JP7254771B2 - 長鎖ペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
そこで本発明は、工業的な大量合成にも適する長鎖ペプチドの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
以下、本発明を示す。
スルホン酸類を用いて下記式(I)で表される化合物のN末端を選択的に脱保護して下記式(II)で表される化合物を得た後、塩基性化合物を添加して反応液を中和する工程A、
Boc-(AA1)m-Pro1 ・・・ (I)
H-(AA1)m-Pro1 ・・・ (II)
[式中、BocはN末端の保護基であるt-ブトキシカルボニル基を示し、(AA1)mは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、mは2以上50以下の整数を示し、Pro1はC末端の保護基を示す]
下記式(III)で表される化合物のC末端を選択的に脱保護して下記式(IV)で表される化合物を得る工程B、
Boc-(AA2)n-ONBn ・・・ (III)
Boc-(AA2)n-OH ・・・ (IV)
[式中、(AA2)nは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、nは2以上50以下の整数を示し、NBnは下記式(V)で表されるニトロベンジル基(式中、p、qおよびrは独立して0または1を示し、p+q+rは1、2または3を示す)を示す]
Boc-(AA2)n-(AA1)m-Pro1 ・・・ (VI)
[式中、Boc、(AA2)n、n、(AA1)m、m、およびPro1は、上記と同義を示す]
F1: Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
F2: Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
F3: Asn-Gly
F4: Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys
F5: Glu-Ala-Val-Arg-Leu
F6: Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu
F7: Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
F8: His-Gly-Glu-Gly
N末端がBocで保護され且つC末端がPro1で保護されている上記ペプチド断片Fs(sは1以上、7以下のいずれかの整数を示す)を上記式(I)で表される化合物として用い、且つ、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片Fs+1を上記式(III)で表される化合物として用い、上記ペプチド断片Fsと上記ペプチド断片Fs+1とを縮合する上記[8]に記載の方法。
F9: Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F3を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F4を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F10を製造する工程、
F10: Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F7を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F8を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F11を製造する工程、
F11: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F10を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F5を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F12を製造する工程、
F12: Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
N末端がBocで保護され且つC末端がNH2で保護されている上記ペプチド断片F9を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F12を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F13を製造する工程、
F13: Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
N末端がBocで保護され且つC末端がNH2で保護されている上記ペプチド断片F13を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F6を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F14を製造する工程、
F14: Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
N末端がBocで保護され且つC末端がNH2で保護されている上記ペプチド断片F14を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F11を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F15を製造する工程、
F15: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
および、上記ペプチド断片F15のN末端および反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む上記[12]に記載の方法。
本工程では、スルホン酸類を用いて化合物(I)のN末端を選択的に脱保護して化合物(II)を得た後、塩基性化合物を添加して反応液を中和する。
Boc-(AA1)m-Pro1 ・・・ (I)
H-(AA1)m-Pro1 ・・・ (II)
[式中、BocはN末端の保護基であるt-ブトキシカルボニル基を示し、(AA1)mは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、mは2以上50以下の整数を示し、Pro1はC末端の保護基を示す]
本工程では、化合物(III)のC末端を選択的に脱保護して化合物(IV)を得る。なお、本工程は、上記工程Aとは別途行うことが好ましい。
Boc-(AA2)n-ONBn ・・・ (III)
Boc-(AA2)n-OH ・・・ (IV)
[式中、(AA2)nは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、nは2以上50以下の整数を示し、NBnは下記式(V)で表されるニトロベンジル基(式中、p、qおよびrは独立して0または1を示し、p+q+rは1、2または3を示す)を示す]
本工程では、上記工程Aの反応液に、化合物(IV)を添加し、化合物(II)と化合物(IV)とを縮合して化合物(VI)を得る。上記工程Aの反応液へは、上記工程Bの反応液や、精製または粗精製した化合物(IV)を添加すればよいが、精製または粗生成した化合物(IV)を上記工程Aの反応液へ添加することが好ましい。即ち、少なくとも上記工程Aと本工程Cは同一系内(ワンポット)で行う。
Boc-(AA2)n-(AA1)m-Pro1 ・・・ (VI)
[式中、Boc、(AA2)n、n、(AA1)m、m、およびPro1は、上記と同義を示す]
本工程では、少なくとも化合物(VI)の反応性側鎖官能基を脱保護することにより、目的のペプチドを得る。勿論、化合物(VI)のAA2およびAA1が反応性側鎖官能基を有さない場合や、準反応性側鎖官能基を有するが保護されていない場合には、本工程を行う必要は無い。また、必要に応じて、N末端およびC末端の少なくとも一方を脱保護してもよい。各保護基の脱保護条件としては、公知条件を採用すればよい。
F1: Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
F2: Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
F3: Asn-Gly
F4: Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys
F5: Glu-Ala-Val-Arg-Leu
F6: Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu
F7: Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
F8: His-Gly-Glu-Gly
F9: Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
ペプチド断片F3を化合物(I)として用い、ペプチド断片F4を化合物(III)として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F10を得、
F10: Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
ペプチド断片F7を化合物(I)として用い、ペプチド断片F8を化合物(III)として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F11を得、
F11: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
ペプチド断片F10を化合物(I)として用い、ペプチド断片F5を化合物(III)として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F12を得、
F12: Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
ペプチド断片F9を化合物(I)として用い、ペプチド断片F12を化合物(III)として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F13を得、
F13: Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
ペプチド断片F13を化合物(I)として用い、ペプチド断片Fを化合物(III)として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F14を得、
F14: Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
ペプチド断片F14を化合物(I)として用い、ペプチド断片F11を化合物(III)として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F15を得る。
F15: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
(1)Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-OHの製造
Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-O(4-NBn)(0.82g,1.0mmol)に、Na2S2O4(0.86g,5.0mmol)、DMA(5mL)および水(0.5mL)を添加し、90℃で2時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチル(8mL)と水(8mL)を添加して分液と抽出を行い、フラグメントF2としてBoc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-OHを得た。
Boc-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(0.69g,1.1mmol)にジクロロメタン(5mL)とメタンスルホン酸(0.58g,6.0mmol)を添加し、室温で1.5時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン(0.62g,6.1mmol)を添加し室温で10分撹拌した後、該反応液を上記実施例1(1)で得られたBoc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-OHのジクロロメタン溶液(6mL)に添加した。続けてHOBt・H2O(0.23g,1.5mmol)を添加し、最後にEDC塩酸塩(0.29g,1.5mmol)を添加し、室温で16時間撹拌した。次いで反応を停止させ、抽出によりフラグメントF9としてBoc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2を得た(0.93mmol,純度95.0%)。
(1)Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-OHの製造
Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-O(4-NBn)(1.0g,0.94mmol)に、DMA(6g)、Na2S2O4(0.82g,4.7mmol)および水(0.6g)を添加し、90℃で2時間撹拌した。その後、20℃まで冷却し、5%硫酸水素カリウム水溶液(40g)を添加した。析出固体を濾取し、減圧乾燥することで、フラグメントF4として0.87gのBoc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-OHを得た。
Boc-Asn-Gly-O(4-NBn)(3.5g,8.3mmol)にジクロロメタン(160mL)とメタンスルホン酸(5.4g,56mmol)を添加し、3時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン(5.8g,57mmol)を添加して5分間撹拌することにより、N末端を脱保護した。
H-Asn-Gly-O(4-NBn)溶液に、上記実施例2(1)で得られたBoc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-OH(8.5g,7.0mmol)とHOOBt(2.0g,13mmol)を添加し、最後にEDC塩酸塩(2.0g,10mmol)の水溶液(5.8mL)を3時間かけて添加した。20℃で4時間撹拌後、水(160g)を添加して析出物を濾取することで、フラグメントF10としてBoc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)を得た(9.7g,6.3mmol)。
(1)Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-OHの製造
Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-O(4-NBn)(5.0g,5.9mmol)に、DMA(15g)、Na2S2O4(5.2g,30mmol)および水(1.1g)を添加し、100℃で3時間撹拌した。10℃まで冷却後、水(30g)とジクロロメタン(30g)を添加して分液と抽出を行い、フラグメントF8としてBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-OHを得た。
Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-O(4-NBn)(6.3g,4.9mmol)にジクロロメタン(11g)とメタンスルホン酸(2.4g,25mmol)を添加し、2時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン(2.6g,25mmol)を添加して15分間撹拌した後、上記実施例3(1)で得られたBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-OH溶液(42g,5.9mmol)、HOBt・H2O(1.1g,7.4mmol)、EDC塩酸塩(1.4g,7.4mmol)をこの順で添加した。0℃で18時間撹拌後、5%炭酸ナトリウム水溶液(60g)を添加した。析出した固体を濾取することで、フラグメントF11としてBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-O(4-NBn)を取得した(8.6g,4.6mmol,純度93.5%)。
(1)Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OHの製造
Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-O(4-NBn)(8.5g,7.2mmol)に、DMA(60mL)、Na2S2O4(6.2g,36mmol)および水(6mL)を添加し、90℃で4時間撹拌した。その後、水(60mL)を添加して室温まで冷却し、酢酸エチル(60mL)を添加して、室温で2時間撹拌した。析出した固体を濾取し、水と酢酸エチルで洗浄することにより、フラグメントF5としてBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OHを取得した(7.5g,7.2mmol,純度:96.5%)。
上記実施例2で得られたBoc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)(9.5g,6.2mmol)にジクロロメタン(105mL)とメタンスルホン酸(3.0g,31mmol)を添加し、1時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン(2.8g,28mmol)を添加して5分間撹拌した。更にDMA(146g)を添加して20℃まで昇温した。
上記反応液に、上記実施例4(1)で得られたBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OH(6.5g,6.2mmol)およびHOOBt(1.5g,9.3mmol)を添加し、最後にEDC塩酸塩(1.8g,9.3mmol)のDMA溶液(311mL)を5時間かけて添加した。20℃で13時間撹拌後、30℃で17時間撹拌した。更に、HOOBt(0.25g,1.6mmol)、EDC塩酸塩(0.30g,1.6mmol)、Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OH(0.97g,0.94mmol)、およびトリエチルアミン(0.22g,2.2mmol)を添加し、15時間撹拌した。その後、水(570mL)を添加し、一部を40℃で減圧濃縮した後に、水(285mL)を再び添加した。0℃に冷却し、析出物を濾取することで、フラグメントF12としてBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)を得た(15.7g)。
(1)Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-OHの製造
上記実施例4で得られたBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)(15g,6.1mmol)にDMA(90g)を添加し、55℃まで加温した。続けて水(9.0g)とNa2S2O4(5.3g,30mmol)を添加し、90℃になるまで加熱した。90℃で2時間撹拌後、水(90g)を添加して析出物を濾取することにより、フラグメントF12としてBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-OHを得た(13.4g,5.8mmol)。
上記実施例1で得られたBoc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(7.1g,5.8mmol)のジクロロメタン溶液(96g)にメタンスルホン酸(3.7g,39mmol)を添加し、3時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン(4.2g,41mmol)を添加し、5分間撹拌した。更にDMA(106g)を添加した後、ジクロロメタンを減圧留去した。
次いで、上記実施例5(1)で得られたBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-OH(11.2g,4.8mmol)、DMA(106g)およびHOOBt(1.6g,9.7mmol)を添加し、最後にEDC塩酸塩(1.9g,9.7mmol)を添加し、2時間撹拌した。更にEDC塩酸塩(0.46g,2.4mmol)とトリエチルアミン(0.24g,2.4mmol)を1時間おきに3度添加し、1時間撹拌した後に、トリエチルアミン(0.49g,4.8mmol)を添加し、13時間撹拌した。水(106g)を添加して析出物を濾取することで、フラグメントF13としてBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2を得た(13.3g,3.9mmol)。
(1)Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OHの製造
Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-O(4-NBn)(1.0g、0.69mmol)に、DMA(6.0g)、水(0.6g)およびNa2S2O4(1.2g,6.9mmol)を添加し、90℃で4時間撹拌した。続けて水(60g)を添加して析出した固体を濾取することで、フラグメントF6としてBoc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OHを得た(0.89g,0.68mmol,純度94.6%)。
上記実施例5で得られたBoc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(13g,3.8mmol)にジクロロメタン(104g)を添加した。続けて、メタンスルホン酸(7.3g,76mmol)を添加し、2時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン(8.3g,82mmol)を添加して5分間撹拌した。DMA(169g)を添加し、上記実施例6(1)で得られたBoc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH(3.9g,3.0mmol)およびHOOBt(1.2g,7.6mmol)を添加した。続けて30分ごとにEDC塩酸塩(0.36g,1.9mmol)を4回添加し、1時間撹拌した後、Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH(2.0g,1.5mmol)を添加し、2時間撹拌した。再びトリエチルアミン(0.19g,1.9mmol)およびEDC塩酸塩(0.36g,1.9mmol)を添加し、13時間撹拌した。水(273g)を添加して減圧濃縮した後、再び水(104g)を添加して析出した固体を濾取することで、フラグメントF14としてBoc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2を得た(16.1g)。
(1)Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OHの製造
上記実施例3で得られたBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-O(4-NBn)(11mmol)にDMSO(81g)を添加し、45℃に昇温した。Na2S2O4(5.6g,32mmol)を添加し、65℃で7時間撹拌後、再びNa2S2O4(1.9g,11mmol)を添加し、3時間撹拌した。水(0.58g)およびNa2S2O4(2.8g,16mmol)を添加し、1時間撹拌後、70℃で3時間撹拌した。20℃まで冷却後、水(302g)を添加して析出物を濾取することで、フラグメントF11としてBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OHを得た(20g)。
上記実施例6で得られたBoc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(15g,3.2mmol)にジクロロメタン(177g)を添加した。続けて、メタンスルホン酸(9.3g,96mmol)を添加し、2時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン(10g,103mmol)を添加し、5分間撹拌した。DMA(177g)を添加し、更に上記実施例7(1)で得られたBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH(6.1g,3.5mmol)およびHOOBt(1.1g,6.4mmol)を添加した。続けてEDC塩酸塩(1.2g,6.4mmol)を添加し、4時間撹拌した。更にBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH(0.56g,0.32mmol)を添加し、3時間撹拌し、続けて反応溶液を減圧濃縮した。残渣に水(354g)を添加し、10℃に冷却した後、析出した固体を濾取することにより、フラグメントF15としてBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2を得た(19.3g)。
上記実施例7で得られたBoc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(1.0g,0.2mmol)にジクロロメタン(15g)を添加した。続けて、メタンスルホン酸(1.2g,13mmol)を添加し、1時間撹拌した。反応溶液を氷冷後、DMF(10g)を加えて減圧濃縮した。次に水素雰囲気下、Pd/Cを用いて水素添加反応を実施後、ピペリジンを加えてエキセナチドを取得した。
Claims (12)
- 長鎖ペプチドを製造するための方法であって、
スルホン酸類を用いて下記式(I)で表される化合物のN末端を選択的に脱保護して下記式(II)で表される化合物を得た後、塩基性化合物を添加して反応液を中和する工程A、
Boc-(AA1)m-Pro1 ・・・ (I)
H-(AA1)m-Pro1 ・・・ (II)
[式中、BocはN末端の保護基であるt-ブトキシカルボニル基を示し、(AA1)mは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、mは2以上50以下の整数を示し、Pro1はC末端の保護基であるNH 2 またはONBnを示す]
下記式(III)で表される化合物のC末端を選択的に脱保護して下記式(IV)で表される化合物を得る工程B、
Boc-(AA2)n-ONBn ・・・ (III)
Boc-(AA2)n-OH ・・・ (IV)
[式中、(AA2)nは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、nは2以上50以下の整数を示し、NBnは下記式(V)で表されるニトロベンジル基(式中、p、qおよびrは独立して0または1を示し、p+q+rは1、2または3を示す)を示す]
および、上記工程Aの反応液に、上記式(IV)で表される化合物を添加し、上記式(II)で表される化合物と上記式(IV)で表される化合物とを縮合して下記式(VI)で表される化合物を得る工程Cを含み、
Boc-(AA2)n-(AA1)m-Pro1 ・・・ (VI)
[式中、Boc、(AA2)n、n、(AA1)m、m、およびPro1は、上記と同義を示す]
上記工程Cで得られる上記式(VI)で表される化合物を上記工程Aにおける上記式(I)で表される化合物として用い、上記工程A~Cを複数回繰り返すことを特徴とする方法。 - 上記工程Bにおいて、金属と酸との組み合わせ、または亜ジチオン酸類を用いてC末端を選択的に脱保護する請求項1に記載の方法。
- 上記スルホン酸類として、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、およびp-トルエンスルホン酸から必須的になる群より選択される1以上のスルホン酸を用いる請求項1または2に記載の方法。
- 上記塩基性化合物として有機アミン化合物を用いる請求項1~3のいずれかに記載の方法。
- 上記有機アミン化合物として、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンの少なくとも一方を用いる請求項4に記載の方法。
- Pro1がONBnであり上記工程Cで得られる上記式(VI)で表される化合物を上記工程Bにおける上記式(III)で表される化合物として用い、上記工程A~Cを複数回繰り返す請求項1~5のいずれかに記載の方法。
- 更に、少なくとも上記式(VI)で表される化合物の反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む請求項1~6のいずれかに記載の方法。
- 上記工程Cで溶媒を用い、当該溶媒としてアミド系溶媒を用いる請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- 上記アミド系溶媒として、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される1以上のアミド系溶媒を用いる請求項8に記載の方法。
- 上記長鎖ペプチドがエキセナチドである請求項1~9のいずれかに記載の方法。
- 下記アミノ酸配列を有するペプチド断片を用い、
F1: Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
F2: Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
F3: Asn-Gly
F4: Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys
F5: Glu-Ala-Val-Arg-Leu
F6: Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu
F7: Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
F8: His-Gly-Glu-Gly
N末端がBocで保護され且つC末端がPro1で保護されている上記ペプチド断片Fs(sは1以上、7以下のいずれかの整数を示す)を上記式(I)で表される化合物として用い、且つ、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片Fs+1を上記式(III)で表される化合物として用い、上記ペプチド断片Fsと上記ペプチド断片Fs+1とを縮合する請求項7に記載の方法。 - N末端がBocで保護され且つC末端がNH2で保護されている上記ペプチド断片F1を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F2を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F9を製造する工程、
F9: Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F3を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F4を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F10を製造する工程、
F10: Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F7を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F8を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F11を製造する工程、
F11: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F10を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F5を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F12を製造する工程、
F12: Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
N末端がBocで保護され且つC末端がNH2で保護されている上記ペプチド断片F9を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F12を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F13を製造する工程、
F13: Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
N末端がBocで保護され且つC末端がNH2で保護されている上記ペプチド断片F13を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F6を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F14を製造する工程、
F14: Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
N末端がBocで保護され且つC末端がNH2で保護されている上記ペプチド断片F14を上記式(I)で表される化合物として用い、N末端がBocで保護され且つC末端がONBnで保護されている上記ペプチド断片F11を上記式(III)で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片F15を製造する工程、
F15: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
および、上記ペプチド断片F15のN末端および反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む請求項11に記載の方法。
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