CN1649892A - 合成肽的方法 - Google Patents
合成肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1649892A CN1649892A CN02829521.8A CN02829521A CN1649892A CN 1649892 A CN1649892 A CN 1649892A CN 02829521 A CN02829521 A CN 02829521A CN 1649892 A CN1649892 A CN 1649892A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- amine
- mixture
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
Abstract
本发明涉及一种新的在溶液中合成肽的方法，该方法包含：a)用过量的在有机溶剂中的脂族仲胺处理肽或氨基酸衍生物，所述肽或氨基酸衍生物具有用式R1－SO2－CH2CH2－O－CO－的氨基甲酸乙酯基团封闭的α－胺官能团，其中R1是芳基，以提供所述氨基酸或肽衍生物的游离α－胺官能团的释放，并在所述的仲胺和释放出的式R1－SO2－CH2＝CH2的乙烯基化合物之间形成叔胺加合物；b)除去溶剂和多余的所述仲胺；c)在特定条件下使这样形成的Nα－去保护的氨基酸或肽衍生物和所述的叔胺加合物的混合物与随后的用上述的或另外的氨基甲酸乙酯基团Nα－保护的肽或氨基酸衍生物接触，所述的特定条件能使Nα－去保护的氨基酸或肽衍生物的游离的α－胺官能团与随后的Nα－保护的肽或氨基酸衍生物的α－羧基官能团之间形成肽键；d)从反应混合物中分离新形成的肽；e)重复上述过程，直到得到期望多肽。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的在溶液中合成肽的方法，该方法能显著促进和加速全合成方法。
背景技术
在肽合成中的基本问题是封闭或保护α-氨基以免与同一氨基酸上的羧基相互作用。通过给氨基酸连接一个基团防止这些不期望有的副反应，所述基团能使得NH2不起反应，并且仍然允许期望的反应进行。除了提供氨基保护外，保护基团优选地为这样的，它能被容易地去除且不对分子的剩余部分(包括在合成过程已经建立起的肽键)产生化学改变。肽链装配通常由多个连续的合成循环组成，每一个循环包括两个基本的化学步骤：1)从建立的肽的α-氨基除去保护基(Nα-去保护阶段)，和2)将Nα-去保护的肽与随后的Nα-保护的氨基酸或肽片段偶联。因此，进行Nα-去保护阶段的容易和快捷有利于肽装配的整个过程的速度和效率。
报导用于肽合成的大多数氨基保护基已经集中在三个基团：苄氧羰基(Z或Cbz)，通过催化氢化裂解；叔丁氧基羰基(Boc或t-Boc)，通过温和的酸解裂解；和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，通过仲胺裂解(关于综述，参见例如Kocienski，P.Protecing groups，修订版，Thieme：Stuttgart-N.-Y.，2000；Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective groups in Organic Synthesis，第3版；John Wiley & Sons，Inc.：New York，NY，1999)。这些基团彼此是不相关的，因为Boc基团对仲胺和氢解是稳定的，Fmoc基团对酸解是稳定的，Z基团对仲胺和温和酸解是稳定的。这些保护基中的每一种都在肽化学中有用处。
Z基团从短肽的氢化裂解反应是简单和干净的；后处理只是包含去除催化剂和蒸发溶剂。但是，对于更长的肽，反应可能会非常慢。另外，肽中含硫氨基酸的存在使催化氢化变得不可能。
Boc基团裂解只是生成了挥发性的副产物，所以后处理是除去酸性裂解剂。酸的彻底去除对于成功地进行下面的偶联步骤是关键的，它在许多情况下需要多次蒸发、仔细洗涤和干燥Nα-去保护的肽。
Fmoc基团是在当代肽合成中广泛使用的碱不稳定的保护基，它已经表现出许多优点：它具有良好的酸稳定性；通过碱促进的β-消除，能通过多种胺以非水解的方式容易地裂解；在它的存在下，可以去除其它的标准的肽保护基(即，Boc、苄基)；而且，裂解后产生的胺是游离碱(Atherton，E.；Sheppard，R.C.，in The Peptides；Udenfriend，S.；Meienhofer，J.，Eds.；Academic Press：New York，NY，1987；Vol.9，p.1.)。但是，在Fmoc方法学已经被广泛应用于自动固相肽合成的同时，它也具有几种阻止了其应用于溶液肽合成的缺点。首先，Fmoc保护的氨基酸(和肽)在通常用于偶联阶段的弱碱性的和中性的DMF溶液中的稳定性较差(Atherton，E.；Bury，C.；Sheppard，R.C.；Williams，B.J.Tetrahedron Lett.1979，3041；Bodanszky，M.；Deshmane，S.S.；Martinez，J.J.Org.Chem.1979，44，1622.)。其次，可能多数是有害的，是使用过量的裂解剂(脂族仲胺)的Fmoc裂解链烯产物(二亚甲基茚)的相对缓慢的和可逆的反应。难以有效地用胺捕获二亚甲基茚和随后从反应混合物中去除，最终导致目标肽产物中污染有微溶的二亚甲基茚聚合物。
显然，需要用于溶液肽合成的有效的和灵活的方法，它能具有FmocNα-保护的优点同时又克服了其缺点。
发明内容
本发明的一些发明人已经较早地发现，衍生于2-芳基磺酰基乙醇的氨基甲酸乙酯氨基保护基可以被胺在非水解条件下通过碱促进的β-消除来裂解，其机理与关于Fmoc裂解所述的机理(Samukov，V.V.；Sabirov，A.N.；Troshkov，M.L.Zh.Obshchei Khim.1988，58，1432)非常相似。但是令人惊奇地，与Fmoc相反，当用过量的脂族仲胺作为裂解剂时，氨基甲酸乙酯裂解产物(芳基乙烯基砜)能被非常快地且不可逆地捕获(Samukov，V.V.；Sabirov，A.N.；Pozdnyakov，P.I.Tetrahedron Lett.1994，35，7821；Sabirov，A.N.；Kim，Y.-D.；Kim，H.-J.；Samukov，V.V.Protein Peptide Lett.1997，4，307)。在该情况下，捕获的产物是乙烯基砜-胺加合物(即叔胺)，所以去除过量的裂解剂和溶剂会生成等摩尔的Nα-去保护的肽和上述叔胺的混合物。这样，已经推断在进行偶联阶段之前不需要分离该混合物，因为为了维持介质的碱性和促进酰化反应总是将叔胺加入到偶联混合物中，所以已经存在的摩尔当量的胺会很好地实现该目的。
因此，本发明涉及一种新的在溶液中合成肽的方法，它利用了上述发现，并且显著促进和加速了整个合成过程。
因此，本发明的一个目的是合成肽的方法，该方法包括：
a)用过量的在有机溶剂中的脂族仲胺处理肽或氨基酸衍生物，所述肽或氨基酸衍生物具有用式R1-SO2-CH2CH2-O-CO-的氨基甲酸乙酯基团封闭的α-胺官能团，其中R1是芳基，以提供所述氨基酸或肽衍生物的游离α-胺官能团的释放，并在所述的仲胺和释放出的式R1-SO2-CH2＝CH2的乙烯基化合物之间形成叔胺加合物；
b)除去溶剂和多余的所述伸胺；
c)在特定条件下使这样形成的Nα-去保护的氨基酸或肽衍生物和所述的叔胺加合物的混合物与随后的用上述的或另外的氨基甲酸乙酯基团Nα-保护的肽或氨基酸衍生物接触，所述的特定条件能使Nα-去保护的氨基酸或肽衍生物的游离的α-胺官能团与随后的Nα-保护的肽或氨基酸衍生物的α-羧基官能团之间形成肽键；
d)从反应混合物中分离新形成的肽；
e)重复上述过程，直到得到期望多肽。
氨基甲酸乙酯结构中的R1基团可以是取代或未取代的芳基，但是，为了提供相当高速率的通过碱促进β-消除的氨基甲酸乙酯裂解，优选地使用具有强吸电子取代基的芳基。在这样的取代的芳基中，最优选的是4-硝基苯基和4-磺酰化的苯基。当R1＝4-硝基苯基时，Nα-保护基是已知的2-(4-硝基苯基)磺酰基乙氧基羰基(Nsc)基团(Samukov，V.V.；Sabirov，A.N.；Pozdnyakov，P.I.Tetrahedron Lett.1994，35，7821；美国专利5,616,788；6,265,590)。4-磺酰化的苯基基团的示例是本领域已知作为氨基保护基的2-(4-甲基磺酰基苯基)磺酰基乙氧基羰基(Mpc)基团(Verhart，C.；Tesser，G.Rec.Trav.Chim.Pays-Bas.1988，107，621)。该基团的其它优选实施方案包括，例如，4-苯基磺酰基苯基和多种4-磺酰胺衍生物，即4-二甲基氨基磺酰基苯基；4-二乙基氨基磺酰基苯基；4-吗啉代磺酰基苯基(4-morpholidosulfonyl-phenyl)；4-哌啶子基磺酰基苯基(4-piperididosulfonylphenyl)。
上述通过胺促进β-消除的氨基甲酸乙酯的裂解速度比可对比条件下的Fmoc基团的速度慢，但是，另一方面，这些氨基保护基在常用于偶联阶段的弱碱性的或中性的反应溶液中明显地比Fmoc更稳定。
为了快速地裂解上述的Nα-保护基和有效地捕获释放出的乙烯基砜化合物，对于用作裂解剂和净化剂的仲胺而言需要结合强碱和有效的亲核试剂的性质。同样重要的是胺的物理性质。可以通过多种途径从Nα-去保护反应后的反应混合物中分离多余的胺，但是，最简单和迅速的方法是真空蒸馏(蒸发)。这样，胺就需要是挥发性的(即具有低沸点)。在满足所有这些要求的胺中，最优选的是二甲基胺、二乙基胺、二-正丙基胺、哌啶、吡咯烷、吗啉。进行有效的裂解和捕获所需要的胺过量可以是2～100摩尔当量；肽化学领域的实践者可以容易地选择针对特定情况的最佳过量。
适合进行Nα-去保护步骤的溶剂优选地为能够溶解原料和反应产物的极性的、质子惰性的和挥发性的溶剂，例如二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、二噁烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜等。
这样形成的挥发性的裂解剂能够在进行Nα-去保护后容易地通过蒸发除去。通常，另外一次的与新鲜溶剂部分的共蒸发足以确保从反应混合物中完全除去仲胺。
例如通过蒸发除去多余的胺和溶剂后，无需任何其它后处理，就能将等摩尔的Nα-去保护的氨基酸或肽衍生物和乙烯基砜-胺加合物的混合物进一步加入与下一步的用上述的或其它的氨基甲酸乙酯基团Nα-保护的肽或氨基酸衍生物的偶联反应中。通过本领域已知的多种方法可以活化用于偶联的Nα-保护组分的α-羧基官能团，例如，通过预先形成活性酯，如4-硝基苯基酯、五氯苯基酯、五氟苯基酯、1-羟基苯并三唑基酯或其它已知的活性酯类型；通过转化成对称的或混合的酐或叠氮化物。偶联也可以在存在已知偶联剂的情况下进行，例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、苯并三唑基-1-氧基(三-二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)(phosphoniumhexafluorophosphate)、多种脲鎓(uronium)类型试剂。当在偶联反应中调整反应介质的碱性时，应当计算进已经存在于反应混合物中的1摩尔当量的碱。
通过本领域已知的通常方法(例如萃取、沉淀、洗涤、层析等)可以将新形成的肽从反应混合物中分离出。
可以重复上述方法所有顺序，直到构建出期望的多肽链。
当期望或需要时，可以在合成循环中用合适的保护基保护氨基酸或肽衍生物的侧链，然后去保护以得到终产物。可以使用的保护基的性质和类型、它们的应用和它们的随后的去除都很好地记载在文献中，并且为本领域技术人员所知。
具体实施方式
现在通过实施例来描述本发明，它们只是作为举例说明，而无意进行限制。除非另有说明，下面的说明中的所有氨基酸具有L-构型。如这里所使用的，官能团和保护基团、溶剂、试剂等的缩写如下：
Boc-叔丁氧基羰基
BOP-苯并三唑基-1-氧(三-二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐
Cbz-苄基氧羰基
DCC-N，N′-二环己基碳二亚胺
Despsc-2-(4-二乙基氨基磺酰基)苯基磺酰基乙氧基羰基
DMF-N，N-二甲基甲酰胺
Dmspsc-2-(4-二甲基氨基磺酰基)苯基磺酰基乙氧基羰基
FC-快速层析
Fmoc-9-芴基甲氧基羰基
HOBt-1-羟基苯并三唑
Mpc-2-(4-甲基磺酰基)苯基磺酰基乙氧基羰基
Mspsc-2-(4-吗啉代磺酰基)苯基磺酰基乙氧基羰基
NMM-N-甲基吗啉
Nsc-2-(4-硝基苯基磺酰基)乙氧基羰基
Pfp-五氟苯基
Pipspsc-2-(4-哌啶子基磺酰基)苯基磺酰基乙氧基羰基
Pspsc-2-(4-苯基磺酰基)苯基磺酰基乙氧基羰基
tBu-叔丁基
THF-四氢呋喃
TFA-三氟乙酸
TEA-三乙基胺
显示出了薄层层析片Alufolien Kieselgel 60 F254(Merck，Darmstadt，Germany)的层析迁移率值Rf；已经用氯仿/甲醇/乙酸95∶5∶3(A)和90∶10∶3(B)和乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水60∶5∶15∶10(C)作为展开溶剂，通过紫外吸光度和/或茚三酮反应检测样点。已经通过MALDI-TOF VISION 2000装置(Thermo Bioanalysis，England)测量了分子离子质量(M+H)+。
实施例1：氯甲酸2-(4-苯基磺酰基)苯基磺酰基乙酯(Pspsc-Cl)
a.2-(4-苯基磺酰基)苯基磺酰基乙醇
向搅拌的2-(4-氯苯基)磺酰基乙醇(4.41g)和苯硫酚(3.1g)于10ml DMF的溶液中加入1.4g在5ml乙醇中的KOH。在环境温度连续搅拌10小时，然后用70ml水稀释，用100ml乙酸乙酯萃取。用5％NaHCO3水溶液和盐水洗涤萃取物，经无水硫酸钠干燥，减压蒸发。然后将油状残余物溶解到30ml丙酮中。向该溶液加入3ml 0.3M钼酸钠水溶液，然后在搅拌下加入8ml 30％过氧化氢。将混合物在50℃保持6小时，蒸发后用100ml水处理。滤出沉淀，用水洗涤，干燥，在乙酸乙酯-石油中重结晶，得到3.6g标题产物；熔点107-108℃；Rf 0.35(A)。对于C14H14O5S2(FW 326.39)理论值：C51.52％，H 4.32％；实验值：C 51.14％，H 4.40％。
b.Pspsc-Cl。
向在-10℃冷却并搅拌的THF(35ml)和碳酰氯(10ml)的30％甲苯溶液的混合物中加入细粉状的2-(4-苯基磺酰基)苯基磺酰基乙醇(3.2g)，在环境温度连续搅拌过夜。将混合物蒸发至干，用甲苯处理固体残余物，过滤分离，用甲苯和石油洗涤，在真空干燥器中干燥。产量3.55g；熔点160-161℃。对于C15H13ClO6S2(FW 388.85)理论值：C 46.33％，H 3.37％；实验值：C45.94％，H 3.48％。
实施例2：氯甲酸2-(4-二甲基氨基磺酰基)苯基磺酰基乙酯(Dmspsc-Cl)
a.N，N-二甲基-4-溴苯磺酰胺
在10分钟期间内，向搅拌且冷却(冰浴)的16ml 30％二甲胺水溶液和50ml二噁烷的混合物中逐份加入4-溴苯磺酰氯(7.7g)。蒸发混合物，用大量水处理，滤出沉淀，用冷水洗涤后，直接用于下一步骤。
b.2-(4-二甲基氨基磺酰基)苯基磺酰基乙醇
向粗制N，N-二甲基-4-溴苯磺酰胺、3ml 2-巯基乙醇和30ml DMF的混合物中添加18ml 2N KOH的乙醇溶液，在70℃保温8小时。用200ml水稀释混合物后，用2×70ml乙酸乙酯萃取。用5％NaHCO3水溶液和盐水洗涤萃取物，经无水硫酸钠干燥后，减压蒸发。然后将油状残余物溶解到50ml丙酮中。向该溶液加入4ml 0.3M钼酸钠水溶液，然后在搅拌下加入10ml 30％过氧化氢。将混合物在50℃保持5小时，蒸发后用100ml水处理。滤出沉淀，用水洗涤，干燥，然后用乙酸乙酯-石油洗涤，产率7.1g标题产物；熔点171-173℃；Rf 0.27(A)。对于C10H15NO5S2(FW 293.36)理论值：C 40.94％，H 5.15％，N 4.77％；实验值：C 41.35％，H 5.05％，N 4.42％。
c.Dmspsc-Cl
如实施例1b所述从2-(4-二甲基氨基磺酰基)苯基磺酰基乙醇制备。熔点135℃(软化)，144℃。对于C11H14ClNO6S2(FW 355.82)理论值：C 37.13％，H 3.97％，N 3.94％；实验值：C 37.42％，H 4.05％，N 3.77％。
通过上述方法还制备了下述化合物：
2-(4-哌啶子基磺酰基)苯基磺酰基乙醇；熔点181-182℃；Rf 0.34(A)。对于C13H19NO5S2(FW 333.43)理论值：C 46.83％，H 5.74％，N 4.20％；实验值：C 47.18％，H 5.65％，N 4.05％。
氯甲酸2-(4-哌啶子基磺酰基)苯基磺酰基乙酯(Pipspsc-Cl)；熔点185-187℃。对于C14H18ClNO6S2(FW 395.88)理论值：C 42.48％，H 4.58％，N3.54％；实验值：C 42.32％，H 4.65％，N 3.42％。
2-(4-吗啉代磺酰基)苯基磺酰基乙醇；熔点190-191℃；Rf 0.23(A)。对于C12H17NO6S2(FW 335.40)理论值：C 42.97％，H 5.11％，N 4.18％；实验值：C42.68％，H 5.25％，N 4.01％。
氯甲酸2-(4-吗啉代磺酰基)苯基磺酰基乙酯(Mspsc-Cl)；熔点166-169℃。对于C13H16ClNO7S2(FW 397.86)理论值：C 39.25％，H 4.05％，N3.52％；实验值：C 39.61％，H 4.15％，N 3.39％。
2-(4-二乙基氨基磺酰基)苯基磺酰基乙醇；熔点167-168℃；Rf 0.30(A)。对于C12H19NO5S2(FW 321.42)理论值：C 44.84％，H 5.96％，N 4.36％；实验值：C 44.48％，H 6.08％，N 4.21％。
氯甲酸2-(4-二乙基氨基磺酰基)苯基磺酰基乙酯(Despsc-Cl)；熔点155-157℃。对于C13H18ClNO6S2(FW 383.87)理论值：C 40.68％，H 4.73％，N3.65％；实验值：C 40.21％，H 4.85％，N 3.49％。
实施例3：Nα-保护的氨基酸
向氨基酸(3.6mmol)于10ml无水氯仿的悬浮液中加入三甲基氯硅烷(8mmol)，然后在搅拌并冷却下加入TEA(8mmol)。在40℃搅拌1小时后，向得到的澄清溶液中加入氯甲酸酯(3mmol，实施例1、2)，在环境温度继续搅拌3小时。然后蒸发混合物，残余物在冷却的0.5N HCl水溶液(20ml)和乙酸乙酯(30ml)之间分配。用0.5N HCl水溶液和水洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥，减压蒸发。残余物在合适的溶剂中重结晶，或者在硅胶柱上进行快速层析。通过该方法制备的Nα-保护的氨基酸列于表1中。
根据公开的方法制备出Nsc-和Mpc-氨基酸。
表1：Nα-保护的氨基酸
编号 Nα-保护的氨基酸 产率，％ 熔点，℃ [α]D 20(c 1，DMF) 纯化方法
1 Pspsc-Phe-OH 70 160-162 -16.3° 丙酮-乙醚
2 Dmspsc-Phe-OH 55 130-132 -15.9° FC
3 Pipspsc-Phe-OH 72 143-145 -15.9° FC
4 Mspsc-Phe-OH 52 166-168 -14.6° FC
5 Pspsc-Val-OH 70 178-179 -7.8° FC
6 Dmspsc-Val-OH 65 142-144 -7.5° FC
7 Pipspsc-Val-OH 75 162-164 -6.7°
8 Mspsc-Val-OH 72 187-189 -7.9° FC
9 Despsc-Val-OH 71 155-157 -7.4° FC
10 Pspsc-Gly-OH 80 170-171 丙酮-乙醚
11 Dmspsc-Gly-OH 77 156-159 FC
12 Pipspsc-Gly-OH 75 195-197 乙醇-乙醚
13 Mspsc-Gly-OH 62 200-203 FC
14 Despsc-Gly-OH 72 182-184 FC
15 Pspsc-Leu-OH 75 141-143 -16.9° FC
16 Dmspsc-Leu-OH 62 158-160 -16.2° FC
17 Pipspsc-Leu-OH 78 176-178 -14.9° FC
18 Mspsc-Leu-OH 70 162-163 -16.0° FC
19 Dmspsc-Asp(OtBu)-OH 80 128-129 -10.8° FC
20 Mspsc-Glu(OtBu)-OH 80 168-169 -8.4° FC
21 Pipspsc-Pro-OH 75 180-181 -19.7° FC
实施例4：Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu(亮氨酸脑啡肽)的合成
a.Mspsc-Phe-Leu-OtBu
将亮氨酸叔丁酯盐酸盐(0.6mmol)、Mspsc-Phe-OH(0.5mmol，编号4，表1)和HOBt(0.74mmol)溶解到2ml DMF中。向该溶液加入NMM(2mmol)和BOP(0.6mmol)，在环境温度将混合物保持60分钟。然后将混合物在25ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液之间分配，分离有机相，随后用水、0.5N HCl水溶液洗涤，再用水洗涤，蒸发至干。用乙醚处理残余物得到83％的标题二肽；Rf 0.50(A)。
b.Pipspsc-Gly-Phe-Leu-OtBu
将二肽(实施例4a)溶解到DMF-哌啶混合物(1∶4，v/v；3ml)中，10分钟后，在1mm汞柱下蒸发至干。残余物与3ml DMF共蒸发后，溶解到DMF(2ml)中。向该溶液中加入Pipspsc-Gly-OH(0.5mmol，编号12，表1)、HOBt(0.74mmol)、NMM(1mmol)和BOP(0.6mmol)，在环境温度将混合物放置1.5小时。然后将混合物在25ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液之间分配，分离有机相，随后用水、0.5N HCl水溶液洗涤，再用水洗涤，蒸发至干。用乙醚处理残余物得到86％的标题三肽；Rf 0.32(A)。
c.Dmspsc-Gly-Gly-Phe-Leu-OtBu
将三肽(实施例4b)溶解到DMF-哌啶混合物(1∶4，v/v；3ml)中。15分钟后，在1mm汞柱下蒸发至干。残余物与3ml DMF共蒸发后，溶解到DMF(2ml)中。向该溶液中加入Dmspsc-Gly-OH(0.45mmol，编号11，表1)、HOBt(0.6mmol)、NMM(0.8mmol)和BOP(0.5mmol)，在环境温度将混合物放置1.5小时。然后将混合物在35ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液之间分配，分离有机相，随后用水、0.5N HCl水溶液洗涤，再用水洗涤，蒸发至干。用乙醚-石油处理残余物得到93％的标题四肽；Rf 0.55(B)。
d.Boc-Tyr(Boc)-Gly-Gly-Phe-Leu-OtBu
将四肽(实施例4c)溶解到DMF-哌啶混合物(1∶4，v/v；3ml)中。15分钟后，在1mm汞柱下蒸发至干。残余物与3ml DMF共蒸发后，溶解到DMF(3ml)中。向该溶液中加入Boc-Tyr(Boc)-OPfp(0.4mmol)，在环境温度将混合物放置30分钟。然后将混合物在35ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液之间分配，分离有机相，随后用水、0.5N HCl水溶液洗涤，再用水洗涤，蒸发至干。用石油醚处理残余物得到90％的标题五肽；Rf 0.75(B)。
e.Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
将保护的五肽(实施例4d)溶解到氯仿-TFA-水(50∶50∶2，10ml)中，在环境温度放置1小时。然后将溶液蒸发至干，将残余物与乙醚一起研磨。在含有乙醚的乙醇中再沉淀，生成160mg亮氨酸脑啡肽三氟醋酸酯(48％，根据开始的Mspsc-Phe-OH计算)；Rf 0.27(C)；M/z＝556.5，M+H+(理论值556.77)；经HPLC得纯度为94％。
已经使用不同的Nα-保护基团和Nα-解封剂的组合重复了上述合成。这样进行的合成实验总结于表2中。N-端和C-端氨基酸、合成级别和偶联条件如上所述。氨基酸残基从N-端向C-端编号；对于粗制去保护的亮氨酸脑啡肽三氟醋酸酯，总产率和纯度如上所述。
表2：亮氨酸脑啡肽的合成
Nα-保护(编号) Nα-解封剂 总产纯度，
Gly-2 Gly-3 Phe-4 (反应时间，分钟) 率，％ ％
Nsc Nsc Nsc 哌啶/DMF，1∶4v/v(10) 52 95
Nsc Nsc Nsc 二乙胺/DMF，1∶4v/v(15) 46 92
Nsc Nsc Nsc 吗啉/DMF，1∶2v/v(30) 44 93
Nsc Nsc Nsc 二甲胺/DMF，2M(20) 39 93
Nsc Nsc Nsc 哌啶/MeCN，1∶4v/v(15) 42 92
Nsc Nsc Nsc 二丙胺/DMF，1∶3v/v(15) 37 93
Mpc Mpc Mpc 哌啶/DMF，1∶4v/v(15) 50 92
Pspsc(10) Despsc(14) Pspsc(1) 哌啶/二甲基乙酰胺，1∶4 v/v(15) 44 91
Dmspsc(11) Dmpsc(11) Dmpsc(2) 吡咯烷/DMF，1∶4 v/v(15) 49 92
实施例5：Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(THF-γ2)的合成
a.Nsc-Lys(Boc)-Phe-Leu-OtBu
将如实施例4b所述Nα-去保护的Mspsc-Phe-Leu-OtBu(0.87mmol，实施例4a)溶解到4ml DMF中。向该溶液中加入Nsc-Lys(Boc)-OH(1mmol)、HOBt(1.5mmol)、BOP(1.1mmol)和NMM(2mmol)，在环境温度放置混合物1小时，然后将混合物在25ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液中分配，分离有机相，使产物结晶。滤出沉淀，用乙醚洗涤得到86％标题三肽；Rf0.72(B)。
b.Nsc-Pro-Lys(Boc)-Phe-Leu-OtBu
将三肽(实施例5a)溶解到DMF-哌啶混合物(1∶4，v/v；5ml)中，15分钟后，在1mm汞柱下蒸发至干。残余物与3ml DMF共蒸发后，溶解到DMF(5ml)中。向该溶液中加入Nsc-Pro-OH(0.8mmol)、HOBt(1.2mmol)、NMM(1.8mmol)和BOP(0.85mmol)，在环境温度将混合物放置1.5小时。然后将混合物在35ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液之间分配，分离有机相，随后用水、0.5N HCl水溶液洗涤，再用水洗涤，蒸发至干。用乙醚处理残余物得到91％的标题四肽；Rf 0.60(B)。
c.Nsc-Gly-Pro-Lys(Boc)-Phe-Leu-OtBu
将四肽(实施例5b)溶解到DMF-哌啶混合物(1∶4，v/v；5ml)中，15分钟后，在1mm汞柱下蒸发至干。残余物与5ml DMF共蒸发后，溶解到DMF(5ml)中。向该溶液中加入Nsc-Gly-OH(0.8mmol)、HOBt(1.2mmol)、NMM(1.8mmol)和BOP(0.85mmol)，在环境温度将混合物放置2.5小时。然后将混合物在35ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液之间分配，分离有机相，随后用水、0.5N HCl水溶液洗涤，再用水洗涤，蒸发至干。用乙酸乙酯-乙醚处理残余物得到94％的标题五肽；Rf 0.50(B)。
d.Mspsc-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-OH
向冷却的Mspsc-Glu(OtBu)-OH(1mmol)和五氟苯酚(1.2mmol)于5mlTHF的溶液中加入DCC(1mmol)，在环境温度搅拌混合物2小时。滤出沉淀，滤液蒸发后与在4ml DMF中的1.1mmol H-Asp(OtBu)-OH合并。搅拌混合物12小时直至形成澄清溶液，然后在30ml乙酸乙酯和30ml冷却的0.25N HCl水溶液之间分配。分离有机相，随后用冷却的0.25N HCl水溶液和水洗涤，蒸发至干。用乙醚处理残余物得到88％的目标二肽；Rf0.25(A)。
e.Boc-Leu-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-OH
将二肽(实施例5d)溶解到DMF-哌啶混合物(1∶4，v/v；5ml)中，15分钟后，在1mm汞柱下蒸发至干。残余物与2×5ml DMF共蒸发后，溶解到DMF(5ml)中。向该溶液中加入Boc-Leu 4-硝基苯酯(1.1mmol)和HOBt(0.2mmol)。在环境温度将该混合物放置3小时。然后将混合物在35ml乙酸乙酯和30ml冷却的0.25N HCl水溶液之间分配。分离有机相，随后用冷却的0.25N HCl水溶液和水洗涤，蒸发成油。通过研磨用石油(2×10ml)洗涤残余物，然后真空干燥，得到固体泡沫状的74％目标三肽；Rf 0.40(A)。
f.Boc-Leu-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Phe-Leu-OtBu
将五肽(0.38mmol，实施例5c)溶解到DMF-哌啶混合物(1∶4，v/v；3ml)中，15分钟后，在1mm汞柱下蒸发至干。残余物与5ml DMF共蒸发后，溶解到DMF(3ml)中。向该溶液中加入Boc-Leu-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-OH(0.41mmol，实施例5e)、HOBt(1mmol)、NMM(1mmol)和BOP(0.55mmol)，在环境温度将混合物放置4小时。然后将混合物在35ml乙酸乙酯和20ml 5％NaHCO3水溶液之间分配，分离有机相，随后用5％NaHCO3水溶液、0.5N HCl水溶液和水洗涤，蒸发成油。用乙醚-己烷处理残余物得到90％的标题受保护的八肽；Rf 0.45(A)。
g.Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu
将受保护的八肽(440mg)溶解到10ml冷却的TFA-水混合物(9∶1，v/v)中，在环境温度搅拌40分钟。蒸发溶液，用冷却的乙醚处理稠油状残余物。滤出沉淀，用乙醚洗涤，真空下干燥，生成380mg粗制八肽(经HPLC，纯度为87％)。将肽溶解到4％乙酸水溶液中，通过制备反相层析在Lichroprep RP18柱上使用乙酸缓冲的水-乙醇梯度纯化。最终生成280mg98％纯八肽；m/z＝919.5，M+H+(理论值919.13)；[α]D 20＝-68.9°(c 1，1％CH3COOH水溶液)。
工业实用性
本发明提供了一种新的在溶液中合成肽的方法，从而显著促进和加速了总的合成过程。
Claims (8)
1.合成肽的方法，该方法包括：
a)用过量的在有机溶剂中的脂族仲胺处理肽或氨基酸衍生物，所述肽或氨基酸衍生物具有用式R1-SO2-CH2CH2-O-CO-的氨基甲酸乙酯基团封闭的α-胺官能团，其中R1是芳基，以提供所述氨基酸或肽衍生物的游离α-胺官能团的释放，并在所述的仲胺和释放出的式R1-SO2-CH2＝CH2的乙烯基化合物之间形成叔胺加合物；
b)除去溶剂和多余的所述仲胺；
c)在特定条件下使这样形成的Nα-去保护的氨基酸或肽衍生物和所述的叔胺加合物的混合物与随后的用上述的或另外的氨基甲酸乙酯基团Nα-保护的肽或氨基酸衍生物接触，所述的特定条件能使Nα-去保护的氨基酸或肽衍生物的游离的α-胺官能团与随后的Nα-保护的肽或氨基酸衍生物的α-羧基官能团之间形成肽键；
d)从反应混合物中分离新形成的肽；
e)重复上述过程，直到得到期望多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述R1选自由4-硝基苯基、4-苯基磺酰基苯基、4-甲基磺酰基苯基、4-二甲基氨基磺酰基苯基、4-二乙基氨基磺酰基苯基、4-吗啉代磺酰基苯基和4-哌啶子基磺酰基苯基组成的组。
3.权利要求1的方法，其中所述脂族仲胺选自由二甲基胺、二乙基胺、二-正丙基胺、哌啶、吡咯烷和吗啉组成的组。
4.权利要求1的方法，其中所述有机溶剂是挥发性的、质子惰性的溶剂。
5.权利要求4的方法，其中所述挥发性的、质子惰性的溶剂选自由二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、二噁烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基-乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二甲亚砜组成的组。
6.如权利要求3或4的方法，其中除去溶剂和多余的脂族仲胺是通过蒸发完成的。
7.权利要求1的方法，其中所述的接触步骤是在偶联剂存在下完成的。
8.权利要求7的方法，其中所述偶联剂选自由二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、苯并三唑基-1-氧基(三-二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)和脲鎓类型的偶联剂组成的组。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2002/001604 WO2004018501A1 (en) | 2002-08-26 | 2002-08-26 | Method for synthesizing peptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1649892A true CN1649892A (zh) | 2005-08-03 |
Family
ID=31944805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN02829521.8A Pending CN1649892A (zh) | 2002-08-26 | 2002-08-26 | 合成肽的方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1546186A4 (zh) |
| JP (1) | JP2006511459A (zh) |
| CN (1) | CN1649892A (zh) |
| AU (1) | AU2002329070A1 (zh) |
| CA (1) | CA2496739A1 (zh) |
| WO (1) | WO2004018501A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100355773C (zh) * | 2006-01-19 | 2007-12-19 | 九江石化波涛生化科技有限公司 | 高分子量多肽聚合物的合成方法 |
| CN103974968A (zh) * | 2011-09-28 | 2014-08-06 | 莫雷洛斯州自治大学 | 免疫调节剂金属肽(immp)和包含其的组合物 |
| CN113227115A (zh) * | 2018-12-24 | 2021-08-06 | 斯特兰化学公司 | 肽的合成方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602005023429D1 (de) | 2004-10-19 | 2010-10-21 | Lonza Ag | Verfahren zur festphasen-peptidsynthese |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2652581B1 (fr) * | 1989-10-02 | 1991-12-13 | Rhone Poulenc Chimie | Procede de solubilisation de peptides et procede de synthese de peptides. |
| US5859191A (en) * | 1996-12-05 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Method for the site-specific modification of peptide alpha amines |
| KR100418962B1 (ko) * | 2001-06-07 | 2004-02-14 | 김학주 | 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류를사용하여 펩티드를 고수율 및 고순도로 제조하는 방법 |
-
2002
- 2002-08-26 EP EP02765630A patent/EP1546186A4/en not_active Withdrawn
- 2002-08-26 CA CA002496739A patent/CA2496739A1/en not_active Abandoned
- 2002-08-26 JP JP2004530625A patent/JP2006511459A/ja active Pending
- 2002-08-26 AU AU2002329070A patent/AU2002329070A1/en not_active Abandoned
- 2002-08-26 WO PCT/KR2002/001604 patent/WO2004018501A1/en not_active Application Discontinuation
- 2002-08-26 CN CN02829521.8A patent/CN1649892A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100355773C (zh) * | 2006-01-19 | 2007-12-19 | 九江石化波涛生化科技有限公司 | 高分子量多肽聚合物的合成方法 |
| CN103974968A (zh) * | 2011-09-28 | 2014-08-06 | 莫雷洛斯州自治大学 | 免疫调节剂金属肽(immp)和包含其的组合物 |
| CN113227115A (zh) * | 2018-12-24 | 2021-08-06 | 斯特兰化学公司 | 肽的合成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2002329070A1 (en) | 2004-03-11 |
| JP2006511459A (ja) | 2006-04-06 |
| WO2004018501A1 (en) | 2004-03-04 |
| EP1546186A1 (en) | 2005-06-29 |
| CA2496739A1 (en) | 2004-03-04 |
| EP1546186A4 (en) | 2006-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1022412C (zh) | 尿烷保护的氨基酸-n-羧酸酐类的制备方法 | |
| JP5515738B2 (ja) | ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法 | |
| JP2021531326A (ja) | 液相ペプチド合成のための方法およびその保護戦略 | |
| WO2019198834A1 (ja) | リュープロレリンの製造方法 | |
| WO2020227594A1 (en) | Compounds for use in synthesis of peptidomimetics | |
| CN1649892A (zh) | 合成肽的方法 | |
| CN1254484C (zh) | 醋酸奥曲肽的固相合成方法 | |
| JPH0662511B2 (ja) | 新規な置換炭酸のエステル類及びそれらの製造法 | |
| JP5445456B2 (ja) | ジベンゾフルベンの除去方法 | |
| JP2005325109A (ja) | 環状ペプチド中のジスルフィド結合の形成方法 | |
| CN1200947C (zh) | 制备环(Asp－Dphe－NMeVal－Arg－Gly)的方法 | |
| US6277958B1 (en) | Method for preparing peptide thiol ester | |
| CN1832962A (zh) | 促生长素抑制素肽的制备 | |
| Ramapanicker et al. | Applications of Propargyl Esters of Amino Acids in Solution-Phase Peptide Synthesis | |
| JP7254771B2 (ja) | 長鎖ペプチドの製造方法 | |
| JP4264353B2 (ja) | Ｎ−メチル−ホモシステイン、その使用及びその製造法 | |
| EP0410182A2 (en) | A new technique for rapid peptide coupling | |
| CN1199988C (zh) | 醋酸奥曲肽的液相合成方法 | |
| Lack et al. | A useful disulfide linker for single‐bead analysis of peptide libraries | |
| Tantry et al. | Rapid and efficient synthesis of the pentapeptide of elastin protein and peptides containing highly hindered α, α-dialkyl amino acids employing Fmoc-amino acid chlorides under microwave irradiation in the solution phase | |
| JP2748897B2 (ja) | 新規なアルギニン誘導体およびこれを用いるペプチドの製造方法 | |
| Tantry et al. | Synthesis of peptides employing 9-fluorenylmethyl chloroformate as a coupling agent | |
| KR20160081864A (ko) | 티올기를 갖는 d-체 또는 l-체 아미노산 유도체의 제조 방법 | |
| EP0292228A2 (en) | Protecting groups for asparagine and glutamine in peptide synthesis | |
| JP3265378B2 (ja) | 異種の光学活性なα−アミノ酸からなるＮ，Ｎ´−エチレン架橋したジペプチドおよびそれらの合成法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |