情況)。又，本說明書中的「胺基酸」有表示胺基酸殘基的情況。本說明書中的「天然胺基酸」，是指甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、苯丙胺酸(Phe)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)、組胺酸(His)、麩胺酸(Glu)、天冬胺酸(Asp)、麩醯胺(Gln)、天冬醯胺酸(Asn)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、脯胺酸(Pro)。非天然胺基酸(胺基酸衍生物)並無特別限制，可例示β-胺基酸、D型胺基酸、N-取代胺基酸、α,α-雙取代胺基酸、側鏈與天然胺基酸不同的胺基酸、羥基羧酸等。作為本說明書中的胺基酸，容許任意的立體配置。胺基酸的側鏈的選擇雖然無特別限制，氫原子之外，例如，還可從烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環烷基、螺環結合的環烷基中自由地選擇。其各別上可賦予取代基，此等取代基也沒有限制，可以從包括例如，鹵素原子、O原子、S原子、N原子、B原子、Si原子或P原子的任意的取代基當中，獨立地自由選擇1個或2個以上。亦即，可例示為可經取代的烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基等、或側氧基、胺羰基、鹵素原子等。在非限定的一態樣中，本說明書中的胺基酸，可以是在同一分子內具有羧基及胺基的化合物(即使是此情況，脯胺酸、羥基脯胺酸之類的亞胺基酸也包含在胺基酸中)。

胺基酸的主鏈胺基可以是非取代(-NH ₂)亦可以是經取代(亦即，-NHR基。在此，R表示可具有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基，或如脯胺酸，鍵結在N原子的碳鏈與α位的碳原子形成環)。此類主鏈胺基經取代的胺基酸，在本說明書中有稱為「N取代胺基酸」的情況。作為本說明書中的「N-取代胺基酸」，較佳可例示N-烷基胺基酸、N-C ₁-C ₆烷基胺基酸、N-C ₁-C ₄烷基胺基酸、N-甲基胺基酸、N-C ₂-C ₆烯基胺基酸、N-烯丙基胺基酸、N-C ₇-C ₁₄芳烷基胺基酸、N-苄基胺基酸、N-苯乙基胺基酸，但不限於此。

本說明書中的「α,α-二取代胺基酸」，具體而言，可舉出例如Aib、(Me)Abu、(Me)Leu、(Me)Algly、(Me)Phe、(Me)Phe(3-I)、1-ACPrC、cVal、cLeu、cHex、Athpc等。

本說明書中的「β-支鏈胺基酸」，具體而言，可舉出例如MeVal、D-MeVal、Val、Ile、MeIle、MeChg、Chg、MeGly(cPent)、Gly(cPent)、MeGly(cBu)、Gly(cBu)、MeGly(cPr)、Gly(cPr)、MeThr(tBu)、以及Thr(tBu)等。

本說明書中例示的α,α-二取代胺基酸、β-支鏈胺基酸的縮寫及其結構的關係如下文所示。再者，下文的表中，列舉出各胺基酸以Fmoc基保護胺基的形態，但去除Fmoc基而具有游離胺基的各胺基酸或其殘基的縮寫及其結構的關係亦可自下表理解。具體而言，例如MeVal-OH為自下表的Fmoc-MeVal-OH去除Fmoc基而具有以下結構的胺基酸對於所屬領域中具有通常知識者而言是顯而易見的，作為該胺基酸殘基的MeVal的結構對於所屬領域中具有通常知識者而言亦是顯而易見的。 [化3]

阿

本說明書中的「胺基酸」包括各別所對應的全部同位素(isotope)。「胺基酸」的同位素為至少1個原子被原子編號(質子數)相同，質量數(質子與中子的數的總和)相異的原子以與天然的存在比不同的存在比取代者。作為本說明書中的「胺基酸」中所含的同位素的例子，有氫原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，分別包括 ²H、 ³H、 ¹³C、 ¹⁴C、 ¹⁵N、 ¹⁷O、 ¹⁸O、 ³²P、 ³⁵S、 ¹⁸F、 ³⁶Cl等。含有所有比例的放射性或非放射性的同位素的本說明書的化合物包含在本發明的範圍內。

(製造方法) 本實施形態的藉由固相法製造胜肽化合物的方法，其包括：準備擔載於固相，第一胺基酸或第一胜肽之準備步驟；以及將第一胺基酸或第一胜肽、與第二胺基酸或第二胜肽在縮合劑及添加劑的存在下進行縮合之縮合步驟。

在一些態樣中，藉由本實施形態的製造方法獲得的胜肽化合物可為藉由固相法的胺基酸或胜肽的延長步驟的中間體亦可為最終產物。延長步驟能夠根據期望的胜肽化合物的胺基酸序列長度進行複數次，本實施形態的縮合步驟是至少包含1次在該延長步驟中，亦可包含複數次。延長步驟中，本實施形態的縮合步驟以外的縮合步驟能夠使用本技術領域習知的方法。

在一些態樣中，本實施形態的縮合步驟用於延長步驟的最終步驟時，藉由本實施形態的縮合步驟獲得的縮合體可成為具有期望序列的胜肽化合物。另一方面，除了本實施形態的縮合步驟可根據習知的方法進一步延長，獲得具有期望序列的胜肽化合物時，根據本實施形態的縮合步驟獲得的縮合體作為肽化合物的部分結構包括在其中。

在本實施形態的準備步驟，準備擔載於固相的第一胺基酸或第一胜肽。作為固相，具體而言，例如可舉出膜或固相合成用樹脂。

本說明書中的自包含膜的固相切出胜肽的步驟中，作為切斷切割部位的態樣，可例如為藉由UV照射切斷光裂解性部位、藉由還原條件切斷雙硫鍵、藉由弱酸條件切斷酸不穩定部位等的形態。

固相與第一胺基酸或第一胜肽亦可透過光裂解性部位結合。光裂解性部位為藉由吸收光而裂解的部位。導致光裂解性部位裂解的吸収波長可為300nm以上、320nm以上、340nm以上、或350nm以上，可為500nm以下、450nm以下、400nm以下、380nm以下、或370nm以下。導致光裂解性部位裂解的吸収波長可為300nm以上且500nm以下，可為350nm以上且370nm以下。照射的光波長，自處理性優異的觀點而言，可為UV-A區域的波長。UV-A區域的波長是指320~400nm波長的光。

光裂解性部位可具有硝基藜蘆基氧基羰基殘基、或香豆素殘基。

固相與第一胺基酸或第一胜肽亦可透過雙硫鍵結合。雙硫鍵能夠藉由在含有(參(2-羧基乙基)膦的水/DMF溶液等還原條件下進行切斷，以自固相切出作為目標的胜肽。

固相與第一胺基酸或第一胜肽亦可透過酸不穩定部位結合。酸不穩定部位能夠藉由例如TFA/DCM溶液或含有DIPEA的TFE/DCM溶液等酸性條件進行分解，以自固相切出作為目標的胜肽。

酸不穩定部位可具有三苯甲基酯結構、氯三苯甲基酯結構、烷氧基苄基醚結構、三烷氧基苄基胺羰基結構、二烷氧基苯基-烷氧基苯甲基胺羰基結構、或烷氧基𠮿 -9-基胺羰基結構。

固相與第一胺基酸或第一胜肽亦可透過可藉由酸切出胜肽的基團結合。作為具有可藉由酸切出胜肽的基團的固相，具體而言，例如可舉出CTC樹脂、NovaSyn TGT樹脂(TGT樹脂)、Wang樹脂、SASRIN樹脂、三苯甲基氯樹脂(Trt樹脂)、4-甲基三苯基氯甲烷樹脂(Mtt樹脂)、4-甲氧基三苯基氯甲烷樹脂(Mmt樹脂)等固相合成用樹脂。

固相為膜的情況下，作為相對於第一胺基酸或第一胜肽的膜的擔載量，可使用任意的量，例如基於Fmoc定量法，可使用5 nmol/cm ²以上、500 nmol/cm ²以下的量，即使在20 nmol/cm ²以上、50 nmol/cm ²以上、100 nmol/cm ²以上、進一步在200 nmol/cm ²以上的高擔載量亦能夠有效地進行反應。又，固相為固相合成用樹脂的情況下，作為相對於第一胺基酸或第一胜肽的固相合成用樹脂的擔載量，可使用任意的量，例如基於Fmoc定量法，可使用0.1 mmol/g以上、0.8 mmol/g以下的量，即使在0.2 mmol/g以上、0.3 mmol/g以上、進一步在0.4 mmol/g以上的高擔載量亦能夠有效地進行反應。

在本實施形態的縮合步驟(縮合反應)中，相對於第一胺基酸或第一胜肽，可以等量或過量使用第二胺基酸或第二胜肽。具體而言，第二胺基酸或第二胜肽相對於第一胺基酸或第一胜肽的莫耳比能夠藉由確定選自由1、2、3、5、7、以及10所組成之群組的下限，以及選自由3、5、7、10、15、25、50、100、300、500以及700所組成之群組的上限之組合作為可能的範圍。第二胺基酸或第二胜肽相對於第一胺基酸或第一胜肽的莫耳比以1.5以上為佳，以2以上為更佳。又，第二胺基酸或第二胜肽相對於第一胺基酸或第一胜肽的莫耳比，以50以下為佳，以15以下為更佳。第二胺基酸或第二胜肽相對於第一胺基酸或第一胜肽的莫耳比，以7~15為最佳。

作為本實施形態的縮合步驟使用的添加劑，可舉出Oxyma、HOBt、HOOBt、或HOAt等。

本實施形態的縮合步驟中，添加劑可使用較第二胺基酸或第二胜肽的莫耳數更少的莫耳數。換言之，添加劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比為小於1。該莫耳比為0.8以下，例如以0.1~0.8為佳。在此情況下，作為該莫耳比，例如，添加劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比能夠藉由確定選自由0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6以及0.7所組成之群組的下限、以及選自由0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7以及0.8所組成之群組的上限的組合作為可能的範圍。添加劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比，以0.3~0.7為更佳。

本實施形態的縮合步驟所使用的縮合劑包含以下述通式(A)表示的至少1種碳二亞胺系縮合劑。 R ^A-N=C=N-R ^B･･･(A) 式中，R ^A為C ₄~C ₁₀二級或三級烷基，R ^B為C ₂~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^A及R ^B中的各基可獨立選自由鹵素、C ₁~C ₆烷氧基、二C ₁~C ₆烷胺基、或4~8員環狀胺基中的1或複數個基所取代。通式(A)表示的碳二亞胺系縮合劑，具體而言，例如可舉出DsBC、tBEC、DtBC等。

本實施形態的縮合步驟所使用的縮合劑亦可包含下述通式(A’)表示的至少1種碳二亞胺系縮合劑。 R ^A’-N=C=N-R ^B’･･･(A’) 式中，R ^A’為C ₃~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^B’為C ₁~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^A’及R ^B’中的各基可獨立選自由鹵素、C ₁~C ₆烷氧基、二C ₁~C ₆烷胺基、或4~8員環狀胺基中的1或複數個基所取代。但，R ^A’中的總碳數為4以上。通式(A’)表示的碳二亞胺系縮合劑，具體而言，例如可舉出DsBC、tBEC、DtBC、EDCI等。

本實施形態的縮合步驟中，縮合劑可使用與第二胺基酸或第二胜肽等量的莫耳數、或較其更多的莫耳數。具體而言，本實施形態的縮合步驟中，縮合劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比可設為1以上的範圍、2以上的範圍、3以上的範圍或4以上的範圍。更具體而言，縮合劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比能夠藉由確定選自由1.0、1.1、1.2、1.5、2.0、3.0、以及4.0所組成之群組的下限、以及選自由1.5、2.0、3.0、4.0、以及5.0所組成之群組的上限的組合作為可能的範圍。作為縮合劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比的較佳範圍，可舉出1.0~5.0、1.1~4.0、1.1~3.0、1.2~2.0、1.2~1.5。

本實施形態的縮合步驟中，縮合劑及添加劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比， 縮合劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比，能夠藉由確定選自由1.0、1.1、1.2、1.5、2.0、3.0、以及4.0所組成的值之下限、以及選自由1.5、2.0、3.0、4.0、以及5.0所組成的值之上限的組合作為可能的範圍， 添加劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比，能夠藉由確定選自由0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6以及0.7所組成的值之下限、以及選自由0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9以及1.0所組成的值之上限的組合作為可能的範圍。 作為縮合劑及添加劑相對於第二胺基酸或第二胜肽的莫耳比，較佳為第二胺基酸或第二胜肽：縮合劑：添加劑=約2：約2.4~3.2：約0.4~1.4。

本實施形態的縮合步驟能夠在0~100℃，較佳為10~60℃，更佳為20~50℃的反應溫度下進行。

本實施形態的縮合步驟能夠以10分鐘~2日，較佳為10分鐘~6小時，更佳為30分鐘~60分鐘的反應時間進行。又，亦能夠重複2次以上。

本實施形態的縮合步驟中，較佳地，添加劑為HOAt、HOOBt、或Oxyma，且縮合劑為DsBC。

本實施形態的縮合反應能夠在適當的溶媒中進行。溶媒能夠使用非質子性溶媒，可舉出醯胺系溶媒、酯系溶媒、醚系溶媒、烷基腈系溶媒、以及尿素系溶媒等。作為醯胺系溶媒，可舉出DMF、DMA、以及NMP。作為酯系溶媒，可舉出乙酸乙酯、以及二甲基碳酸酯等。作為醚系溶媒，可舉出四氫呋喃、以及2-甲基四氫呋喃等。作為烷基腈系溶媒，可舉出乙腈等。作為尿素系溶媒，可舉出DMI、以及TMU等。

本實施形態的縮合步驟能夠藉由將擔載於固相的第一胺基酸或第一胜肽與第二胺基酸或第二胜肽、縮合劑、以及添加劑接觸而進行。將第一胺基酸或第一胜肽與第二胺基酸或第二胜肽、縮合劑、以及添加劑接觸的順序可為任意，對於第一胺基酸或第一胜肽，可與第二胺基酸或第二胜肽、縮合劑、以及添加劑同時接觸，亦可依序接觸。亦可將第一胺基酸或第一胜肽、與第二胺基酸或第二胜肽、縮合劑、以及添加劑的所有或者任一者預先混合而成者進行接觸。將第一胺基酸或第一胜肽與第二胺基酸或第二胜肽、縮合劑、以及添加劑接觸之際，亦可使用將其與適當溶媒混合而成者。

本實施形態的方法亦可使用固相合成裝置進行。在一些態樣中，本實施形態的方法能夠在適當的溶媒中將擔載於固相的第一胺基酸或第一胜肽與第二胺基酸或第二胜肽、縮合劑以及添加劑混合而進行。固相為固相合成用樹脂時，將固相合成用樹脂與其試劑類進行混合之際，作為該前處理，藉由與適當的溶媒接觸，使固相合成用樹脂澎潤，而能夠有效地進行目標的縮合反應。於此前處理使用的溶媒的量為只要使膨潤的樹脂浸入至溶媒中則能夠使用任意的量，例如，作為溶媒使用DMF的情況時，可使用3v/w~15v/w，較佳為4v/w~10v/w，更佳為4v/w~8v/w的量。溶媒量記載成4v/w時，表示相對於樹脂重量1g，溶媒量為4mL。

反應結束後，藉由自膜或固相合成裝置排出反應液，以適當的溶媒清洗殘留的膜或固相合成用樹脂，使過剩的試劑或副產物排出，能夠取得結合至膜或固相合成用樹脂的目標的胜肽化合物。作為適合用於清洗及/或膨潤膜或固相合成用樹脂的溶媒，例示為醯胺系或溶媒醇系溶媒，以DMF或乙醇或者2-丙醇為佳。該等溶媒可使用複數次，亦可交互使用。經膨潤的固相合成用樹脂能夠根據需要進行收縮，可使用醇系溶媒或醚系的溶媒清洗樹脂。作為醇系溶媒，以甲醇為佳，作為醚系的溶媒，以甲基三級丁基醚(MTBE)為佳。

在一些態樣中，亦可在進行縮合反應之前，預先製備於溶媒中事前混合第二胺基酸或第二胜肽、縮合劑、以及添加劑的混合物，並使用於縮合反應。混合時間並未特別限定，較佳為0分鐘~2小時，更佳為0分鐘~1小時，再更佳為約15分。

使用自動合成裝置的樹脂的攪拌或搖動對於使樹脂充分滲透到反應溶液中以允許反應如需要的方式進行可能是重要的。攪拌速度、搖動速度、其頻率並未特別限定，但由於過度攪拌可能導致樹脂的物理性損傷的可能，因而可舉出例如實施每1小時以60rpm攪拌約2分鐘的例子。又，如果滲透充分，則不一定需要進行攪拌或搖動。

在一些態樣中，本實施形態的方法亦可進一步包括去除膜及固相合成用樹脂的步驟，其能夠使用本技術領域中習知的方法。能夠使延長至期望序列的胜肽化合物自膜及樹脂脫離、分離。

在一些態樣中，本實施形態的方法亦可進一步包括去除保護基的步驟，其能夠使用本技術領域中習知的方法。例如，可舉出「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis” (第5版，John Wiley & Sons 2014)」所載之方法，其可根據反應條件適當使用。具體而言，第二胺基酸的胺基、或第二胜肽的N端的胺基酸的胺基被保護基保護時，可藉由去除該保護基，以為下一步的縮合反應準備。保護基可與縮合反應同時去除，亦可與縮合反應分開去除。

在一些態樣中，本實施形態亦關於使用本實施形態的方法獲得直鏈胜肽化合物，接著藉由Comprehensive Organic Transformations、A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (R. C. Larock著)、或March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure、7th Edition (M. B. Smith, J. March著)等記載的習知方法使其N端側的基與C端側的基進行環化，以製造環狀胜肽化合物之方法。

再者，本說明書中所引用的所有先前技術文獻可併入本說明書中作為參照。 [實施例]

本發明藉由以下實施例進一步例示，但不限於下述實施例。再者，實施例中，使用以下簡寫。 Ac：乙醯基 DBU：1,8-二氮雜二環[5.4.0]-7-十一烯 DCE：1,2-二氯乙烷 DCM：二氯甲烷 DGDE：二乙二醇二乙醚 DIC：N,N’-二異丙基碳二亞胺 DIPEA：N,N-二異丙基乙胺 DMF：N,N-二甲基甲醯胺 DMSO：二甲基亞碸 DsBC：N,N’-二-二級丁基碳二亞胺 tBEC：1-三級丁基-3-乙基碳二亞胺 EDCI･HCl：1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 FA：蟻酸 Fmoc：9-茀基甲氧基羰基 HFIP：1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇 HOAt：1-羥基-7-氮雜苯并三唑 HOBt：1-羥基苯并三唑 HOOBt：3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三𠯤 MeCN：乙腈 NMP：N-甲基-2-吡咯啶酮 Oxyma：氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯 Oxyma B：5-(羥基亞胺基)-1,3-二甲基嘧啶-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮 PyOxim：[乙基氰基(羥基亞胺基)乙酸根-O2]三-1-吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽 TBME：三級丁基甲基醚 TFA：三氟乙酸 TFE：2,2,2-三氟乙醇 THF：四氫呋喃 THP：四氫哌喃 TIPS：三異丙基矽烷

又，LCMS等分析條件如下述表1及表2所示。 [表1] [表2]

本說明書內所載的胜肽合成中，使用表3~5所載的Fmoc保護的胺基酸。 [表3] [表4] [表5]

表3所載的Fmoc保護的胺基酸自商業上的供應商購入。 表4所載的Fmoc保護的胺基酸是根據WO2018/225864所載的方法合成。 表5所載的Fmoc保護的胺基酸是以實施例1-1所載的方法合成。

本說明書中，即使是相同化合物，亦有在LCMS(ESI)m/z的值±0.2左右，滯留時間±0.07分鐘左右的範圍內偏離的情況。

實施例1：本實施例中使用的Fmoc保護的胺基酸、脲以及擔載於膜的胜肽等的製備 使用購入自Intavis社(現為CEM社)的CelluSpots 384 frame with acid stable discs或Refill of two frames, 384 acid stable discs(胺基修飾膜)作為膜盤。

實施例1-1：化合物SS01，(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧基羰基(甲基)胺基]-4-(1-甲基-1-苯基-乙氧基)-4-側氧基-丁酸(Fmoc-MeAsp(OPis)-OH)的合成 [化4] 根據上述方案合成(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧基羰基(甲基)胺基]-4-(1-甲基-1-苯基-乙氧基)-4-側氧基-丁酸(Fmoc-MeAsp(OPis)-OH，SS01)。

實施例1-1-1：O4-烯丙基O1-甲基(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧基羰基(甲基)胺基]丁二酸(O4-allyl O1-methyl (2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]butanedioate)(化合物SS01a)的合成 [化5] 在氮氣氣氛下，以WO2018/124162所載的方法合成之(S)-2-((((9H-茀-9-基-)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-4-(烯丙基氧基)-4-側氧基丁酸(化合物pd04)(100.0 g, 244.2 mmol)添加至DCM(1.15 L)，於室溫下加入EDCI･HCl(60.87 g, 317.5 mmol)以及HOAt(43.22 g, 317.5 mmol)攪拌30分鐘。於室溫下將甲醇(8.61 g, 268.7 mmol)以及DIPEA(41.04 g, 317.5 mmol)加入至該溶液，攪拌3小時。之後加入DCM進行稀釋，以氯化銨水溶液以及飽和食鹽水清洗有機層之後，以硫酸鈉乾燥。濾去乾燥材料之後，將濾液進行減壓濃縮，獲得93 g作為粗產物的化合物SS01a(產率90%)。 LCMS (ESI) m/z=424.1[M+H] ⁺滯留時間：1.13分(分析條件SMD method_1)

實施例1-1-2：(3S)-3-[9H-茀-9-基甲氧基羰基(甲基)胺基]-4-側氧基-丁酸(化合物SS01b)的合成 [化6] 氮氣氣氛下，將化合物SS01a的粗產物(100.0 g，純度76%, 179.5 mmol)添加至DCM(350 mL)，於室溫下加入肆(三苯基膦)鈀(tetrakis(triphenylphosphine)palladium)(2.07 g, 1.795 mmol)以及苯基矽烷(13.60 g, 125.7 mmol)攪拌3小時。之後加入TBME進行稀釋，以飽和碳酸鈉水溶液萃取。將所得的水層以TBME清洗之後，加入0.1M磷酸水溶液成為酸性，以乙酸乙酯萃取水層2次。所得的有機層以飽和食鹽水清洗之後，以硫酸鈉乾燥。濾去乾燥材料之後，將濾液進行減壓濃縮，獲得82 g的化合物SS01b(產率110%)。 LCMS (ESI) m/z=384.4[M+H] ⁺滯留時間：1.32分(分析條件SMD method_2)

實施例1-1-3：O1-甲基O4-(1-甲基-1-苯基-乙基)(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧基羰基(甲基)胺基]丁二酸(化合物SS01c)的合成 [化7] 在氮氣氣氛下，將化合物SS01b(50.00 g, 130.4 mmol)添加至DCM(100 mL)，以WO2018/124162所載的方法合成的2,2,2-三氯乙醯亞胺酸2-苯基丙烷-2-酯(化合物aa09)(148.0 g, 527.5 mmol)的環己烷(400 mL)溶液於室溫下滴加並攪拌40小時。過濾混合物，將濾液進行減壓濃縮。所得的殘渣以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/石油醚)進行純化，獲得68g的化合物SS01c(產率101%)。 LCMS (ESI) m/z=524.2[M+Na] ⁺滯留時間：1.22分(分析條件SMD method_1)

實施例1-1-4：(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧基羰基(甲基)胺基]-4-(1-甲基-1-苯基-乙氧基)-4-側氧基-丁酸(化合物SS01，Fmoc-MeAsp(OPis)-OH)的合成 [化8] 將氯化鈣(248.9 g, 2243 mmol)及氫氧化鋰一水合物(25.10 g, 588.1 mmol)溶解於2-丙醇(3 L)以及H ₂O(750 mL)的混合溶媒，以冰浴冷卻至0℃。將化合物SS01c(75.00 g, 149.5 mmol)的THF(750 mL)溶液滴加至該溶液，於室溫下攪拌48小時。之後，過濾混合物，將濾液進行減壓濃縮以去除揮發性有機化合物。以乙酸乙酯萃取所得的溶液。以1M磷酸水溶液及飽和食鹽水清洗有機層之後，以硫酸鈉進行乾燥。濾去乾燥材料之後，將濾液進行減壓濃縮，所得的殘渣溶解於TBME及己烷的混合溶媒(1:1)。以飽和碳酸氫鈉水溶液萃取該溶液，以乙酸乙酯萃取該水層2次。所得的有機層以0.1M磷酸水溶液及飽和食鹽水清洗之後，以硫酸鈉乾燥。濾去乾燥材料之後，將濾液進行減壓濃縮，獲得60 g的化合物SS01(產率82%)。 LCMS (ESI) m/z=510.5[M+Na] ⁺滯留時間：1.95分(分析條件SMD method_3)

實施例1-2：本實施例中使用的擔載於膜的胺基酸及胜肽等的製備 本說明書中，膜或樹脂與化合物結合時，會有膜或樹脂部位以〇標記的情況。又，為了使膜部位的反應點明確為目的，會有以連接至〇的反應部位的化學結構標記的情況。例如，下述結構(Fmoc-MePhe-Photo-Linker-Membrane(化合物SS02))中，胺基修飾膜的胺基與Photo-Linker的羧酸形成醯胺鍵。 [化9]

本說明書中，以確認胺基酸的延長反應的生成物為目的，以LCMS測定使用延長後所得的膜，並自膜切出胜肽的反應後的溶液。示出具體的步驟。UV照射機器使用委託LMC社製作的UV-LED照射箱MUB-031或松電舍股份有限公司製的分離型UV-LED照射裝置」，對置於冰上或室溫下的反應容器中的延長後乾燥的膜盤以UV波長365nm、照度380~600mW/cm ²照射2分鐘30秒。之後對於膜添加100μL的DMSO，靜置15分鐘以上使胜肽溶解。將該溶液以LCMS進行分析。

實施例1-2-1：化合物SS02 (Fmoc-MePhe-Photo-Linker- Membrane)、化合物SS03 (Fmoc-Pro-Photo-Linker-Membrane)、化合物SS24 (Fmoc-MeAla-Photo-Linker-Membrane)、化合物SS25 (Fmoc-MeSer (THP)-Photo-Linker-Membrane)的合成 [化10] 於本實施例中使用的化合物SS02、SS03、SS24以及SS25的製備是使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis社製)，藉由Fmoc法進行。關於操作的詳細步驟是遵循合成機所附的手冊。關於反應條件是參考WO2018/225851，以以下的操作1或操作2的方法製備。再者，化合物SS02的製備中，是以Fmoc-Photo-Linker及Fmoc-MePhe-OH的順序，在化合物SS03的製備中，是以Fmoc-Photo-Linker及Fmoc-Pro-OH的順序，化合物SS24的製備中，是以Fmoc-Photo-Linker及Fmoc-MeAla-OH的順序化合物SS25的製備中，是以Fmoc-Photo-Linker及Fmoc-MeSer(THP)-OH的順序，各自作為Fmoc保護的胺基酸使用。

[操作1] 將構成作為目標的胜肽之Fmoc保護的胺基酸(0.6mol/L)與作為羧酸的活化劑的HOAt或Oxyma或HOOBt(0.375mol/L)溶解於NMP以製備溶液1。將N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)(0.71mol/L)與N,N-二甲基甲醯胺(DMF)混合，以製備溶液2。 將CelluSpots 384 frame with acid stable discs(Intavis社製的胺基修飾膜；下文亦稱為「膜盤」)設置於胜肽合成機。將溶液1及溶液2設置於胜肽合成機，以起始藉由胜肽合成機的自動合成。

脫Fmoc步驟 每1片膜盤添加2.0μL及4.0μL的DBU的DMF溶液(2%v/v)，於室溫下進行Fmoc基的脫保護。在第1個殘基延長前不需要進行脫保護，在第1個殘基延長之後的脫保護添加2.0μL後反應5分鐘之後，將溶液排出一次，並添加4.0μL進一步反應10分鐘，之後將溶液排除。接著，以DMF(每1片膜盤25μL)清洗7次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗2次，吸引壓乾燥15分鐘。

延長步驟 將溶液1與溶液2以5：6的比率在合成機的mixing vial進行混合並靜置15分鐘之後，每1片膜盤添加1.2μL，於室溫下反應40分鐘，以進行膜盤上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，使溶液排出。再更重複進行1次此縮合反應。接著，每1片膜盤添加4.0μL的乙酸酐(Ac ₂O)的DMF溶液(4%v/v)，於室溫下進行未反應胺的乙醯基封端。反應5分鐘之後，使溶液排出。接著以DMF(每1片膜盤25μL)清洗7次，以吸引壓乾燥10分鐘。 此Fmoc基的脫保護反應接著Fmoc保護的胺基酸的縮合反應、乙醯基封端作為1循環，重複進行此循環以在膜盤表面上使胜肽延長。最後的胺基酸延長後不進行脫Fmoc步驟，並以DMF(每1片膜盤25μL)清洗7次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗2次或3次，以吸引壓乾燥10~15分鐘之後，用於之後的探討。

[操作2] 將構成作為目標的胜肽之Fmoc保護的胺基酸(0.29mol/L)與作為羧酸的活化劑的HOAt或Oxyma或HOOBt(0.181mol/L)溶解於NMP/DMF=6.68/4.34或5/6的溶液以製備溶液1。將N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)的原液直接作為溶液2使用。 CelluSpots 384 frame with acid stable discs(Intavis社製)設置於胜肽合成機。將溶液1及溶液2設置於胜肽合成機，以起始藉由胜肽合成機的自動合成。

脫Fmoc步驟 以與[操作1]的脫Fmoc步驟同樣的方法進行。

延長步驟 將溶液1與溶液2以11.29：0.72的比率在合成機的mixing vial進行混合並靜置15分鐘之後，每1片膜盤添加1.2μL，於室溫下反應40分鐘，以進行膜盤上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，使溶液排出。再更重複進行1次此縮合反應。之後以與[操作1]的延長步驟同樣的方法進行。

實施例1-2-2：擔載於膜上的Fmoc-MePhe或Fmoc-Pro的切出及分析 使用操作1或操作2的方法製備之化合物SS02、SS03、SS24及SS25並以實施例1-2所載之方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS02*、SS03*、SS24*及SS25*)的生成。再者，本實施例中，化合物編號賦予*的情況，表示為了反應的確認而自膜盤切出胜肽進行確認的化合物。 [化11] LCMS (ESI) m/z=401.3[M+H] ⁺滯留時間：3.33分(分析條件SQDAA05long) [化12] LCMS (ESI) m/z=337.3[M+H] ⁺滯留時間：2.74分(分析條件SQDAA05long) [化13] LCMS (ESI) m/z=325.3[M+H] ⁺滯留時間：2.76分(分析條件SQDAA05long) [化14] LCMS (ESI) m/z=425.4[M+H] ⁺滯留時間：3.17分(分析條件SQDAA05long)

實施例1-2-3：擔載於膜上的Fmoc-胺基酸的擔載量確認 擔載Fmoc胺基酸的膜之擔載量的確認以以下方法進行。 以操作1或操作2的方法製備的化合物SS02、SS03、SS24、SS25(各膜盤1片)裝入反應容器，每1片膜盤添加DBU的DMF溶液(2%v/v)4.0μL，於室溫下反應5分鐘之後，再次添加4.0μL於室溫反應10分鐘以進行Fmoc基的脫保護。之後，每1片膜盤添加392μL的DMF以進行溶出，所得的溶液以LC/MS進行分析(注入量(injection volume)：5μL)。 [化15] 滯留時間：1.02分(分析條件SQDFA05_1) 源自化合物SS02的化合物SS04的波長304nm中UV面積值：16359.88 源自化合物SS03的化合物SS04的波長304nm中UV面積值：15793.11 源自化合物SS24的化合物SS04的波長304nm中UV面積值：18782.30 源自化合物SS25的化合物SS04的波長304nm中UV面積值：18300.73

又，將Fmoc-Gly-OH(3.51mg、0.012mmol)溶解於DBU的DMF溶液(1.5mL、0.201mmol)，於室溫下反應15分鐘以進行Fmoc基的脫保護。之後，將DMF(148.5mL)加入至反應混合液進行稀釋。所得的稀釋溶液以LC/MS進行分析(分析條件SQDFA05_1、注入量：5μL)。二苯并富烯(dibenzofulvene)的波長304nm中UV面積值為8903.11，根據此值計算出每1nmol的UV面積值(波長304nm)。使用該等值，並自以下公式計算出化合物SS02及化合物SS03的擔載量。 擔載量(nmol)=(化合物SS04的UV面積值(波長304nm))/(每1nmol二苯并富烯的UV面積值(波長304nm)) 結果，計算出化合物SS02、SS03、SS24、及SS25的擔載量各自為57.9nmol/膜盤、55.9nmol/膜盤、66.4nmol/膜盤、及64.7nmol/膜盤。 再者，以同樣合成具有不同擔載量的其他批次亦使用於胜肽合成或探討等。

實施例1-3：源自本實施例中使用的碳二亞胺的脲的合成 實施例1-3-1：1,3-二異丙基脲(DIC脲，化合物SS05)的合成 [化16] 於室溫下將TBME(31.5mL)添加至DIC(1.22mL、7.92mmol)之後，耗費5分鐘以上滴入乙酸(1.178mL、20.60mmol)使反應混合物於室溫下攪拌1小時半。之後藉由過濾回收產生的沉澱物，使用TBME清洗所得的固體，減壓下進行乾燥以獲得1,3-二異丙基脲(DIC脲，化合物SS05)(909.1mg、80%)。 ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 5.48 (2H, d, J= 7.2 Hz), 3.69-3.57 (2H, m), 1.00 (12H, d, J= 6.8 Hz)

實施例1-3-2：1,3-二-二級丁基脲(DsBC脲，化合物SS06)的合成 [化17] 於室溫下，將TBME(7.73mL)添加至DsBC(0.356μL、1.945mmol)之後，耗費5分鐘以上滴入乙酸(0.289μL、5.06mmol)使反應混合物於室溫下攪拌15分鐘。之後加入水(70.1μL、3.89mmol)，於室溫下攪拌2小時半。之後吹入氮氣並濃縮，加入水。藉由過濾回收產生的沉澱物，使用水清洗所得的固體，減壓下進行乾燥以獲得1,3-二-二級丁基脲(DsBC脲，化合物SS06)(210.7mg、63%)。 ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 5.46 (2H, d, J= 8.0 Hz), 3.50-3.43 (2H, m), 1.32 (4H, dq, J= 7.2, 7.2 Hz), 0.97 (6H, d, J= 6.8 Hz), 0.81 (6H, t, J= 7.2 Hz)

實施例1-3-3：1-(三級丁基)-3-乙脲(tBEC脲，化合物SS07)的合成 [化18] 於室溫下，將TBME(15.7mL)添加至tBEC(0.614μL、3.96mmol)之後，耗費5分鐘以上滴入乙酸(0.589μL、10.30mmol)使反應混合物於室溫下攪拌2小時半。之後吹入氮氣並濃縮，加入MeCN與水的1:2混合物。藉由過濾回收產生的沉澱物，使用MeCN與水的1：2混合物清洗所得的固體。將濾液進行減壓濃縮，加入水。藉由過濾回收產生的沉澱物，使用水清洗所得的固體。將2種所得的固體溶解於MeCN之後混合，進行減壓濃縮以獲得1-(三級丁基)-3-乙脲(tBEC脲，化合物SS07)(169.2mg、30%)。 ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 5.53 (2H, br), 2.98-2.91 (2H, m), 1.20 (9H, s), 0.95 (3H, t, J= 7.2 Hz)

實施例1-4：本實施例中使用的碳二亞胺的合成 [化19] 根據上述的方案合成N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)、N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)、以及N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)。

實施例1-4-1：1-(1-苯乙基)-3-二級丁基-硫脲(化合物SS26a)的合成 [化20] 於室溫下，將2-異硫氰酸丁烷(2-isothiocyanatobutane)(500μL、4.08mmol)及1-苯乙烷胺(phenylethanamine)(567μL、4.49mmol)添加至DCM(20.4mL)，於室溫下攪拌17小時。將混合物進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷)純化所得的殘渣2次，將化合物SS26a作為非鏡像異構物混合物獲得874.6mg(產率91%)。 LCMS (ESI) m/z=237.1[M+H] ⁺滯留時間：0.77分(分析條件SQDFA05_1)

實施例1-4-2：N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS26)的合成 [化21] 將化合物SS26a(149.6mg、0.633mmol)添加至DCM(6.329mL)，於冰冷下添加三乙胺(265μL、1.899mmol)、4-二甲基胺基吡啶(77mg、0.633mmol)以及乙基磺醯氯(ethanesulfonyl chloride)(120μL、1.266mmol)。於冰冷下攪拌5分鐘之後升溫至室溫於室溫下攪拌1小時。將ISOLUTE(註冊商標)HM-N(Biotage社製)加入至混合物並進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷以及DCM)純化所得的殘渣複數次，將化合物SS26作為非鏡像異構物混合物獲得35.21mg(產率28%)。 MS (ESI) m/z=203.2[M+H] ⁺(分析條件LTQ method_1) ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 7.38-7.25 (5H, m), 4.62 (1H, q, J= 6.4 Hz), 3.31-3.22 (1H, m), 1.45 (3H, d, J= 6.4 Hz), 1.42-1.25 (2H, m), 1.06 (3H, d and d, J= 6.4 Hz), 0.81 (3H, t and t, J= 7.6 Hz)

實施例1-4-3：1-(1-甲基庚基)-3-二級丁基-硫脲(化合物SS27a)的合成 [化22] 於室溫下，將2-異硫氰酸丁烷(300μL、2.45mmol)及2-辛胺(452μL、2.69mmol)添加至DCM(12.2mL)，於室溫下攪拌17小時。將混合物進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷)純化所得的殘渣2次，將化合物SS27a作為非鏡像異構物混合物獲得552.0mg(產率92%)。 LCMS (ESI) m/z=245.2[M+H] ⁺滯留時間：0.94分(分析條件SQDFA05_1)

實施例1-4-4：N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺(SS27)的合成 [化23] 將化合物SS27a(150mg、0.614mmol)添加至DCM(6.136mL)，於冰冷下添加DIPEA(315μL、1.841mmol)、4-二甲基胺基吡啶(75mg、0.614mmol)以及乙基磺醯氯(116μL、1.227mmol)。於冰冷下攪拌5分鐘之後升溫至室溫並於室溫下攪拌1小時。將ISOLUTE(註冊商標)HM-N(Biotage社製)加入至混合物並進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷以及DCM)純化所得的殘渣數次，將化合物SS27作為非鏡像異構物混合物獲得22.83mg(產率18%)。 MS (ESI) m/z=211.2[M+H] ⁺(分析條件LTQ method_1) ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 3.38-3.24 (2H, m), 1.48-1.25 (12H, m), 1.14 (6H, d, J= 6.4 Hz), 0.88 (3H, t, J= 7.6 Hz), 0.86 (3H, t, J= 7.6 Hz)

實施例1-4-5：1,3-雙(1-甲基丁基)硫脲(化合物SS28a)的合成 [化24] 於室溫下，將2-異硫氰酸戊烷(300μL、2.16mmol)及2-戊胺(280μL、2.38mmol)添加至DCM(10.8mL)，於室溫下攪拌20小時。將混合物進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷)純化所得的殘渣，將化合物SS28a作為非鏡像異構物混合物獲得426.8mg(產率91%)。 LCMS (ESI) m/z=217.2[M+H] ⁺滯留時間：0.82分(分析條件SQDFA05_1)

實施例1-4-6：N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS28)的合成 [化25] 將化合物SS28a(199.8mg、0.923mmol)添加至DCM(9.233mL)，於冰冷下添加三乙胺(386μL、2.77mmol)、4-二甲基胺基吡啶(113mg、0.923mmol)以及乙基磺醯氯(175μL、1.847mmol)。於冰冷下攪拌5分鐘之後升溫至室溫攪拌1小時。將ISOLUTE(註冊商標)HM-N(Biotage社製)加入至混合物並進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷以及DCM)純化所得的殘渣數次，將化合物SS28作為非鏡像異構物混合物獲得36.30mg(產率22%)。 MS (ESI) m/z=183.2[M+H] ⁺(分析條件LTQ method_1) ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 3.39-3.33 (2H, m), 1.42-1.23 (8H, m), 1.14 (6H, d, J= 6.4 Hz), 0.91-0.83 (6H, m)

實施例1-4-7：1,3-雙(1-乙基丙基)硫脲(化合物SS29a)的合成 [化26] 於室溫下，將3-異硫氰酸戊烷(300μL、2.18mmol)以及3-戊胺(279μL、2.40mmol)添加至DCM(10.9mL)，於室溫攪拌20小時。將混合物進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷)純化所得的殘渣，獲得401.4mg的化合物SS29a(產率85%)。 LCMS (ESI) m/z=217.2[M+H] ⁺滯留時間：0.79分(分析條件SQDFA05_1)

實施例1-4-8：N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺(SS29)的合成 [化27] 將化合物SS29a(200.8mg、0.928mmol)添加至DCM(9.280mL)，於冰冷下添加三乙胺(388μL、2.78mmol)、4-二甲基胺基吡啶(113mg、0.928mmol)以及乙基磺醯氯(175μL、1.856mmol)。於冰冷下攪拌5分鐘之後升溫至室溫並於室溫下攪拌0.5小時。將ISOLUTE(註冊商標)HM-N(Biotage社製)加入至混合物並進行減壓濃縮，以順相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷及DCM)純化所得的殘渣數次，獲得37.59mg的化合物SS29(產率22%)。 MS (ESI) m/z=183.2[M+H] ⁺(分析條件LTQ method_1) ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 3.08 (2H, tt, J= 4.8 Hz, 8.0 Hz), 1.56-1.30 (8H, m), 0.89 (12H, t, J= 7.2 Hz)

實施例1-4-9：1-(1-乙基丙基)-3-(1-甲基丁基)硫脲(化合物SS30a)的合成 [化28] 於室溫下，將2-異硫氰酸戊烷(300μL、2.16mmol)以及3-戊胺(276μL、2.37mmol)添加至DCM(10.8mL)，於室溫下攪拌20小時。將混合物進行減壓濃縮，以正相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷)純化所得的殘渣，將化合物SS30a作為非鏡像異構物混合物獲得418.3mg(產率90%)。 LCMS (ESI) m/z=217.2[M+H] ⁺滯留時間：0.80分(分析條件SQDFA05_1)

實施例1-4-10：N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺(SS30)的合成 [化29] 將化合物SS30a(201.1mg、0.929mmol)添加至DCM(9.294mL)，於冰冷下添加三乙胺(389μL、2.79mmol)、4-二甲基胺基吡啶(114mg、0.929mmol)及乙基磺醯氯(176μL、1.859mmol)。於冰冷下攪拌5分鐘之後升溫至室溫並於室溫下攪拌0.5小時。將ISOLUTE(註冊商標)HM-N(Biotage社製)加入至混合物並進行減壓濃縮，以正相矽膠柱層析法(乙酸乙酯/n-己烷及DCM)純化所得的殘渣數次，將化合物SS30作為非鏡像異構物混合物獲得46.88mg(產率28%)。 MS (ESI) m/z=183.2[M+H] ⁺(分析條件LTQ method_1) ¹H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO- d ₆) δ 3.40-3.33 (1H, m), 3.11-3.05 (1H, m), 1.55-1.27 (8H, m), 1.14 (3H, d and d, J= 6.4 Hz), 0.91-0.85 (9H, m)

實施例2：膜上的胜肽合成中，探討針對延長步驟的試劑種類及反應條件之實驗 胜肽的固相合成中，經由脫Fmoc、膜清洗，接著進行胺基酸的延長。在本實驗中，使用擔載於膜的胜肽序列(化合物SS02)，並變更胺基酸的延長步驟的試劑或當量比等反應條件，藉由比較目標的延長反應的反應效率的程度以確定膜上的胜肽合成中較佳的試劑以及反應條件的範圍。 在評估胺基酸的延長效率時，實施甘胺酸封端(Glycine capping)以確認起始原料殘留率。亦即，實施目標的胺基酸的延長反應之後，接著實施Fmoc-Gly-OH的延長反應以與未反應的胺進行反應。之後以實施例1-2所載的方法自膜切出，比較目標的胺基酸延長的胜肽與Fmoc-Gly-OH延長的胜肽的UV面積值，以計算出目標的胺基酸的延長效率。

參照例2-1：以Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174記載的反應條件於膜上的胜肽合成實驗 參照例2-1-1：擔載於膜上的MePhe上的Fmoc基之去除 [化30] 將實施例1-2-1已製備完成的胜肽經擔載的膜盤(化合物SS02)1片裝入反應容器，添加DBU的DMF溶液(2%v/v)4.0μL，於室溫下反應5分鐘之後，再次添加4.0μL並於室溫下反應10分鐘以進行Fmoc基的脫保護。排出溶液之後，將膜以DMF(每1片膜盤100μL)清洗4次，以乙醇(每1片膜盤100μL)清洗3次，進行空氣乾燥而獲得化合物SS08。

參照例2-1-2：對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應 [化31] 參考使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis社製)對膜上的天然胜肽合成的報告(Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174，進行對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應。 將Fmoc-Nle-OH(0.45mol/L)及HOBt(0.675mol/L)溶解於NMP的溶液與將DIC(1.485mol/L)溶解於NMP的溶液以3：1的比率混合，靜置15分鐘之後，對裝入反應容器的參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置預定時間。接著，將膜以DMF(每1片膜盤100μL)清洗3次，以乙醇(每1片膜盤100μL)清洗3次，空氣乾燥。接著，將Fmoc-Gly-OH(0.6mol/L)與HOAt(0.375mol/L)溶解於NMP的溶液以及將DIC(0.71mol/L)溶解於DMF的溶液以5：6的比率混合，靜置10~15分鐘之後對反應容器內的膜添加該溶液3.0μL。加蓋並於室溫下靜置25~60分鐘之後，自膜排出溶液，再次進行上述的Fmoc-Gly-OH的延長反應。排出溶液之後，將膜以DMF(每1片膜盤100μL)清洗3~4次，以乙醇(每1片膜盤100μL)清洗3次，進行空氣乾燥。

參照例2-1-3：擔載於膜上的Fmoc-Nle-MePhe的切出及分析 對參照例2-1-2所得的膜以實施例1-2所載的方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*)及替代Fmoc-Nle-OH的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。 [化32] LCMS (ESI) m/z=514.5[M+H] ⁺滯留時間：3.64分(分析條件SQDAA05long) [化33] LCMS (ESI) m/z=458.3[M+H] ⁺滯留時間：3.20分(分析條件SQDAA05long)

使用LC數據的各化合物波峰的UV面積值(波長299nm)，自以下公式計算出延長效率。 延長效率(%)=(SS09*的UV面積值)/(SS09*的UV面積值與SS10*的UV面積值的合計值)x100

參照例2-1的條件及結果示於以下表6。 [表6] 參考Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174的反應條件的延長效率，即使在60分鐘後亦為4%的極低結果。

參照例2-2：以WO2018/225851記載的反應條件的膜上的胜肽合成實驗 參照例2-2-1：對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，參考包含N-取代胺基酸的胜肽的合成方法(WO2018/225851)設定反應條件，進行對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH延長反應。 將Fmoc-Nle-OH(0.6mol/L)與HOAt(0.375mol/L)溶解於NMP或DMF的溶液以及將DIC(0.71mol/L)溶解於DMF的溶液以5：6的比率混合，靜置15分鐘之後對裝入反應容器的參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫靜置預定時間。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

參照例2-2-2：擔載於膜上的Fmoc-Nle-MePhe的切出及分析 對參照例2-1-2所得的膜以實施例1-2所載的方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*)及替代Fmoc-Nle-OH的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。延長效率根據參照例2-1記載的計算式計算。 參照例2-2的條件及結果示於以下表7。 [表7]

WO2018/225851記載的反應條件的延長效率，即使在60分鐘後亦為52%(使用NMP/DMF=5/6的混合溶媒)及64%(使用DMF溶媒)的較低結果。再者，在反應時間30分鐘與60分的延長效率變化很小。

參照例2-3：試劑高濃度條件下的膜上的胜肽合成實驗 參照例2-3-1：對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，為了提升延長效率而將試劑濃度提升並進行對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH延長反應。 將Fmoc-Nle-OH(0.62mol/L)與HOAt(0.193mol/L或0.387mol/L)溶解於NMP/DMF=5/6或6.68/4.34的溶液、或者溶解於DMF的溶液與DIC(原液)以10：1.353的比率混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫靜置60分鐘。此時，將靜置15分鐘的溶液一部分以MeCN稀釋，使用LCMS分析該溶液(分析條件SQDFA05_1)。又，將1mL的MeCN添加至經過反應時間的膜，使浸入至膜的反應溶液溶解，使用LCMS分析該MeCN溶液(分析條件SQDFA05_1)。 [化34] LCMS (ESI) m/z=354.3[M+H] ⁺滯留時間：0.89分(分析條件SQDFA05_1) [化35] LCMS (ESI) m/z=472.3[M+H] ⁺滯留時間：1.02分(分析條件SQDFA05_1)

自以下公式計算出各自的分析結果的活性酯(化合物SS11)的UV面積值比例(波長299nm)。 活性酯的UV面積值比例(%)=(活性酯的UV面積值)/(Fmoc-Nle-OH的UV面積值+活性酯的UV面積值+波峰1的UV面積值+波峰2的UV面積值)x100 再者，波峰1以滯留時間1.07分波峰，推定為自Fmoc-Nle-OH與DIC生成的生成物，波峰2以滯留時間1.22分的波峰，推定為Fmoc-Nle-OH的二聚體。 之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

參照例2-3-2：擔載於膜上的Fmoc-Nle-MePhe的切出及分析 對參照例2-3-1所得的膜以實施例1-2所載的方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*)及替代Fmoc-Nle-OH的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。延長效率根據參照例2-1記載的計算式計算。 作為縮合劑使用DIC的試劑高濃度條件的延長效率，如後述的表9所示，其具有83%~96%的較高結果。然而，在任一條件中皆有析出物產生，而為難以應用在自動合成的條件。

實施例2-4：將DIC改變成DsBC的反應條件之膜上的胜肽合成實驗 實施例2-4-1：對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，以將DIC變更成DsBC的反應條件進行對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH延長反應。 將Fmoc-Nle-OH(0.63mol/L)與HOAt(0.198mol/L或0.397mol/L)溶解於NMP/DMF=5/6或6.68/4.34的溶液、或者溶解於DMF的溶液與DsBC(原液)以10：1.642的比率混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置預定時間。此時，將靜置15分鐘的溶液一部分以MeCN稀釋，使用LCMS分析該溶液(分析條件SQDFA05_1)。又，將1mL的MeCN添加至經過反應時間的膜，使浸入至膜的反應溶液溶解，使用LCMS分析該MeCN溶液(分析條件SQDFA05_1)。自以下公式計算出各自的分析結果的活性酯(化合物SS11)的UV面積值比例(波長299nm)。 活性酯的UV面積值比例(%)=(活性酯的UV面積值)/(Fmoc-Nle-OH的UV面積值+活性酯的UV面積值+波峰2的UV面積值+波峰3的UV面積值)x100 再者，波峰3以滯留時間1.15分的波峰，推定為Fmoc-Nle-OH與DsBC生成的生成物，波峰2以滯留時間1.22分的波峰，推定為Fmoc-Nle-OH的二聚體。 之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

實施例2-4-2：擔載於膜上的Fmoc-Nle-MePhe的切出及分析 對實施例2-4-1所得的膜以實施例1-2所載的方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*)及替代Fmoc-Nle-OH的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。延長效率根據參照例2-1記載的計算式計算。 參照例2-3及實施例2-4的條件及結果示於以下表8及表9。 [表8] [表9] 作為縮合劑使用DsBC的試劑高濃度條件下探討縮合的結果，如表9所示，延長效率顯示90%~98%的較高結果。由於在本條件下皆沒有析出物的產生，可應用於自動合成。

實施例2-5：使用其他Fmoc保護的胺基酸以及各種的活化劑的膜上胜肽合成中DsBC使用與DIC使用的效果比較實驗 實施例2-5-1：在DsBC使用條件下對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-MeSer(THP)-OH延長反應 [化36] 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，參考實施例2-4-1的反應條件進行對膜上的MePhe的Fmoc-MeSer(THP)-OH延長反應。將Fmoc-MeSer(THP)-OH (0.63mol/L)及HOAt或HOOBt (0.198mol/L)溶解於DMF的溶液與DsBC(原液)以10：1.642的比率混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

參照例2-5-2：在DIC使用條件下對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-MeSer(THP)-OH延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)、參考參照例2-3-1的反應條件，進行對膜上的MePhe的Fmoc-MeSer(THP)-OH延長反應。將Fmoc-MeSer(THP)-OH (0.62mol/L)及HOAt或HOOBt (0.193mol/L)溶解於DMF的溶液與DIC(原液)以10：1.353的比率混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

實施例2-5-3：在DsBC使用條件下對擔載於膜上的MeAla的Fmoc-MeASp(OPiS)-OH延長反應 [化37] 使用實施例1-2-1已製備完成的胜肽經擔載的膜盤(化合物SS24)，根據參照例2-1-1所載的方法去除Fmoc基，獲得化合物SS31。 [化38] 使用所得的膜(化合物SS31)，參考實施例2-4-1的反應條件，進行對膜上的MeAla的Fmoc-MeASp(OPiS)-OH延長反應。將Fmoc-MeASp(OPiS)-OH及Oxyma(0.198mol/L)溶解於DMF的溶液與DsBC(原液)以10：1.642的比率混合，靜置15分鐘之後，對膜(化合物SS31)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

參照例2-5-4：在DIC使用條件下對擔載於膜上的MeAla的Fmoc-MeASp(OPiS)-OH延長反應 使用實施例2-5-3所得的膜(化合物SS31)，參考參照例2-3-1的反應條件，進行對膜上的MeAla的Fmoc-MeASp(OPiS)-OH延長反應。將Fmoc-MeASp(OPiS)-OH (0.62mol/L)及Oxyma (0.193mol/L)溶解於DMF的溶液與DIC(原液)以10：1.353的比率混合，靜置15分鐘之後對膜(化合物SS31)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

實施例2-5-5：在DsBC使用條件下對擔載於膜上的MeSer(THP)的Fmoc-MePhe-OH延長反應 [化39] 使用實施例1-2-1已製備完成的胜肽經擔載的膜盤(化合物SS24)，根據參照例2-1-1所載的方法去除Fmoc基，獲得化合物SS33。 [化40] 使用所得的膜(化合物SS33)，參考實施例2-4-1的反應條件，進行對膜上的MeSer(THP)的Fmoc-MePhe-OH延長反應。將Fmoc-MePhe-OH(0.63mol/L)及HOAt(0.198mol/L)溶解於DMF的溶液與DsBC(原液)以10：1.642的比率混合，靜置15分鐘之後對膜(化合物SS33)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

參照例2-5-6：在DIC使用條件下對擔載於膜上的MeSer(THP)的Fmoc-MePhe-OH延長反應 使用實施例2-5-5所得的膜(化合物SS33)，參考參照例2-3-1的反應條件，進行對膜上的MeSer(THP)的Fmoc-MePhe-OH延長反應。將Fmoc-MePhe-OH (0.62mol/L)及HOAt (0.193mol/L)溶解於DMF的溶液與DIC(原液)以10：1.353的比率混合，靜置15分鐘之後，對膜(化合物SS33)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

實施例2-5-7：擔載於膜上的各種胜肽的切出及分析 對實施例(參照例)2-5-1~2-5-6所得的膜以實施例1-2所載之方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS12*、SS32*及SS34*)以及替代期望的Fmoc保護的胺基酸的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*、SS35*以及SS36*)(該等亦稱為甘胺酸封端體)的生成。 [化41] LCMS (ESI) m/z=586.5[M+H] ⁺滯留時間：3.61分(分析條件SQDAA05long) [化42] LCMS (ESI) m/z=572.5[M+H] ⁺滯留時間：3.52分(分析條件SQDAA05long) [化43] LCMS (ESI) m/z=586.4[M+H] ⁺滯留時間：3.56分(分析條件SQDAA05long) [化44] LCMS (ESI) m/z=382.3[M+H] ⁺滯留時間：2.58分(分析條件SQDAA05long) [化45] LCMS (ESI) m/z=482.4[M+H] ⁺滯留時間：3.03分(分析條件SQDAA05long)

使用LC數據的各化合物波峰的UV面積值(波長299nm)根據參照例2-1記載的計算式自以下公式計算出延長效率。 延長效率(%)=(目標胜肽的UV面積值)/(目標胜肽的UV面積值與甘胺酸封端體的UV面積值的的合計值)x100 實施例(參照例)2-5-1~2-5-6的條件及結果示於以下表10。 [表10] 作為縮合劑使用DIC的條件中，皆產生析出物而為難以應用於自動合成的條件。另一方面，作為縮合劑使用DsBC的本條件中，即使使用各種Fmoc保護的胺基酸及活化劑對各種胜肽的縮合皆沒有析出物的產生，為可應用於自動合成的條件，且在延長效率上亦有與使用DIC的條件同等或其以上的高延長效率。

實施例2-6：脲的溶解度驗證實驗 實施例2-6-1：DIC脲、DsBC脲以及tBEC脲對DMF的溶解度確認實驗 以參照例2-3、實施例2-4及2-5的延長步驟實施的預活化(預活化)時的碳二亞胺濃度為0.77mol/L。為了確認所有碳二亞胺轉換為脲時發生其析出的風險，使用源自於參照例2-3確認有析出物的DIC以及於實施例2-4及2-5確認沒有析出物的DsBC的脲，根據以下的步驟確認該等對NMP及DMF的溶解度。 將實施例1-3合成的DIC脲(化合物SS05)及DsBC脲(化合物SS06)以表11所載之重量秤取至1.5mL螺旋蓋小瓶，以成為各濃度的方式添加NMP或者DMF。於室溫下攪拌5分鐘以上，之後靜置並確認脲的有無溶解。結果，確認到相對於DIC脲的化合物SS05在NMP中0.34M以上的濃度、在DMF中0.17M以上的濃度下固體沒有完全溶解，DsBC脲的化合物SS06不論在NMP、DMF任一者中於0.77M下皆完全溶解且即使經過24小時以上沒有再析出。

[表11]

實施例2-6-2：tBEC脲對DMF的溶解度確認實驗 使用與DIC及DsBC的烷基不同的tBEC進行與實施例2-6-1同樣的實驗。將實施例1-3合成的tBEC脲(化合物SS07)秤取10.18mg及10.19mg至1.5mL螺旋蓋小瓶，以成為0.77mol/L的方式各自添加NMP或者DMF。於室溫下攪拌5分鐘以上，之後靜置並確認脲的有無溶解。結果，與DsBC脲同樣，確認到tBEC脲完全溶解且即使經過24小時以上沒有再析出。

實施例2-7：在使用其他碳二亞胺的高濃度條件下膜上的胜肽合成實驗 實施例2-7-1：使用tBEC對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，參考實施例2-4-1的反應條件使用於實施例2-6確認到該脲對DMF有良好溶解度的tBEC進行對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH延長反應。 將Fmoc-Nle-OH(0.62mol/L)及HOAt(0.194mol/L)溶解於DMF的溶液與tBEC(原液)以10：1.355的比率混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

實施例2-7-2：擔載於膜上的Fmoc-Nle-MePhe的切出及分析 對實施例2-7-1所得的膜以實施例1-2所載之方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*)及替代Fmoc-Nle-OH的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。根據參照例2-1所載的計算式計算出延長效率。 實施例2-7的結果示於以下表12。

[表12] 即使在作為縮合劑使用tBEC替代DsBC的縮合反應中，如表12所示，沒有析出物的產生而可進行Fmoc保護的胺基酸的延長。

實施例2-7-3：使用各種縮合劑對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，參考實施例2-4-1的反應條件使用於實施例1-4合成的各種碳二亞胺進行對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應。 根據以下表13將Fmoc-Nle-OH及HOAt溶解於DMF的溶液與碳二亞胺(原液)混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

[表13]

實施例2-7-4：擔載於膜上的Fmoc-Nle-MePhe的切出及分析 對實施例2-7-3所得的膜以實施例1-2所載之方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*)及替代Fmoc-Nle-OH的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。根據參照例2-1所載的計算式計算出延長效率。 結果示於以下表14。

[表14] 即使使用任一碳二亞胺作為縮合劑的情況下，如表14所示，延長效率顯示為97%~99%的較高結果。又，使用化合物SS26、SS27、SS28及SS30的縮合反應中，沒有析出物的產生而可進行Fmoc保護的胺基酸的延長，為可應用於自動合成的條件。

實施例2-8：以各種的反應溫度、反應溶媒及試劑當量的膜上的胜肽合成實驗 實施例2-8-1：以各種的反應溫度、反應溶媒及試劑當量比的對擔載於膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，基於實施例2-4-1的反應條件變更反應溫度、反應溶媒及試劑當量以進行對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長反應。 根據以下表15，將Fmoc-Nle-OH及HOAt溶解於各種反應溶媒的溶液與DsBC(原液)混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於各種溫度下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

[表15]

實施例2-8-2：擔載於膜上的Fmoc-Nle-MePhe的切出及分析 對實施例2-8-1所得的膜以實施例1-2所載之方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*)及替代Fmoc-Nle-OH的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。根據參照例2-1所載的計算式計算出延長效率。 結果示於以下表16。

[表16] 如表16所示，即使在反應溫度為40℃或60℃的情況下，亦沒有析出物的產生，顯示高的延長效率。再者，即使使用包含脲系溶媒、苯系溶媒、鹵素系溶媒及醚系溶媒的反應溶媒的情況下，亦沒有析出物的產生，顯示高的延長效率。並且，即使在變更添加劑(在此表示為HOAt的情況)及縮合劑比率的情況下，亦沒有析出物的產生，可進行Fmoc保護的胺基酸的延長。

由一般天然胺基酸形成的胜肽陣列合成中廣泛實施的延長步驟之參照例2-1所載的延長步驟中，以及參考作為包含N-取代胺基酸的胜肽的合成方法報導的反應條件的參照例2-2的延長步驟中，對膜上的MePhe的Fmoc-Nle-OH的延長效率僅為3~4%及50~64%た。為了提升延長效率而進行提升試劑濃度的延長反應的參照例2-3所載之方法中，可確認到延長效率提升至83%~96%，但活性酯的濃度在延長反應起始後30分鐘後的時點已顯著地降低，且於15分鐘的預活化間生成的DIC脲的析出成為另一課題。OxymaPure與DCC,DIC等碳二亞胺的組合中，具有以避免氫氰酸的產生為目的而探討碳二亞胺的種類的論文，與使用DIC的情況相比，DsBC的使用會有使醯胺化的反應性變差的記載(Org. Lett. 2021, 23, 6900-6904.)。然而，參照例2-3所載的高濃度條件中，將使用的碳二亞胺變更為DsBC的實施例2-4所載的方法中，與參照例2-3的結果相比，確認到延長效率的改善。此時，確認到相較使用DIC的情況，活性酯能夠更長時間維持高濃度狀態。再者，使用DsBC的情況下，並未發現在15分鐘的預活化期間生成的DsBC脲析出。又，如實施例2-5所示，本反應條件即使在胺基酸或活化劑不同的情況下亦能夠應用，並未發現脲析出且確認到期望的胜肽生成。實際上，如實施例2-6所示，可確認到即使所有DsBC轉換成脲，析出的風險亦極低。又，在與DsBC的烷基不同的tBEC中，同樣亦可確認到脲析出的風險極低。再者，即使在使用化合物SS26、SS27、SS28及SS30的縮合反應中，如實施例2-7所示，預活化溶液中並未觀測到析出物因而可進行Fmoc保護的胺基酸的延長。另外，如實施例2-8所述，作為使用沒有脲析出且可生成期望的胜肽的DsBC之反應條件，確認到可在關於40℃、60℃等升溫條件或各種的反應溶媒、試劑當量比的部分進行變更。 如上述，根據實施例2的結果，在膜上的胜肽合成的延長步驟中，確定了反應條件的一部分，其包括改善延長效率且可抑制源自碳二亞胺的脲析出的碳二亞胺種類。

實施例3：對於基質的應用範圍擴大、藉由胜肽合成機的自動合成的應用實驗 在本實驗中，使用實施例2確定的膜上胜肽合成中較佳的反應條件，實施其他胺基酸的延長反應。胺基酸的延長效率評估以與實施例2同樣的方法進行。又，實施本條件對胜肽合成機的應用。

實施例3-1：使用各種的胺基酸及活化劑的膜上的胜肽合成實驗 實施例3-1-1：擔載於膜上的Pro上的Fmoc基的去除 [化46] 使用實施例1-2-1已製備完成的胜肽經擔載的膜盤(化合物SS03)，根據參照例2-1-1所載的方法去除Fmoc基，獲得化合物SS13。

實施例3-1-2：對擔載於膜上的Pro的Fmoc保護的胺基酸的延長反應 [化47] 使用實施例3-1-1所得的膜(化合物SS13)，以將DIC變更成tBEC的反應條件進行對膜上的Pro的Fmoc-ASp(OPiS)-OH延長反應。 將Fmoc-ASp(OPiS)-OH(0.62mol/L)及活化劑(0.194mol/L或0.387mol/L)溶解於DMF的溶液與tBEC(原液)以10：1.355的比率混合，靜置15分鐘之後對膜添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

實施例3-1-3：擔載於膜上的各種胜肽的切出及分析 對實施例3-1-2所得的膜以實施例1-2所載的方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS14*)及替代期望的Fmoc保護的胺基酸的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS15*)的生成。 [化48] LCMS (ESI) m/z=584.5[M+H] ⁺滯留時間：3.55分(分析條件SQDAA05long) [化49] LCMS (ESI) m/z=394.3[M+H] ⁺滯留時間：2.61~2.62分(分析條件SQDAA05long) 根據實施例2-5記載的計算式計算出延長效率。 結果示於以下表17。

[表17] 即使在使用任一序列及任一活化劑的情況下，皆未觀測到預活化溶液中的析出物，可進行目標胜肽的合成。

參照例3-1-4：在DIC使用條件下對擔載於膜上的MePhe的Fmoc保護的胺基酸的延長反應 [化50] 針對各種N-烷基胺基酸的延長反應，應確認本條件的有效性，而使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，參考參照例2-3-1的反應條件進行對膜上的MePhe的Fmoc-ASp(OPiS)-OH的延長反應。 根據後述的表18，將Fmoc-ASp(OPiS)-OH及Oxyma溶解於DMF的溶液與DIC(原液)混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

實施例3-1-5：對擔載於膜上的MePhe的Fmoc保護的胺基酸的延長反應 使用參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)，參考實施例2-7-3的反應條件使用實施例1-4合成的各種碳二亞胺進行對膜上的MePhe的Fmoc-ASp(OPiS)-OH延長反應。 根據後述的表18，將Fmoc-ASp(OPiS)-OH及Oxyma溶解於DMF的溶液與各種碳二亞胺(原液)混合，靜置15分鐘之後對參照例2-1-1所得的膜(化合物SS08)添加該溶液1.2μL，於室溫下靜置30分鐘。之後，以與參照例2-1同樣的方法進行。

[表18]

實施例3-1-6：擔載於膜上的各種胜肽的切出及分析 對參照例3-1-4及實施例3-1-5所得的膜以實施例1-2所載的方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS37*)及替代期望的Fmoc保護的胺基酸的Fmoc-Gly-OH延長的胜肽(化合物SS10*)的生成。 [化51] LCMS (ESI) m/z=648.5[M+H] ⁺滯留時間：3.80分(分析條件SQDAA05long) 根據實施例2-5記載的計算式計算出延長效率。 結果示於以下表19。

[表19] 在作為縮合劑使用DIC的條件中，延長效率僅為49%，並且產生析出物而為難以應用於自動合成的條件。另一方面，作為縮合劑使用DsBC或各種碳二亞胺的情況下，如表19所式，顯示延長效率為55%~71%，其為較使用DIC時更高的結果。又，使用DsBC或化合物SS26、SS27、SS28及SS30的縮合反應中並未產生析出物而可進行Fmoc保護的胺基酸的延長，為可應用於自動合成的條件。

實施例3-2：藉由胜肽合成機之膜上的胜肽合成實驗 [化52]

將實施例2確定的膜上胜肽合成中較佳的反應條件應用於自動合成機的合成。使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis社製)，藉由Fmoc法進行。關於操作的詳細步驟是遵循合成機所附的手冊，以以下的方法實施。再者，即使Fmoc保護的胺基酸的種類不同為了獲得穩定且高的延長效率，自動合成機實施雙偶合(double coupling)。例如，若以單偶合的延長效率為90%的程度，藉由實施雙偶合可期待延長效率達到99%的程度。 製備將延長的Fmoc保護的胺基酸(0.63mol/L)及HOAt或Oxyma或HOOBt (0.198mol/L或0.397mol/L)溶解於DMF的溶液1。將DsBC的原液直接作為溶液2使用。 為了在Fmoc保護的胺基酸延長後進行甘胺酸封端，製備將Fmoc-Gly-OH(0.6mol/L)及HOAt(0.375mol/L)溶解於NMP的溶液3。將DIC(0.71mol/L)與DMF混合以製備溶液4。 將實施例1-2-1所得的膜(化合物SS02)安裝至CelluSpots 384 frame with acid stable discs(Intavis社製)，並設置於胜肽合成機。溶液1~4設置於胜肽合成機，以起始藉由胜肽合成機的自動合成。

脫Fmoc步驟 每1片膜盤添加2.0μL及4.0μL的DBU的DMF溶液(2%v/v)，於室溫下進行Fmoc基的脫保護。添加2.0μL後反應5分鐘之後，將溶液排出一次，並添加4.0μL進一步反應10分鐘，之後將溶液排除。接著，以DMF(每1片膜盤25μL)清洗7次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗2次，以吸引壓乾燥15分鐘。

延長步驟(雙偶合) 將溶液1與溶液2以10：1.642的比率於合成機的mixing vial進行混合，靜置15分鐘之後，每1片膜盤添加1.2μL，於室溫下反應40分鐘以進行膜盤上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，排出溶液。接著，以DMF(每1片膜盤25μL)清洗4次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗3次，以吸引壓乾燥15分鐘。之後再重複進行1次縮合反應、清洗及乾燥。

甘胺酸封端(Glycine capping)步驟 接著，將溶液3與溶液4以5：6的比率於合成機的mixing vial進行混合，靜置15分鐘之後，每1片膜盤添加3.0μL，於室溫下反應40分鐘以進行甘胺酸封端之後，排出溶液。之後再次進行上述的Fmoc-Gly-OH延長反應。接著，以DMF(每1片膜盤25μL)清洗7次，以吸引壓乾燥10分鐘。胺基酸的延長後不進行脫Fmoc步驟，進一步以DMF(每1片膜盤25μL)清洗7次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗2次，以乙醇(每1片膜盤25μL)清洗3次，以吸引壓乾燥10分鐘。 使用所製備的化合物SS09、化合物SS12、化合物SS16及化合物SS17以實施例1-2所載的方法進行胜肽的切出，確認目標胜肽(化合物SS09*、化合物SS12*、化合物SS16*及化合物SS17*)的生成。

[化53] LCMS (ESI) m/z=514.4[M+H] ⁺滯留時間：3.63分(分析條件SQDAA05long) [化54] LCMS (ESI) m/z=586.4[M+H] ⁺滯留時間：3.61分(分析條件SQDAA05long) [化55] LCMS (ESI) m/z=598.3[M+H] ⁺滯留時間：3.72分(分析條件SQDAA05long) [化56] LCMS (ESI) m/z=514.4[M+H] ⁺滯留時間：3.49分(分析條件SQDAA05long)

實施例3-2的結果示於以下表20。 [表20] 在任一基質中皆未觀察到源自DsBC的脲析出，因此可進行藉由胜肽合成機的自動合成。

實施例3-3：利用胜肽合成機的膜上的環狀胜肽合成實驗 將實施例2確定的膜上胜肽合成中較佳的反應條件應用於自動合成機的合成，進行環狀胜肽的平行合成。

實施例3-3-1：藉由胜肽合成機的膜上的胜肽延長 參考實施例1-2及3-2的反應條件實施藉由自動合成機的胜肽延長以延長以下表21所載之序列。

[表21]

使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis社製)，藉由Fmoc法進行。關於操作的詳細步驟是遵循合成機所附的手冊，以以下的方法實施。再者，即使Fmoc保護的胺基酸的種類不同為了獲得穩定且高的延長效率，自動合成機實施雙偶合。 為了第1個殘基的延長而調整膜上的反應點個數，製備將Fmoc-Photo-Linker (0.072mol/L)、4-苯氧丁酸(0.22mol/L)及HOBt (0.181mol/L)溶解於DMF的溶液1。將DIC的原液直接作為溶液2使用。作為第2個殘基之後的延長使用的溶液，將延長的Fmoc保護的胺基酸(0.63mol/L)及HOAt或Oxyma或HOOBt (0.198mol/L或0.397mol/L)溶解於DMF或NMP以製備溶液3。其組合記載於以下表22。DsBC的原液直接作為溶液4使用。

[表22] 將CelluSpots 384 frame with acid stable discs(Intavis社製)設置於胜肽合成機。將溶液1~4設置於胜肽合成機，以起始藉由胜肽合成機的自動合成。

脫Fmoc步驟 [第1個殘基] 由於膜上N端不存在Fmoc基因而省略此操作。 [第2個殘基之後] 將DBU的DMF溶液(2%v/v)添加6.0μL至每1片膜盤，於室溫下進行Fmoc基的脫保護。添加6.0μL之後反應15分鐘，之後排出溶液。接著，以DMF(每1片膜盤37.5μL)清洗7次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗6次，以吸引壓乾燥15分鐘。

延長步驟(雙偶合) [第1個殘基] 將溶液1與溶液2以11.29：0.72的比率在合成機的mixing vial進行混合並靜置15分鐘之後，添加1.2μL至每1膜盤，於室溫反應40分鐘以進行膜盤上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，排出溶液。接著，以DMF(每1片膜盤37.5μL)清洗4次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗3次，以吸引壓乾燥15分鐘。之後，更在進行1次縮合反應30分鐘，接著以DMF(每1片膜盤37.5μL)清洗7次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗5次，以吸引壓乾燥15分鐘。 [第2個殘基之後] 將溶液3與溶液4以10.31：0.169的比率在合成機的mixing vial進行混合並靜置10分鐘之後，添加1.2μL至每1膜盤，於室溫反應30分鐘以進行膜盤上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，排出溶液。接著，以DMF(每1片膜盤37.5μL)清洗4次，以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗3次，以吸引壓乾燥15分鐘。之後，更在進行1次縮合反應30分鐘，接著每1片膜盤添加4.0μL的乙酸酐(Ac ₂O)的DMF溶液(4%v/v)，於室溫下進行未反應胺的乙醯基封端。反應5分鐘之後，排出溶液。接著，以DMF(每1片膜盤37.5μL)清洗7次，以吸引壓乾燥10分鐘。 將此Fmoc基的脫保護反應之後的Fmoc保護的胺基酸的縮合反應、乙醯基封端作為1循環，重複此循環以在膜盤表面上延長胜肽。最後胺基酸的延長、乙醯基封端、DMF清洗，乾燥後再以乙醇(每1片膜盤37.5μL)清洗6次，以吸引壓乾燥15分鐘。

實施例3-3-2：膜上的各種胜肽的脫保護、環化、切出及分析 使用實施例3-3-1所得的膜(化合物SS38~SS46)，實施脫保護反應、環化反應、自膜的切出以及分析並確認以下表23所載的目標胜肽(化合物SS47~SS55)的生成。

[表23]

[N端的Fmoc基的去除] 於反應容器中各放入膜盤1片，每1片膜盤添加DBU的DMF溶液(2%v/v) 4.0μL，於室溫下反應5分鐘之後，再次添加4.0μL於室溫下反應10分鐘以進行Fmoc基的去除。接著，每1片膜盤以100μL的DMF清洗4次，以100μL的DCM清洗3次，進行風乾。

[側鏈官能基的保護基的去除] 將21.9mg四甲基硫酸氫銨溶解於混合有HFIP(2.47mL)、TIPS(51.2μL)、DCE(21.3μL)的溶液以製備0.05M的四甲基硫酸氫銨溶液。 於反應容器中各放入膜盤1片，每1片膜盤添加所製備的溶液150μL，於室溫下反應4.5小時以進行Pis基及THP基的去除。接著，每1片膜盤以100μL的NMP清洗2次，之後添加100μL的DIPEA的NMP溶液(60mM)於室溫靜置5分鐘。排出溶液，接著以100μL的NMP清洗1次，以DCM清洗3次，進行風乾。

[環化反應] 將PyOxim(49.8mg)溶解於混合有NMP(184μL)及THF(1.66mL)的溶液，添加DIPEA(19.7μL)以製備50mM PyOxim/60mM DIPEA溶液。 於反應容器中各放入膜盤1片每1片膜盤添加所製備的溶液150μL，升溫至50℃並反應2小時以進行環化反應。接著，每1片膜盤以100μL的DMF清洗4次，以100μL的DCM清洗3次，進行風乾。

[切出、分析] 於反應容器中各放入膜盤1片，參考實施例1-2所載的方法以以下的步驟進行胜肽的切出及分析，確認目標胜肽(化合物SS47~SS55)的生成。 對置於室溫下的反應容器中的膜盤添加10μL的DMSO。接著以UV波長365nm、照度380~600mW/cm ²進行光照射2分30秒。之後對膜添加10μL的DMSO，靜置15分鐘以上使胜肽溶解。將該溶液以LCMS進行分析。

使用LC數據的各化合物波峰的UV面積值(波長210-400nm PDAtotal)，自以下公式計算出目標胜肽的純度。 純度(%)=(目標胜肽的UV面積值)/(去除背景及源自Fmoc-PEG6-OH中所含的雜質的波峰的全波峰的UV面積值的合計值)x100 另外，Fmoc-PEG6-OH中所含的雜質推定為Fmoc基被氧化而不再脫保護的化合物。

實施例3-3的結果示於以下表24。 [表24]

在進行純化步驟前的粗產物階段中，獲得37~69%純度的目標環狀胜肽。將本反應條件應用至藉由自動合成機的胜肽延長，顯示可於膜上進行環狀胜肽的平行合成。

實施例4：可應用的載體範圍的探討實驗 本實驗中，使用基於包含N-取代胺基酸的胜肽的合成方法(WO2018/225851)的反應條件及實施例2確定的膜上胜肽合成中較佳的反應條件，實施樹脂上的胜肽合成實驗。Cl-Trt(2-Cl)樹脂(1.25~1.60mmol/g, 100-200meSh, 1%DVB)購入自渡邊化學工業股份有限公司或SUNRESIN社。

實施例4-1：Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2的合成 實施例4-1-1：(3S)-4-(二甲基胺基)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-4-側氧基丁酸(Fmoc-Asp-NMe2，SS18)的合成 [化57] 根據上述方案合成(3S)-4-(二甲基胺基)-3-(9Ｈ-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-4-側氧基丁酸(Fmoc-Asp-ＮＭｅ2，SS18)。

實施例4-1-2：(3S)-4-(二甲基胺基)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-4-側氧基丁酸-2-甲基丙烷-2-基(Fmoc-Asp(OtBu)-NMe2，化合物SS18a)的合成 [化58] 將購自商業上的供應商的Fmoc-Asp(OtBu)-OH(25.0g,60.8mmol)作為起始原料實施合成。在氮氣氣流下，將Fmoc-Asp(OtBu)-OH(25.0g,60.8mmol)、EDCI･HCl(14.0g,72.9mmol)、及DMF(122mL)加入至反應容器，於室溫下攪拌5分鐘之後，冷卻至0℃。於0℃下加入HOBt(9.03g,66.8mmol)，攪拌45分鐘。於0℃下耗費15分鐘滴入二甲胺(2mol/L THF Solution,31.3mL,62.6mmol)之後，於0℃下攪拌1小時。進一步以水浴攪拌1小時之後，將乙酸乙酯/TBME(1/1,250mL)加入至反應液，將有機層以0.5mol/L鹽酸水溶液(200mL)1次，以水(200mL)2次的順序清洗之後，將有機層以硫酸鈉乾燥。濾去乾燥材料之後，將濾液進行減壓濃縮，將化合物SS18a作為粗產物獲得29.8g(產率112%)。 LCMS(ESI) m/z=461.3[M+Na] ⁺滯留時間：0.88分(分析條件分析條件SQDFA05_2)

實施例4-1-3：(3S)-4-(二甲基胺基)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-4-側氧基丁酸(Fmoc-Asp-NMe2，化合物SS18)的合成 [化59] 將化合物SS18a的粗產物(29.8g)、TFE(270mL)加入至反應容器，接著滴入4mol/L鹽酸二㗁烷溶液(15.2mL,60.8mmol)之後，將反應液於室溫下攪拌1小時。將反應液以TBME(500mL)稀釋之後，以5%碳酸鈉水溶液(600mL)進行萃取。將85%磷酸水溶液(40~50mL)加入至所得的水層，成為pH2~3左右的酸性，將水層以TBME(400mL)進行萃取。所得的有機層以10%氯化鈉水溶液(400mL)、水(400mL)清洗之後，以硫酸鈉乾燥有機層。濾去乾燥材料之後，將濾液進行減壓濃縮，獲得21.4g的化合物SS18(產率92%)。 LCMS(ESI) m/z=383.2[M+H] ⁺滯留時間：0.66分(分析條件分析條件SQDFA05_2)

實施例4-1-4：(3S)-4-(二甲基胺基)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-4-側氧基丁酸-2-氯代三苯甲基樹脂(Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2，化合物SS19)的合成 [化60] 將2-氯代三苯甲基氯樹脂(1.44mmol/g,39.0g,56.2mmol)及DCM(390mL)加入至附有過濾器的反應容器，於室溫下搖動20分鐘。施加氮氣壓去除DCM之後，將化合物SS18(10.7g,28.0mmol)、甲醇(9.05mL,224mmol)、DIPEA (23.5mL,134mmol)、及DCM (273mL)的混合液添加至反應容器，於室溫下搖動60分鐘。施加氮氣壓去除反應液之後，將甲醇(36.2mL,895mmol)、DIPEA (23.5mL,134mmol)、及DCM (273mL)的混合液添加至反應容器，於室溫下搖動90分鐘。施加氮氣壓去除反應液之後，加入DCM (390mL)搖動5分鐘之後施加氮氣壓去除反應液。將使用此DCM的樹脂清洗操作重複3次，所得的樹脂於減壓下乾燥整夜，獲得45.0g的化合物SS19。

Fmoc定量法 為了確認擔載量，將所得的化合物SS19(10.48mg)裝入至反應容器，加入DMF(4.0mL)，於室溫下搖動30分鐘。之後，加入DBU(40μL)並於30℃搖動15分鐘。之後，反應混合液以成為10.0mL的方式加入DMF，將該溶液80μL以DMF (920μL)進行稀釋。所得的稀釋溶液以LC/MS分析(分析條件SQDFA05_1、注入量：5μL)，根據二苯并富烯的UV area值(294nm的UV area值：4929.82，304nm的UV area值：4428.76)，計算出化合物SS19的擔載量為0.469mmol/g。(濃度已知的Fmoc-Gly-OH(購入自商業上的供應商)及DBU的混合溶液作為標準物質，並使用基於在每個測定日的波長294nm及304nm的二苯并富烯的UV area值作成之檢量線，以各自的波長計算出的擔載量平均值作為樹脂的擔載量。) 再者，以同樣合成具有不同擔載量的其他批次亦使用於胜肽合成或探討等。

實施例4-2：樹脂上以不同的反應條件的胜肽合成實驗 實施例4-2-1：化合物SS20(MeVal-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2)的製備 [化61] 化合物SS20的製備是根據包含N-取代胺基酸的胜肽的合成方法(WO2018/225851)，使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis社製)，藉由Fmoc法進行。關於操作的詳細步驟是遵循合成機所附的手冊。 將構成作為目標的胜肽之Fmoc-MeVal-OH(0.6mol/L)及作為羧酸的活化劑的HOAt(0.375mol/L)溶解於NMP以製備溶液1。將DIC(0.71mol/L)及DMF混合以製備溶液2。 將實施例4-1-4所製備的(3S)-4-(二甲基胺基)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-4-側氧基丁酸-2-氯代三苯甲基樹脂(化合物SS19，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2) (每1管柱100mg)加入至固相反應容器，設置於胜肽合成機。將DCM(1.0mL)加入至此樹脂(100mg)並靜置30分鐘程度以進行樹脂的膨潤。將溶液1及溶液2設置於胜肽合成機，以起始藉由胜肽合成機的自動合成。將溶液自玻璃料排出，接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗樹脂2次。

脫Fmoc步驟 添加DBU的DMF溶液(2%v/v，每1管柱0.7mL)，於室溫~30℃下進行Fmoc基的脫保護。反應4.5分鐘之後，將溶液自玻璃料排出。接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗4次。

延長步驟 將溶液1(0.3mL)及溶液2(0.36mL)在合成機的mixing vial進行混合之後，添加至樹脂，將固相反應容器加溫至40℃，反應2.5小時以進行樹脂上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，將溶液自玻璃料排出。接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗樹脂3次。

脫Fmoc步驟 添加DBU的DMF溶液(2%v/v，每1管柱0.7mL)，於室溫~35℃下進行Fmoc基的脫保護。反應10分鐘之後，將溶液自玻璃料排出。接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗4次。 反應結束後亦可以設置於合成機下的狀態直接使用於參照例4-2-2a或實施例4-2-2b所載的實驗。

實施例4-2-2：各種反應條件下對擔載於樹脂上的MeVal之Fmoc-MeVal-OH的延長反應 [化62] 使用根據包含N-取代胺基酸的胜肽的合成方法(WO2018/225851)之反應條件或者於實施例2確定的膜上胜肽合成中較佳的反應條件實施對擔載於樹脂上的MeVal的Fmoc-MeVal-OH的延長反應以合成化合物SS21。

參照例4-2-2a：以WO2018/225851所載的反應條件對擔載於樹脂上的MeVal的Fmoc-MeVal-OH的延長反應 使用實施例4-2-1所製備的MeVal-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2(化合物SS20，每1管柱100mg)，使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis社製)藉由實施例2-4的No.1所載的反應條件，進行Fmoc-MeVal-OH的延長反應。關於操作的詳細步驟是遵循合成機所附的手冊。 將Fmoc-MeVal-OH(0.6mol/L)及HOAt(0.375mol/L)溶解於NMP以製備溶液1。將DIC(0.71mol/L)及DMF混合以製備溶液2。 將溶液1及溶液2設置於胜肽合成機，以起始藉由胜肽合成機的自動合成。 將溶液1(0.3mL)及溶液2(0.36mL)在合成機的mixing vial進行混合之後，添加至樹脂，將固相反應容器加溫至40℃，反應2.5小時以進行樹脂上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，將溶液自玻璃料排出。接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗樹脂3次。

實施例4-2-2b：使用DsBC的試劑高濃度反應條件對擔載於樹脂上的MeVal的Fmoc-MeVal-OH的延長反應 使用實施例4-2-1所製備的MeVal-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2(化合物SS20，每1管柱100mg)，參考實施例2-4的反應條件並使用DsBC以提升試劑濃度，以實施例2-4的No.2~No.5所載的反應條件，進行對樹脂上的MeVal的Fmoc-MeVal-OH的延長反應。 將Fmoc-MeVal-OH(0.63mol/L)及HOAt(0.198mol/L或0.397mol/L)溶解於DMF所製備的溶液1(601μL)與DsBC(原液)(98.7μL)混合之後，將該混合溶液660μL添加至樹脂，將固相反應容器加溫至40℃或50℃，反應2.5小時以進行樹脂上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應。之後，將溶液自玻璃料排出。接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗樹脂3次。

實施例4-2-3：化合物SS22的製備 [化63] 使用參照例4-2-2a或實施例4-2-2b所得的化合物SS21，根據包含N-取代胺基酸的胜肽的合成方法(WO2018/225851)，進行對樹脂上的MeVal的Fmoc-Gly-OH的延長反應。本實施例是使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis社製)，藉由Fmoc法進行。關於操作的詳細步驟是遵循合成機所附的手冊。 將構成作為目標的胜肽之Fmoc-Gly-OH(0.6mol/L)及作為羧酸的活化劑的HOAt(0.375mol/L)溶解於NMP以製備溶液1。將DIC(0.71mol/L)及DMF混合以製備溶液2。 將參照例4-2-2a或實施例4-2-2b所製備的化合物SS21(每1管柱100mg)加入至固相反應容器，並設置於胜肽合成機。將溶液1及溶液2設置於胜肽合成機，以起始藉由胜肽合成機的自動合成。

脫Fmoc步驟 添加DBU的DMF溶液(2%v/v、每1管柱0.7mL)，於室溫~35℃下進行Fmoc基的脫保護。反應10分鐘之後，將溶液自玻璃料排出。接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗4次。

延長步驟 將溶液1(0.3mL)及溶液2(0.36mL)在合成機的mixing vial進行混合後，添加至樹脂，將固相反應容器加溫至40℃，反應2.5小時以進行樹脂上的胺基與Fmoc保護的胺基酸的縮合反應之後，將溶液自玻璃料排出。接著以DMF(每1管柱0.7mL)清洗樹脂3次。再以DCM(每1管柱1.0mL)清洗4次，進行乾燥之後，用於之後的探討。 對所得的樹脂的一部分，以含有DIPEA(0.042mol/L)的TFE/DCM溶液(1/1(v/v))進行胜肽的切出。經切出的溶液以LCMS分析時，確認目標胜肽(化合物SS22*)的生成。另外，除了目標胜肽之外，亦確認到欠缺一個MeVal的化合物SS23*的生成。

[化64] LCMS (ESI) m/z=666.7[M+H] ⁺滯留時間：0.80分(分析條件SQDFA05_3) [化65] LCMS (ESI) m/z=553.5[M+H] ⁺滯留時間：0.72分(分析條件SQDFA05_3) 使用LC數據的各化合物波峰的UV面積值(波長299ｎｍ)，自以下的公式計算出延長效率。 延長效率(%)=(化合物SS22*的UV面積值)/(化合物SS22*的UV面積值與化合物SS23*的UV面積值的合計值)x100

實施例4的結果示於以下表25。 [表25]

即使在樹脂上的Fmoc保護的胺基酸的延長，藉由在本發明反應條件下進行延長，確認到延長效率的改善。

無

無

Claims (15)

1. 一種藉由固相法製造胜肽化合物的方法，該方法包括： 準備擔載於固相，具有胺基的第一胺基酸或具有胺基的第一胜肽之準備步驟；以及 將第一胺基酸或第一胜肽、與具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胺基酸、或者具有經保護的胺基及/或經保護的羥基、以及羧基的第二胜肽，在下述通式(A)表示的至少1種碳二亞胺系縮合劑、以及添加劑的存在下進行縮合之縮合步驟， R ^A-N=C=N-R ^B･･･(A) (式中，R ^A為C ₄~C ₁₀二級或三級烷基，R ^B為C ₂~C ₁₀烷基、C ₆~C ₁₀芳基或C ₇~C ₁₄芳基烷基，R ^A及R ^B中的各基可獨立選自由鹵素、C ₁~C ₆烷氧基、二C ₁~C ₆烷胺基、或4~8員環狀胺基中的1或複數個基所取代)。
2. 如請求項1所述之方法，其中R ^A為C ₄~C ₈二級或三級烷基，R ^B為C ₄~C ₁₀二級或三級烷基、或C ₇~C ₁₄芳基烷基。
3. 如請求項1或2所述之方法，其中碳二亞胺系縮合劑包含選自由N,N’-二-二級丁基碳二亞胺(DsBC)、N’-(1-苯乙基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺、N’-(1-甲基庚基)-N-二級丁基-甲烷二亞胺、N,N’-雙(1-甲基丁基)甲烷二亞胺、N,N’-雙(1-乙基丙基)甲烷二亞胺、以及N’-(1-乙基丙基)-N-(1-甲基丁基)甲烷二亞胺所組成之群組中的至少1種。
4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中添加劑為選自由1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三𠯤(HOOBt)、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯(Oxyma)、以及5-(羥基亞胺基)-1,3-二甲基嘧啶-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮(Oxyma B)所組成之群組中的至少1種。
5. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中縮合步驟是在溶媒中進行，溶媒中的碳二亞胺系縮合劑的濃度為0.4mol/L以上、0.5mol/L以上、0.6mol/L以上、或0.7mol/L以上。
6. 如請求項1至5中任一項所述之製造方法，其中固相為膜或固相合成用樹脂。
7. 如請求項6所述之方法，其中膜為纖維素膜、聚丙烯膜、或聚胺乙基甲基丙烯醯胺膜。
8. 如請求項1至7中任一項所述之方法，其中固相與第一胺基酸或第一胜肽是透過光裂解性部位、雙硫鍵、或酸不穩定部位結合。
9. 如請求項1至8中任一項所述之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為非天然胺基酸。
10. 如請求項1至9中任一項所述之方法，其中第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為α,α-二取代胺基酸、β-支鏈胺基酸、或者N-烷基胺基酸(但N-烷基胺基酸中的烷基可由獨立選自C ₃~C ₆環烷基、C ₂~C ₆烯基、C ₂~C ₆炔基、或C ₆~C ₁₀芳基的1或複數個基所取代)。
11. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中第二胺基酸或第二胜肽的C端的胺基酸為非天然胺基酸。
12. 一種如請求項1至11中任一項所述之方法中的式(A)表示的碳二亞胺系縮合劑的用途。
13. 一種擔載於膜的胜肽化合物的製造方法，其包括如請求項1至11中任一項所述之方法。
14. 一種擔載於膜的胜肽庫的製造方法，其包括根據如請求項13所述之方法，獲得擔載於膜的10種以上胜肽化合物之步驟。
15. 如請求項13或14所述之方法，其中使用自動合成機。