WO2019187469A1 - 長鎖ペプチドの製造方法 - Google Patents

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WO2019187469A1
WO2019187469A1 PCT/JP2019/000151 JP2019000151W WO2019187469A1 WO 2019187469 A1 WO2019187469 A1 WO 2019187469A1 JP 2019000151 W JP2019000151 W JP 2019000151W WO 2019187469 A1 WO2019187469 A1 WO 2019187469A1
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glu
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PCT/JP2019/000151
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村田　貴彦
昇平 山本
西山　章
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株式会社カネカ
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    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to an efficient method for producing a long-chain peptide.
  • the long-chain peptide structure is the main structure of peptide drugs that have attracted attention in recent years. Since this is an area where growth is expected in the future, its efficient manufacturing method is craved from the market, but there is no truly efficient method.
  • a typical peptide production method is a solid phase synthesis method. In the solid-phase synthesis method, amino acids supported on a solid phase are used as starting materials, and long-chain peptides are synthesized by a method in which amino acids are extended one by one.
  • a long chain peptide containing 100 or more amino acids can also be synthesized.
  • a large excess amount of reagent is required for the completion of each reaction.
  • it is not necessarily an efficient method, and at least not suitable for industrial mass production.
  • the reactivity is high and the amount of the reagent can be greatly reduced as compared with the solid phase method.
  • the liquid phase synthesis method it is necessary to prepare a fragment from which the C-terminal protecting group and the N-terminal protecting group are selectively removed, and selection of the protecting group for each fragment is often difficult.
  • benzyl groups that can be removed by a mild and simple method such as hydrogenation are often used for protecting hydroxyl groups and carboxy groups, but the C-terminal and side chain hydroxyl groups or side chain carboxy groups are protected with benzyl groups. And by hydrogenation, it is not possible to selectively deprotect only the C-terminus.
  • the C-terminal protecting group of the peptide fragment in the methods described in Non-Patent Documents 1 and 2, the C-terminal is protected with a 4-nitrobenzyl ester group and deprotected in 90% acetic acid in the presence of zinc powder. Yes.
  • the amount of the zinc powder is not a catalytic amount.
  • the amount of zinc powder used is 100 mg with respect to 273 mg of the peptide fragment to be deprotected at the C-terminus. Therefore, when the target peptide is industrially mass-produced, a large amount of zinc powder is required, and a large amount of acetic acid is also required after the reaction. It is not suitable for mass production.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the N-terminal protected with Boc (t-butoxycarbonyl group) is deprotected with TFA (trifluoroacetic acid).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the evaporation is followed by washing with n-hexane and vacuum drying using KOH pellets. It has been completely removed. In producing a long-chain peptide, the method of performing such an operation every time the Boc group is removed is not efficient.
  • an object of the present invention is to provide an efficient method for producing a long peptide suitable for industrial mass synthesis.
  • a method for producing a long chain peptide A compound represented by the following formula (II) is obtained by selectively deprotecting the N-terminus of the compound represented by the following formula (I) using sulfonic acids, and then a basic compound is added to the reaction solution.
  • Boc represents a t-butoxycarbonyl group which is an N-terminal protecting group
  • (AA 1 ) m represents a peptide chain in which a reactive side chain functional group is protected
  • m is 2 or more and 50 or less.
  • Step B for selectively deprotecting the C-terminus of the compound represented by the following formula (III) to obtain a compound represented by the following formula (IV): Boc- (AA 2 ) n -ONBn (III) Boc- (AA 2 ) n —OH (IV) [Wherein (AA 2 ) n represents a peptide chain in which the reactive side chain functional group is protected, n represents an integer of 2 to 50, and NBn represents nitrobenzyl represented by the following formula (V) A group (wherein p, q and r independently represent 0 or 1, and p + q + r represents 1, 2 or 3)] And the compound represented by the said Formula (IV) is added to the reaction liquid of the said process A, the compound represented by the said Formula (II), and the compound represented by the said Formula (IV) are condensed.
  • step B The method according to [1] above, wherein in step B, the C-terminus is selectively deprotected using a combination of a metal and an acid, or dithionites.
  • sulfonic acids are one or more sulfonic acids selected from the group consisting essentially of methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, and p-toluenesulfonic acid. the method of.
  • Pro 1 is ONBn, and the compound represented by the above formula (VI) obtained in the above step C is used as the compound represented by the above formula (III) in the above step B, and a plurality of the above steps A to C are used.
  • Pro 1 is NH 2 or ONBn, and the compound represented by the above formula (VI) obtained in the above step C is used as the compound represented by the above formula (I) in the above step A, The method according to any one of [1] to [6] above, wherein C is repeated a plurality of times.
  • F 13 Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
  • F 13 N-terminally and C-terminal protected with Boc is protected at NH 2 as a compound represented by the formula (I)
  • C-terminal N-terminus is protected with Boc is in ONBn the peptide fragment F 6 which is protected with the compound represented by the formula (III)
  • F 14 Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Alu-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ly
  • the N-terminal deprotected peptide fragment and the C-terminal deprotected peptide fragment can be condensed without any problem even if the deprotecting reagent remains. Therefore, the complicated operation of complete removal of the deprotecting reagent is unnecessary. Therefore, the method of the present invention is particularly suitable for industrial mass production of long peptides, and is extremely useful industrially.
  • Step A N-terminal deprotection step
  • the N-terminus of compound (I) is selectively deprotected using sulfonic acids to obtain compound (II), and then a basic compound is added to react. Neutralize the solution.
  • Boc- (AA 1 ) m -Pro 1 (I) H- (AA 1 ) m -Pro 1 (II) [In the formula, Boc represents a t-butoxycarbonyl group which is an N-terminal protecting group, (AA 1 ) m represents a peptide chain in which a reactive side chain functional group is protected, and m is 2 or more and 50 or less. Represents an integer, and Pro 1 represents a C-terminal protecting group]
  • (AA 1 ) m represents a peptide chain in which a reactive side chain functional group is protected, and has the following structural units.
  • AA 1 represents an amino acid residue, and a plurality of AA 1 may be the same as or different from each other. [Wherein R represents a side chain of an amino acid]
  • side chain functional groups having no reactivity such as Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Asn, Gln, Pro, and Phe side chain functional groups need to be protected.
  • the “reactive side chain functional group” refers to a highly reactive functional group contained in the amino acid side chain, specifically, a hydroxyl group, a thiol group, a carboxy group, an amino group, a guanidino group, and an imidazole group. Is mentioned.
  • the methylthio group of Met and the amide group of Asn and Gln are not included in the reactive side chain functional group in the present disclosure, but may be protected in order to completely suppress side reactions.
  • the thioether group (—S—) on the side chain of Met may be sulfoxidized, and the protecting group for the amide group includes xanthyl, bis-2,4-dimethoxybenzyl, 4,4′-dimethoxybenzen. A hydryl group etc. can be mentioned. Cys side chain thiol groups may also be oxidized.
  • the side chain thioether group of Met and the side chain amide group of Asn and Gln may be referred to as “semi-reactive side chain functional groups”.
  • protecting group for the reactive side chain functional group those which are not deprotected under acidic conditions with sulfonic acids for deprotecting the N-terminus are preferred.
  • examples of the protecting group for the side chain hydroxyl group include benzyl (Bzl), 4-methylbenzyl (4-MeBzl), 4-methoxybenzyl (4-MeOBzl), 2-bromobenzyloxycarbonyl (Br—). Z) and the like.
  • protecting group for the side chain thiol group include benzyl (Bzl), 4-methylbenzyl (4-MeBzl), 4-methoxybenzyl (4-MeOBzl), and t-butyl (tBu).
  • Examples of the protecting group for the side chain carboxy group include benzyloxy (OBzl) and cyclohexyloxy (O-cHex).
  • Examples of the protecting group for the side chain amino group include formyl, , 4,6-trimethylbenzene sulfonyl (Mts), benzyloxycarbonyl (Z), nitro (NO 2), p Toluenesulfonyl (Tos), benzyloxymethyl (BOM), 2,4-dinitrophenyl (Dnp), and the like of 2-chloro-benzyloxycarbonyl (Cl-Z).
  • the side chain protecting group of Ser and Thr is a Bn group
  • the side chain protecting group of Lys is a 2-Cl-Z group or Z group
  • the side chain protecting group of Trp is a formyl group
  • a side of Glu and Asp Bn group as the chain protecting group
  • Z group or NO 2 group as the side chain protecting group of Arg
  • BOM group as the side chain protecting group of His
  • Bn group Z group or 2 as the side chain protecting group of Tyr -Br-Z group.
  • a protecting group removable with an acid such as a Boc group can also be used.
  • m is not particularly limited, but m may be 100 or less, more preferably 50 or less, because the reaction may be difficult to proceed if the peptide fragment is excessively large. Further, m is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and still more preferably 4 or more.
  • Pro 1 represents a C-terminal protecting group.
  • Examples of the C-terminal protected with such a protecting group include methyl ester, ethyl ester, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 2-nitrobenzyl ester, 2,4-dinitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester.
  • ester protecting groups such as amides; amide protecting groups such as amide, dimethylamide, pyrrolidinylamide, piperidinylamide, o-nitroanilide and the like.
  • Step B When compound (VI) obtained in steps A to C is used as compound (III) in step B and steps A to C are newly repeated, Pro 1 is replaced with 4-nitrobenzyl alcohol, 2-nitrobenzyl.
  • One or more nitrobenzyl alcohol groups (ONBn) selected from the group consisting essentially of alcohol, 2,4-dinitrobenzyl alcohol, 4,6-dinitrobenzyl alcohol and 2,4,6-trinitrobenzyl alcohol .
  • Boc is used as the N-terminal protecting group of compound (I), and in this step, the N-terminal of compound (I) is deprotected using sulfonic acids.
  • Boc-protected N-terminal deprotection is generally performed with trifluoroacetic acid, but when trifluoroacetic acid is used, complete removal of trifluoroacetic acid is necessary to suppress side reactions. It becomes. Such an operation is not preferable from the viewpoint of production efficiency, and should be avoided particularly in industrial mass synthesis.
  • the de-Boc reaction is performed using sulfonic acids, it is not necessary to remove the sulfonic acids, and the reaction solution can be continuously used in the condensation step, leading to efficient production. .
  • sulfonic acids examples include methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid and / or p-toluenesulfonic acid. These may be used as a mixture.
  • the sulfonic acids are particularly preferable from the viewpoint that no significant by-product is generated even if they are subjected to the coupling reaction in the next step without isolating the compound (II) while remaining in the reaction solution.
  • the amount of the sulfonic acid used is not particularly limited and may be appropriately determined. For example, it can be 0.1 mol equivalent or more and 400 mol equivalent or less with respect to the compound (I). The amount is preferably 0.5 mol equivalent or more and 200 mol equivalent or less.
  • a solvent may be used for the purpose of improving the liquid properties of the reaction solution, promoting the reaction, or suppressing side reactions.
  • the solvent may be selected as appropriate and is not particularly limited.
  • water alcohol solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, and ethylene glycol; aliphatic hydrocarbon solvents such as hexane and heptane; dichloromethane, 1, Halogenated hydrocarbon solvents such as 2-dichloroethane, chloroform, chlorobenzene; ether solvents such as tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, tert-butyl methyl ether, cyclopentyl methyl ether; ethyl acetate, isopropyl acetate, Ester solvents such as methyl propionate; nitrile solvents such as acetonitrile, propionitrile, benzonitrile
  • halogenated hydrocarbon solvents Preferred are halogenated hydrocarbon solvents, ether solvents, amide solvents, aprotic polar solvents, more preferred are halogenated hydrocarbon solvents, ether solvents, amide solvents, and even more preferred are dichloromethane.
  • one or more solvents selected from the group consisting essentially of chlorobenzene, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, and dibutylformamide. These solvents may be used alone or in combination of two or more. When mixing, the mixing ratio is not particularly limited.
  • the amount of the solvent used may be appropriately determined. For example, it can be 1 mL or more and 300 mL or less, preferably 5 mL or more and 100 mL or less, with respect to 1 g of Compound (I).
  • each reagent is not particularly limited, and for example, sulfonic acids may be added to a mixture of compound (I) and a solvent.
  • the ratio of compound (I) to the whole reaction solution is preferably 0.2 W / V% or more and 50 W / V% or less, more preferably 1 W / V% or more and 20 W / V% or less.
  • the reaction temperature for deprotecting the N-terminus of compound (I) is not particularly limited, but is preferably not higher than the boiling point of the solvent used from the viewpoint of safety.
  • the reaction temperature is, for example, preferably ⁇ 40 ° C. or higher and 160 ° C. or lower, more preferably ⁇ 20 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, and still more preferably 0 ° C. or higher and 60 ° C. or lower.
  • the reaction time for deprotecting the N-terminus of compound (I) is not particularly limited, and may be determined by preliminary experiments or until the consumption of compound (I) is confirmed by HPLC or thin layer chromatography. For example, it can be 10 minutes or more and 24 hours or less.
  • the basic compound is not particularly limited, such as an inorganic base or an organic base, but an organic base is preferably used from the viewpoint of solubility in the reaction solution.
  • Examples of the basic compound include lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, cesium hydroxide and the like, alkali metal hydroxides; lithium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate and the like alkali metal carbonates.
  • Alkaline metal hydrogen carbonates such as lithium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate and potassium hydrogen carbonate; lithium methoxide, lithium ethoxide, lithium isopropoxide, lithium tert-butoxide, sodium methoxide, sodium ethoxide, sodium isopropoxy
  • Metal alkoxides such as sodium tert-butoxide, potassium methoxide, potassium ethoxide, potassium isopropoxide, potassium t-butoxide; metal hydrides such as sodium hydride, potassium hydride, calcium hydride;
  • Organic amine compounds such as limethylamine, triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylpyrrolidine, N-methylmorpholine, 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene, pyridine, quinoline, imidazole, etc. It is done. These may be used alone or in combination of two or more. Preferred is an organic amine compound,
  • the amount of basic compound used may be adjusted as appropriate. For example, what is necessary is just to make it the pH of the reaction liquid after adding a basic compound become 6.5 or more. The higher the pH, the better the subsequent condensation reaction can proceed, so the pH is preferably 6.5 or higher, more preferably 7.0 or higher. On the other hand, since epimerization in a condensation reaction can be suppressed as the pH is lower, the pH is preferably 10 or less, and more preferably 8.0 or less.
  • the addition form of the basic compound is not particularly limited, and for example, the basic compound may be added directly to the reaction solution in which the deprotection reaction at the N-terminus of compound (I) is completed, or the basic compound is dispersed in a solvent. Alternatively, the dispersion or solution may be added after dissolution.
  • the solvent in this case, the solvents exemplified in the description of the N-terminal deprotection reaction of compound (I) can be used, and the same solvent as that used in the deprotection reaction may be used, or different. A solvent may be used.
  • the temperature at which the basic compound is added is not particularly limited and may be appropriately determined. However, since reaction heat may be generated by neutralization, it is preferable to add the basic compound after cooling the reaction solution. For example, it is preferable to add the basic compound after cooling the reaction solution to ⁇ 10 ° C. or more and 20 ° C. or less. Moreover, it is preferable to stir the reaction liquid during and after the addition of the basic compound.
  • Step B C-terminal deprotection step
  • compound (IV) is obtained by selectively deprotecting the C-terminus of compound (III).
  • Boc- (AA 2 ) n -ONBn (III) Boc- (AA 2 ) n —OH (IV) [Wherein (AA 2 ) n represents a peptide chain in which the reactive side chain functional group is protected, n represents an integer of 2 to 50, and NBn represents nitrobenzyl represented by the following formula (V) A group (wherein p, q and r independently represent 0 or 1, and p + q + r represents 1, 2 or 3)]
  • N is preferably 100 or less, more preferably 50 or less, more preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and still more preferably 4 or more.
  • NBn is specifically selected from the group consisting essentially of 4-nitrobenzyl, 2-nitrobenzyl, 2,4-dinitrobenzyl, 4,6-dinitrobenzyl and 2,4,6-trinitrobenzyl.
  • One or more nitrobenzyl groups A benzylic protecting group that contains the C-terminus and can be easily removed by hydrogenation reaction is used to protect the hydroxyl group and carboxy group in the peptide.
  • a general benzylic protecting group is used for protecting the C-terminal, selective deprotection of the C-terminal may not be possible. Therefore, in the present invention, by selectively protecting the C-terminal with ONBn, the C-terminal can be selectively deprotected.
  • the compound The C-terminal NBn of (III) can be easily removed by a general hydrogenation reaction.
  • a general benzyl protecting group is included in the protecting group of the reactive side chain functional group, only the C-terminal NBn can be selectively removed under mild reducing conditions.
  • the nitro group on the benzene ring in NBn is easily reduced, only the nitro group of NBn can be reduced while maintaining a general benzylic protecting group.
  • NBn is removed by subsequent electron transfer, and only the C-terminal can be deprotected.
  • Conditions for reducing only the nitro group of NBn while maintaining a general benzylic protecting group may be appropriately selected.
  • dithionites which are mild reducing agents can be used. Specifically, dithionites are added to compound (III) together with a solvent, dithionites are added to a solution or dispersion of compound (III), or dithione is added to a solution or dispersion of compound (III). An acid solution or dispersion may be added. Examples of dithionites include sodium dithionite.
  • NBn can be selectively removed using a reduction reaction using a combination of a metal and an acid. Examples of the metal that can be used in the reduction reaction include Fe, Zn, and Sn, and examples of the acid include ammonium chloride, acetic acid, hydrochloric acid, and an acidic buffer.
  • the amount of dithionic acid used may be appropriately adjusted within a range in which the C-terminus of compound (III) can be selectively deprotected.
  • 1 to 30 mol equivalents of dithione relative to compound (III) Acids can be used.
  • the amount is preferably 20 mol equivalent or less, preferably 3 mol equivalent or more, and more preferably 5 mol equivalent or more.
  • “mol equivalent” refers to the number of moles of the target compound relative to 1 mol of the reference compound.
  • the solvent used in this step the solvent exemplified in the description of the N-terminal deprotection reaction of compound (I) can be used, and the same solvent as that used in the deprotection reaction may be used, Different solvents may be used.
  • an amide solvent or a mixed solvent of sulfoxide solvent and water is preferable, and one or more selected from the group consisting essentially of dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA), dibutylformamide and dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a mixed solvent of an organic solvent and water is more preferable.
  • the reaction temperature in this step is not particularly limited, but is preferably below the boiling point of the solvent used from the viewpoint of safety. In addition, it is preferable to set the temperature appropriately from the viewpoints of impurity generation suppression and reaction rate. As reaction temperature, 20 to 150 degreeC is preferable, for example, 30 to 100 degreeC is more preferable, 50 to 90 degreeC is still more preferable.
  • reaction time in this step is not particularly limited, and can be determined by preliminary experiments or until the consumption of compound (III) is confirmed by HPLC, thin layer chromatography, or the like. Can be less than or equal to hours.
  • reaction solution is cooled to room temperature, and a poor solvent is added to precipitate the compound (IV), which is collected by filtration, washed with the poor solvent, and then dried.
  • Step C Condensation Step
  • compound (IV) is added to the reaction solution of step A, and compound (II) and compound (IV) are condensed to obtain compound (VI).
  • the reaction solution of Step A may be added with the reaction solution of Step B or the purified or roughly purified compound (IV).
  • the purified or crude compound (IV) may be added to the reaction solution of Step A. It is preferable to add. That is, at least the process A and the process C are performed in the same system (one pot).
  • Boc- (AA 2 ) n- (AA 1 ) m -Pro 1 (VI) [Wherein Boc, (AA 2 ) n , n, (AA 1 ) m , m, and Pro 1 have the same meanings as described above]
  • the amount of compound (II) and compound (IV) used in this step may be adjusted as appropriate. For example, it can be 0.4 mol equivalent or more and 5 mol equivalent or less with respect to compound (II), preferably 0.8 mol equivalent or more and 2 mol equivalent or less, more preferably 0.9 mol equivalent or more and 1.5 mol equivalent or less. .
  • the method for condensing compound (II) and compound (IV) in this step is not particularly limited.
  • a carbodiimide compound or a dehydrating condensing agent may be used in the presence of an activating additive such as a hydroxyamine compound.
  • hydroxyamine compound examples include 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzo Triazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (NHS), ethyl 2-oxime-cyanoglyoxylate (Oxyma), 1-hydroxy-6-chloro-benzotriazole (6-Cl-HOBt), N-hydroxyphthalimide, N- Examples include hydroxypiperidine.
  • 1-hydroxybenzotriazole HABt
  • 1-hydroxy-7-azabenzotriazole HAAt
  • 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine More preferred is 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine (HOOBt).
  • a hydroxyamine compound may be adjusted suitably, it can be 0.1 mol equivalent or more and 10 mol equivalent or less with respect to compound (III), for example, 0.5 mol equivalent or more and 5 mol equivalent or less are preferable.
  • carbodiimide compound examples include dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • EDC 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • EDC 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • dehydrating condensing agent examples include 1H-benzotriazol-1-yloxy-tris-dimethylaminophosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1H-benzotriazol-1-yloxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), O -[(Ethoxycarbonyl) cyano Tylenamino] -N
  • O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate HBTU
  • O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate TBTU
  • (1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy) dimethylamino-morpholino-carbenium hexafluorophosphate (COMU)
  • the amount of the carbodiimide compound and the dehydrating condensing agent may be appropriately adjusted and is not particularly limited. For example, it can be 0.1 mol equivalent or more and 10 mol equivalent or less with respect to compound (III), 0.5 mol equivalent or more, 5 mol equivalent or less is preferable.
  • a solvent may be used, and the same solvents as those exemplified in the description of the step A can be used as the solvent.
  • an amide solvent is contained in the solvent for the purpose of accelerating the reaction by dissolving the raw material.
  • Dimethylformamide, dimethylacetamide, and dibutylformamide It is preferable that one or more amide solvents selected from the group consisting of: In order to use a solvent containing an amide solvent in this step, this step may be carried out continuously when an amide solvent is used as at least part of the solvent in the above step A and step B.
  • the amide solvent may be added in this step.
  • the ratio of the amide solvent in the total solvent in this step is preferably 2 v / v% or more, more preferably 30 v / v% or more, 70 v / v% or more is still more preferable. This ratio refers to the ratio of the amide solvent before mixing to the total volume of each solvent before mixing.
  • the reaction temperature and reaction time in this step are not particularly limited and may be adjusted as appropriate.
  • the reaction temperature can be set to the boiling point of the reaction solvent to be used or less, preferably 50 ° C. or less from the viewpoint of suppressing side reactions. It is also possible to carry out the reaction at room temperature.
  • the lower limit of the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably ⁇ 10 ° C. or higher from the viewpoint of favorably progressing the reaction.
  • the reaction time is not particularly limited and may be determined by preliminary experiments or until consumption of compound (II) or compound (IV) is confirmed by HPLC or thin layer chromatography. 48 hours or less.
  • the organic phase may be dried over anhydrous sodium sulfate or anhydrous magnesium sulfate and concentrated after washing the reaction solution with water, saturated brine, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, aqueous sodium carbonate solution or the like. Further, the compound (VI) may be purified by column chromatography or crystallization operation.
  • the compound (VI) obtained in this step may be used as the compound (III) in the above step B to repeat the above steps A to C to extend the peptide chain.
  • ONBn is used as the C-terminal protecting group Pro 1 of compound (VI) in the same manner as compound (III).
  • the compound (VI) obtained in this step may be used as the compound (I) in the above step A to repeat the above steps A to C to extend the peptide chain.
  • the C-terminal protecting group Pro 1 of the compound (VI) may be appropriately selected.
  • Pro 1 when exenatide described later is produced, since the C-terminal of exenatide itself is —CONH 2 , exenatide can be produced efficiently if Pro 1 is NH 2 .
  • Pro 1 may be ONBn.
  • Step D Deprotection Step
  • the target peptide is obtained by deprotecting at least the reactive side chain functional group of compound (VI).
  • AA 2 and AA 1 of the compound (VI) do not have a reactive side chain functional group or have a semi-reactive side chain functional group but are not protected, it is necessary to perform this step. No. Moreover, you may deprotect at least one of N terminal and C terminal as needed. Known conditions may be adopted as deprotection conditions for each protecting group.
  • the target peptide may be purified by column chromatography after concentrating the reaction solution.
  • a useful long chain peptide can be efficiently produced.
  • the method of the present invention is widely used as a type 2 diabetes drug around the world. It can be applied to the production of exenatide, which is an agonist.
  • Exenatide is His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu -It has the amino acid sequence of Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (HGEGFTSDDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPPS) and the C-terminal carboxy group is amidated .
  • a peptide fragment obtained by cleaving a long-chain peptide at an appropriate position so that epimerization does not easily occur is designed, and each peptide fragment is produced by the method of the present invention or the conventional method.
  • Each peptide fragment may be condensed by the method of the present invention. In that case, among the adjacent peptide fragments, the peptide fragment on the C-terminal side is used as compound (I), and the peptide fragment on the N-terminal side is used as compound (III).
  • N-terminal and / or C-terminal selective deprotection conditions that is, removal conditions for Boc and / or NBn, as a protective group for the reactive side chain functional group Select those that will not be removed.
  • peptide fragments F 1 to F 8 fragments 1 to 8 having the following amino acid sequences from the C terminus toward the N terminus are designed, and each peptide fragment is designated by the method of the present invention. Condensate with.
  • F 1 Ala-Pro-Pro-Pro-Ser F 2 : Gly-Pro-Ser-Ser-Gly F 3 : Asn-Gly F 4 : Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys F 5 : Glu-Ala-Val-Arg-Leu F 6 : Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu F 7 : Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu F 8 : His-Gly-Glu-Gly
  • the C-terminal of peptide fragment F 1 corresponding to the C-terminal part of exenatide is protected by NH 2 because the C-terminal of exenatide is amidated and the amide group is relatively stable. Is preferred. Since the other peptide fragments F 2 to F 7 are condensed with the peptide fragment on the C-terminal side at any stage, ONBn should be used as the C-terminal protecting group of the peptide fragments F 2 to F 8. Is preferred.
  • peptide fragment F 1 is used as compound (I) and peptide fragment F 2 is condensed as compound (III) to obtain peptide fragment F 9 having the following amino acid sequence
  • F 9 Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser Peptide fragment F 3 was used as compound (I) and peptide fragment F 4 was used as compound (III) for condensation to obtain peptide fragment F 10 having the following amino acid sequence
  • F 10 Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
  • peptide fragments F 7 as the compound (I)
  • condensed with a peptide fragment F 8 as compound (III)
  • F 11 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu Peptide fragment F 10 was used as compound (I) and peptide fragment F 5 was used as compound (III)
  • reaction solution was added ethyl acetate (8 mL) and water (8 mL) to carry out a liquid separation and extraction to obtain Boc-Gly-Pro-Ser ( Bzl) -Ser (Bzl) -Gly-OH as a fragment F 2 .
  • Boc-Phe-Ile-Glu (OBzl) -Trp (CHO) -Leu-Lys (Cl-Z) -Asn-Gly-O (4-NBn)
  • Boc-Asn-Gly-O (4- NBn) (3.5 g, 8.3 mmol) was added with dichloromethane (160 mL) and methanesulfonic acid (5.4 g, 56 mmol) and stirred for 3 hours.
  • the reaction solution was ice-cooled, triethylamine (5.8 g, 57 mmol) was added, and the N-terminal was deprotected by stirring for 5 minutes.
  • Boc-His (BOM) -Gly-Glu (OBzl) -Gly-Thr (Bzl) -Phe-Thr (Bzl) -Ser (Bzl) -Asp (OBzl) -Leu-O (4-NBn) Preparation Boc-Thr (Bzl) -Phe-Thr (Bzl) -Ser (Bzl) -Asp (OBzl) -Leu-O (4-NBn) (6.3 g, 4.9 mmol) in dichloromethane (11 g) and methanesulfone Acid (2.4 g, 25 mmol) was added and stirred for 2 hours.
  • the precipitated solid was collected by filtration and washed with water and ethyl acetate to obtain Boc-Glu (OBzl) -Ala-Val-Arg (Z) 2 -Leu-OH as a fragment F 5 (7.5 g, 7.2 mmol, purity: 96.5%).
  • Example 5 Production of fragment F 13 from fragment F 9 and fragment F 12 (1) Boc-Glu (OBzl) -Ala-Val-Arg (Z) 2 -Leu-Phe-Ile-Glu (OBzl) -Trp Production of (CHO) -Leu-Lys (Cl-Z) -Asn-Gly-OH Boc-Glu (OBzl) -Ala-Val-Arg (Z) 2 -Leu-Phe-Ile obtained in Example 4 above Add DMA (90 g) to -Glu (OBzl) -Trp (CHO) -Leu-Lys (Cl-Z) -Asn-Gly-O (4-NBn) (15 g, 6.1 mmol) and add to 55 ° C Warm up.
  • Example 6 Production of fragment F 14 from fragment F 13 and fragment F 6 (1) Boc-Ser (Bzl) -Lys (Cl-Z) -Gln-Met (O) -Glu (OBzl) -Glu (OBzl) ) -OH Preparation Boc-Ser (Bzl) -Lys (Cl-Z) -Gln-Met (O) -Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -O (4-NBn) (1.0 g, 0.69 mmol) ) Were added DMA (6.0 g), water (0.6 g) and Na 2 S 2 O 4 (1.2 g, 6.9 mmol) and stirred at 90 ° C. for 4 hours.
  • DMA 6.0 g
  • water 0.6 g
  • Na 2 S 2 O 4 1.2 g, 6.9 mmol
  • EDC hydrochloride (0.36 g, 1.9 mmol) was added 4 times every 30 minutes and stirred for 1 hour, and then Boc-Ser (Bzl) -Lys (Cl-Z) -Gln-Met (O).
  • -Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -OH 2.0 g, 1.5 mmol
  • Triethylamine (0.19 g, 1.9 mmol
  • EDC hydrochloride (0.36 g, 1.9 mmol) were added again and stirred for 13 hours.
  • Example 7 Preparation of fragment F 15 from fragment F 14 and fragment F 11 (1) Boc-His (BOM) -Gly-Glu (OBzl) -Gly-Thr (Bzl) -Phe-Thr (Bzl) -Ser Production of (Bzl) -Asp (OBzl) -Leu-OH Boc-His (BOM) -Gly-Glu (OBzl) -Gly-Thr (Bzl) -Phe-Thr (Bzl)-obtained in Example 3 above DMSO (81 g) was added to Ser (Bzl) -Asp (OBzl) -Leu-O (4-NBn) (11 mmol), and the temperature was raised to 45 ° C.
  • EDC hydrochloride (1.2 g, 6.4 mmol) was added and stirred for 4 hours. Furthermore, Boc-His (BOM) -Gly-Glu (OBzl) -Gly-Thr (Bzl) -Phe-Thr (Bzl) -Ser (Bzl) -Asp (OBzl) -Leu-OH (0.56 g, 0.32 mmol) ) was added and stirred for 3 hours, followed by concentration of the reaction solution under reduced pressure.
  • Example 8 Preparation of exenatide Boc-His (BOM) -Gly-Glu (OBzl) -Gly-Thr (Bzl) -Phe-Thr (Bzl) -Ser (Bzl) -Asp obtained in Example 7 above OBzl) -Leu-Ser (Bzl) -Lys (Cl-Z) -Gln-Met (O) -Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ala-Val-Arg (Z) 2 -Leu -Phe-Ile-Glu (OBzl) -Trp (CHO) -Leu-Lys (Cl-Z) -Asn-Gly-Gly-Pro-Ser (Bzl) -Ser (Bzl) -Gly-Ala-Pro-Pro- To Pro-Ser (Bzl) -NH 2 (1.0 g, 0.2 mmol) was added dich

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Abstract

本発明は、工業的な大量合成にも適する長鎖ペプチドの効率的な製造方法を提供することを目的とする。本発明に係る長鎖ペプチドの製造方法は、Ｎ末端がＢｏｃ基で保護された原料ペプチド断片のＮ末端をスルホン酸で脱保護し、また、Ｃ末端がＯＮＢｎ基で保護された原料ペプチド断片のＣ末端を選択的に脱保護し、得られたＮ末端脱保護ペプチド断片とＣ末端脱保護ペプチド断片を液相法で縮合することを特徴とする。

Description

長鎖ペプチドの製造方法
　本発明は、長鎖ペプチドの効率的な製造方法に関するものである。
　長鎖ペプチド構造は、近年注目を集めているペプチド医薬品の主要な構造である。今後も成長が期待される分野であることから、その効率的な製造方法は市場から渇望されているものであるが、真に効率的な方法は存在しない。例えば、代表的なペプチド製造方法として、固相合成法がある。固相合成法では、固相に担持されたアミノ酸が出発原料として使われ、アミノ酸を一つずつ伸張していく方法によって長鎖ペプチドが合成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　固相合成法によれば、アミノ酸を１００個以上含むような長鎖ペプチドも合成可能である。しかし固相上で全ての反応を行なうため、各反応の終結に大過剰量の試剤を必要とするなど、必ずしも効率的な方法とはいえず、少なくとも工業的な大量生産には向いていない。
　それに対して、全ての反応を液相で行う液相合成法によれば、反応性は高く試剤量も固相法と比較して大幅に削減できる。但し、液相合成法によるフラグメントカップリング時には、Ｃ末端保護基とＮ末端保護基をそれぞれ選択的に除去したフラグメントを調製する必要があり、各フラグメントの保護基の選択にはしばしば困難が伴う。例えば、水酸基やカルボキシ基の保護には、水添という穏和で且つ簡便な方法で除去できるベンジル基がよく使われるが、Ｃ末端と側鎖水酸基や側鎖カルボキシ基をベンジル基で保護してしまうと、水添によってはＣ末端のみを選択的に脱保護することができない。
　ペプチド断片のＣ末端保護基としては、非特許文献１，２に記載の方法では、Ｃ末端を４－ニトロベンジルエステル基で保護し、９０％酢酸中、亜鉛粉末の存在下で脱保護している。しかしこの亜鉛粉末の量は触媒量ではなく、例えばＣ末端を脱保護すべきペプチド断片２７３ｍｇに対して、亜鉛粉末の使用量は１００ｍｇである。よって、目的のペプチドを工業的に大量生産する場合には、大量の亜鉛粉末が必要であり、また、反応後における大量の酢酸の処理も必要となるため、この方法は環境負荷が高く工業的な大量生産に適するとはいえない。
　また、非特許文献１，２に記載の方法では、Ｂｏｃ（ｔ－ブトキシカルボニル基）で保護されたＮ末端をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で脱保護している。しかしこのＴＦＡは、次のＮ末端脱保護ペプチド断片とＣ末端脱保護ペプチド断片との縮合反応において副反応を起こすため、エバポレーションの後、ｎ－ヘキサンによる洗浄とＫＯＨペレットを用いた真空乾燥により完全に除去されている。長鎖ペプチドを製造するに当たり、Ｂｏｃ基を除去する毎にかかる操作をする方法は、効率的とは言い難い。
ＴＡＫＡＳＨＩ　ＡＢＩＫＯら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２８（１２），ｐｐ．３５４２－３５４８（１９８０） ＴＡＫＡＳＨＩ　ＡＢＩＫＯら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２９（５），ｐｐ．１３９０－１３９７（１９８１）
　上述したように、長鎖ペプチドの液相合成法は固相合成法に比べて工業的な大量合成に適しているといえるが、保護基の選択にはしばしば困難が伴い、また、Ｎ末端の脱保護ごとに脱保護用試薬を完全に除去する必要のある場合があった。
　そこで本発明は、工業的な大量合成にも適する長鎖ペプチドの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、長鎖ペプチドの液相合成法において、Ｂｏｃで保護されたペプチド断片のＮ末端をスルホン酸類で脱保護し、且つペプチド断片のＣ末端をＯＮＢｎで保護しておけば、少なくともＮ末端の脱保護からＣ末端脱保護ペプチド断片との縮合反応を同一系内（ワンポット）で行うことができ、且つ反応性側鎖官能基の保護基の選択が容易になることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　長鎖ペプチドを製造するための方法であって、
　スルホン酸類を用いて下記式（Ｉ）で表される化合物のＮ末端を選択的に脱保護して下記式（ＩＩ）で表される化合物を得た後、塩基性化合物を添加して反応液を中和する工程Ａ、
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（Ｉ）
　　Ｈ－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（ＩＩ）
［式中、ＢｏｃはＮ末端の保護基であるｔ－ブトキシカルボニル基を示し、（ＡＡ1）mは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、ｍは２以上５０以下の整数を示し、Ｐｒｏ1はＣ末端の保護基を示す］
　下記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＣ末端を選択的に脱保護して下記式（ＩＶ）で表される化合物を得る工程Ｂ、
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－ＯＮＢｎ　　・・・　　（ＩＩＩ）
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－ＯＨ　　・・・　　（ＩＶ）
［式中、（ＡＡ2）nは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、ｎは２以上５０以下の整数を示し、ＮＢｎは下記式（Ｖ）で表されるニトロベンジル基（式中、ｐ、ｑおよびｒは独立して０または１を示し、ｐ＋ｑ＋ｒは１、２または３を示す）を示す］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　および、上記工程Ａの反応液に、上記式（ＩＶ）で表される化合物を添加し、上記式（ＩＩ）で表される化合物と上記式（ＩＶ）で表される化合物とを縮合して下記式（ＶＩ）で表される化合物を得る工程Ｃを含むことを特徴とする方法。
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（ＶＩ）
［式中、Ｂｏｃ、（ＡＡ2）n、ｎ、（ＡＡ1）m、ｍ、およびＰｒｏ1は、上記と同義を示す］
　［２］　上記工程Ｂにおいて、金属と酸との組み合わせ、または亜ジチオン酸類を用いてＣ末端を選択的に脱保護する上記［１］に記載の方法。
　［３］　上記スルホン酸類として、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸から必須的になる群より選択される１以上のスルホン酸を用いる上記［１］または［２］に記載の方法。
　［４］　上記塩基性化合物として有機アミン化合物を用いる上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
　［５］　上記有機アミン化合物として、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンの少なくとも一方を用いる上記［４］に記載の方法。
　［６］　Ｐｒｏ1がＯＮＢｎであり上記工程Ｃで得られる上記式（ＶＩ）で表される化合物を上記工程Ｂにおける上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用い、上記工程Ａ～Ｃを複数回繰り返す上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
　［７］　Ｐｒｏ1がＮＨ2またはＯＮＢｎであり上記工程Ｃで得られる上記式（ＶＩ）で表される化合物を上記工程Ａにおける上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、上記工程Ａ～Ｃを複数回繰り返す上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
　［８］　更に、少なくとも上記式（ＶＩ）で表される化合物の反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
　［９］　上記工程Ｃで溶媒を用い、当該溶媒としてアミド系溶媒を用いる上記［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
　［１０］　上記アミド系溶媒として、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上のアミド系溶媒を用いる上記［９］に記載の方法。
　［１１］　上記長鎖ペプチドがエキセナチドである上記［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
　［１２］　下記アミノ酸配列を有するペプチド断片を用い、
　Ｆ1：　Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　Ｆ2：　Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ
　Ｆ3：　Ａｓｎ－Ｇｌｙ
　Ｆ4：　Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ
　Ｆ5：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ
　Ｆ6：　Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ
　Ｆ7：　Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ
　Ｆ8：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ
　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＰｒｏ1で保護されている上記ペプチド断片Ｆs（ｓは１以上、７以下のいずれかの整数を示す）を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、且つ、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆs+1を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用い、上記ペプチド断片Ｆsと上記ペプチド断片Ｆs+1とを縮合する上記［８］に記載の方法。
　［１３］　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ1を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ2を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ9を製造する工程、
　Ｆ9：　Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ3を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ4を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ10を製造する工程、
　Ｆ10：　Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ
　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ7を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ8を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ11を製造する工程、
　Ｆ11：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ
　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ10を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ5を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ12を製造する工程、
　Ｆ12：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ
　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ9を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ12を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ13を製造する工程、
　Ｆ13：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ13を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ6を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ14を製造する工程、
　Ｆ14：　Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ14を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ11を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ15を製造する工程、
　Ｆ15：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　および、上記ペプチド断片Ｆ15のＮ末端および反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む上記［１２］に記載の方法。
　本発明に係る長鎖ペプチドの製造方法は、全ての反応が液相中で行なわれるため、従来の固相合成法を使用したものと比較して劇的に使用試剤量を削減でき、長鎖ペプチドを効率よく製造することができる。また、従来の液相法で課題となる適切なＣ末端保護基の選定に関して、特異的な条件で除去可能なＣ末端保護基を採用したことにより、反応性側鎖官能基の保護基の選択が容易である。更に、Ｎ末端保護基の脱保護用試薬として特定のものを用いることにより、脱保護用試薬が残留していてもＮ末端脱保護ペプチド断片とＣ末端脱保護ペプチド断片との縮合を問題無く行うことができるため、脱保護用試薬の完全除去という煩雑な操作が不要である。よって本発明方法は、特に長鎖ペプチドの工業的な大量生産にも適しており、産業上極めて有用である。
　以下、本発明方法を工程ごとに詳細に述べる。なお、以下では、「式（Ｘ）で表される化合物」を「化合物（Ｘ）」と略記する。
　工程Ａ：　Ｎ末端の脱保護工程
　本工程では、スルホン酸類を用いて化合物（Ｉ）のＮ末端を選択的に脱保護して化合物（ＩＩ）を得た後、塩基性化合物を添加して反応液を中和する。
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（Ｉ）
　　Ｈ－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（ＩＩ）
［式中、ＢｏｃはＮ末端の保護基であるｔ－ブトキシカルボニル基を示し、（ＡＡ1）mは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、ｍは２以上５０以下の整数を示し、Ｐｒｏ1はＣ末端の保護基を示す］
　（ＡＡ1）mは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を表し、以下の構造単位を有する。なお、ＡＡ1はアミノ酸残基を示し、複数のＡＡ1は互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、Ｒはアミノ酸の側鎖を示す］
　勿論、（ＡＡ1）m中、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの側鎖官能基など、反応性を有さない側鎖官能基は保護の必要は無い。ここで「反応性側鎖官能基」とは、アミノ酸側鎖に含まれる反応性の高い官能基をいい、具体的には、水酸基、チオール基、カルボキシ基、アミノ基、グアニジノ基、およびイミダゾール基が挙げられる。また、Ｍｅｔのメチルチオ基や、ＡｓｎおよびＧｌｎのアミド基は、本開示においては反応性側鎖官能基には含めないが、副反応を完全に抑制するために保護してもよい。具体的には、Ｍｅｔの側鎖のチオエーテル基（－Ｓ－）はスルホキシド化してもよく、アミド基の保護基としては、キサンチル、ビス－２，４－ジメトキシベンジル、４，４'－ジメトキシベンズヒドリル基などを挙げることができる。また、Ｃｙｓの側鎖チオール基も酸化してもよい。本開示においては、Ｍｅｔの側鎖チオエーテル基と、ＡｓｎおよびＧｌｎの側鎖アミド基を「準反応性側鎖官能基」という場合がある。
　反応性側鎖官能基の保護基としては、Ｎ末端を脱保護するためのスルホン酸類による酸性条件で脱保護されないものが好ましい。以下、特に制限されないが、側鎖水酸基の保護基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、４－メチルベンジル（４－ＭｅＢｚｌ）、４－メトキシベンジル（４－ＭｅＯＢｚｌ）、２－ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ－Ｚ）などを挙げることができ、側鎖チオール基の保護基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、４－メチルベンジル（４－ＭｅＢｚｌ）、４－メトキシベンジル（４－ＭｅＯＢｚｌ）、ｔ－ブチル（ｔＢｕ）などを挙げることができ、側鎖カルボキシ基の保護基としては、ベンジルオキシ（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルオキシ（Ｏ－ｃＨｅｘ）などを挙げることができ、側鎖アミノ基の保護基としては、ホルミル、２，４，６－トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｓ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ニトロ（ＮＯ2）、ｐ－トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、２，４－ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）、２－クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ－Ｚ）などを挙げることができる。
　好ましくは、ＳｅｒとＴｈｒの側鎖保護基としてはＢｎ基、Ｌｙｓの側鎖保護基としては２－Ｃｌ－Ｚ基またはＺ基、Ｔｒｐの側鎖保護基としてはホルミル基、ＧｌｕとＡｓｐの側鎖保護基としてはＢｎ基、Ａｒｇの側鎖保護基としてはＺ基またはＮＯ2基、Ｈｉｓの側鎖保護基としてはＢＯＭ基、Ｔｙｒの側鎖保護基としては、Ｂｎ基、Ｚ基または２－Ｂｒ－Ｚ基である。Ｎ末端アミノ酸の側鎖保護基としては、Ｂｏｃ基など酸で除去可能な保護基を使用することもできる。
　ｍの上限は特に制限されないが、ペプチド断片が過剰に大きいと反応が進み難くなるおそれがあり得るため、ｍとしては１００以下が好ましく、５０以下がより好ましい。また、ｍとしては２以上が好ましく、３以上がより好ましく、４以上がより更に好ましい。
　Ｐｒｏ1はＣ末端の保護基を表す。Ｃ末端の保護基としては、Ｔｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，　Ｐｅｔｅｒ　Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著　Ｐｒｏｔｅｃｔｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、ＷＩＬＥＹ－ＩＮＴＥＲＳＣＩＥＮＣＥ社出版）５３３～６４６頁に記載の保護基中、Ｎ末端を脱保護するためのスルホン酸類による酸性条件で脱保護されないものが好ましい。そのような保護基で保護されたＣ末端としては、例えば、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、４－ニトロベンジルエステル、２－ニトロベンジルエステル、２，４－ジニトロベンジルエステル、４－メトキシベンジルエステルなどのエステル系保護基；アミド、ジメチルアミド、ピロリジニルアミド、ピペリジニルアミド、ｏ－ニトロアニリドなどのアミド系保護基などを挙げることができる。
　なお、工程Ａ～Ｃにより得られた化合物（ＶＩ）を工程Ｂの化合物（ＩＩＩ）として用い、新たに工程Ａ～Ｃを繰り返す場合には、Ｐｒｏ1を４－ニトロベンジルアルコール、２－ニトロベンジルアルコール、２，４－ジニトロベンジルアルコール、４，６－ジニトロベンジルアルコールおよび２，４，６－トリニトロベンジルアルコールから必須的になる群より選択される１以上のニトロベンジルアルコール基（ＯＮＢｎ）とする。
　化合物（Ｉ）のＮ末端の保護基としてはＢｏｃを用い、本工程ではスルホン酸類を用いて化合物（Ｉ）のＮ末端を脱保護する。Ｂｏｃで保護されたＮ末端の脱保護は、トリフルオロ酢酸により行うことが一般的であるが、トリフルオロ酢酸を使用した場合には副反応を抑制する目的でトリフルオロ酢酸の完全な除去が必要となる。かかる操作は、製造の効率性の観点から好ましいものではなく、特に工業的な大量合成では避けるべきである。それに対して、スルホン酸類を用いて脱Ｂｏｃ化反応を行う場合には、スルホン酸類を除去する必要が無く、反応液を続けて縮合工程に供することができ、効率的な製造に繋げることができる。
　使用するスルホン酸類としては、例えば、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸および／またはｐ－トルエンスルホン酸を挙げることができる。これらは混合物として用いてもよい。スルホン酸類は、反応液に残留したまま化合物（ＩＩ）を単離することなく次工程のカップリング反応に供しても、顕著な副生物を発生しないという観点から特に好ましい。
　スルホン酸類の使用量は特に制限されず適宜決定すればよいが、例えば、化合物（Ｉ）に対して０．１ｍｏｌ当量以上、４００ｍｏｌ当量以下とすることができる。当該量としては、０．５ｍｏｌ当量以上、２００ｍｏｌ当量以下が好ましい。
　本工程では、反応液の液性状を改善したり、反応を促進したり、副反応を抑制する目的で、溶媒を用いてもよい。溶媒は適宜選択すればよく特に制限されないが、例えば、水；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、エチレングリコール等のアルコール系溶媒；ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素系溶媒；テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル、プロピオン酸メチル等のエステル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、アセトフェノン等のケトン系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジエチルホルムアミド、ジプロピルホルムアミド、ジブチルホルムアミド等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド、Ｎ－メチルピロリドン、１，３－ジメチルプロピレンウレア等の非プロトン性極性溶媒が挙げられる。好ましくはハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、非プロトン性極性溶媒であり、より好ましくはハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒であり、より更に好ましくはジクロロメタン、クロロベンゼン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上の溶媒である。これらの溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。混合する場合、その混合比は特に制限はない。
　溶媒の使用量は適宜決定すればよいが、例えば、１ｇの化合物（Ｉ）に対して１ｍＬ以上、３００ｍＬ以下とすることができ、好ましくは５ｍＬ以上、１００ｍＬ以下である。
　各試剤の添加順序には特に制限はなく、例えば、化合物（Ｉ）と溶媒の混合物にスルホン酸類を添加すればよい。反応液全体に対する化合物（Ｉ）の割合は０．２Ｗ／Ｖ％以上、５０Ｗ／Ｖ％以下が好ましく、１Ｗ／Ｖ％以上、２０Ｗ／Ｖ％以下がより好ましい。
　化合物（Ｉ）のＮ末端の脱保護のための反応温度は特に制限されないが、安全性の観点から使用する溶媒の沸点以下が望ましい。反応温度としては、例えば－４０℃以上、１６０℃以下が好ましく、－２０℃以上、１００℃以下がより好ましく、０℃以上、６０℃以下がより更に好ましい。
　化合物（Ｉ）のＮ末端の脱保護のための反応時間も特に制限されず、予備実験により決定したり、ＨＰＬＣや薄層クロマトグラフィなどで化合物（Ｉ）の消費が確認されるまでとすることもできるが、例えば、１０分以上、２４時間以下とすることができる。
　本工程では、化合物（Ｉ）のＮ末端を脱保護した後、塩基性化合物を添加して反応液を中和する。
　塩基性化合物は、無機塩基や有機塩基など特に制限されないが、反応液に対する溶解性の観点から有機塩基を好適に用いる。塩基性化合物としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等、アルカリ金属の水酸化物；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム等、アルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等、アルカリ金属の炭酸水素塩；リチウムメトキシド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムイソプロポキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムイソプロポキシド、カリウムｔ－ブトキシド等の金属アルコキシド；水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルモルホリン、１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エン、ピリジン、キノリン、イミダゾール等の有機アミン化合物が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましくは、有機アミン化合物であり、より好ましくはトリエチルアミンおよび／またはジイソプロピルエチルアミンである。
　塩基性化合物の使用量は、適宜調整すればよい。例えば、塩基性化合物を添加した後の反応液のｐＨが、６．５以上になるようにすればよい。当該ｐＨが高いほど、後の縮合反応を良好に進行せしめることができることから、当該ｐＨとしては６．５以上が好ましく、７．０以上がより好ましい。一方、ｐＨが低いほど縮合反応でのエピメリ化を抑制できることから、当該ｐＨとしては１０以下が好ましく、８．０以下がより好ましい。
　塩基性化合物の添加形態は特に制限されず、例えば、化合物（Ｉ）のＮ末端の脱保護反応が完了した反応液へ塩基性化合物を直接添加してもよいし、塩基性化合物を溶媒に分散または溶解した上で、分散液または溶液を添加してもよい。この場合の溶媒としては、化合物（Ｉ）のＮ末端の脱保護反応の説明で例示した溶媒を用いることができ、当該脱保護反応で用いた溶媒と同一の溶媒を用いてもよいし、異なる溶媒を用いてもよい。
　塩基性化合物を添加する際の温度は特に制限されず適宜決定すればよいが、中和により反応熱が生じることがあるので、反応液を冷却してから塩基性化合物を添加することが好ましい。例えば、反応液を－１０℃以上、２０℃以下に冷却してから塩基性化合物を添加することが好ましい。また、塩基性化合物の添加中および添加後を通じて、反応液を攪拌することが好ましい。
　工程Ｂ：　Ｃ末端の脱保護工程
　本工程では、化合物（ＩＩＩ）のＣ末端を選択的に脱保護して化合物（ＩＶ）を得る。なお、本工程は、上記工程Ａとは別途行うことが好ましい。
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－ＯＮＢｎ　　・・・　　（ＩＩＩ）
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－ＯＨ　　・・・　　（ＩＶ）
［式中、（ＡＡ2）nは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、ｎは２以上５０以下の整数を示し、ＮＢｎは下記式（Ｖ）で表されるニトロベンジル基（式中、ｐ、ｑおよびｒは独立して０または１を示し、ｐ＋ｑ＋ｒは１、２または３を示す）を示す］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）中の（ＡＡ2）nは、（ＡＡ1）mと同一のものである必要はないが、上記工程Ａでの（ＡＡ1）mの説明がそのまま適用されるものであり、ｎとしては１００以下が好ましく、５０以下がより好ましく、また、２以上が好ましく、３以上がより好ましく、４以上がより更に好ましい。
　ＮＢｎは、具体的には、４－ニトロベンジル、２－ニトロベンジル、２，４－ジニトロベンジル、４，６－ジニトロベンジルおよび２，４，６－トリニトロベンジルから必須的になる群より選択される１以上のニトロベンジル基である。Ｃ末端を含み、ペプチド中の水酸基やカルボキシ基の保護には、水添反応により容易に除去できるベンジル系保護基が用いられる。しかしＣ末端の保護に一般的なベンジル系保護基を用いると、Ｃ末端の選択的な脱保護ができない場合がある。そこで本発明では、Ｃ末端をＯＮＢｎで保護することで、Ｃ末端の選択的な脱保護が可能になる。
　具体的には、（ＡＡ2）n中に反応性側鎖官能基が存在しない場合や、反応性側鎖官能基がベンジル系保護基以外の保護基のみで保護されている場合には、化合物（ＩＩＩ）のＣ末端のＮＢｎは一般的な水添反応で容易に除去することができる。また、反応性側鎖官能基の保護基に一般的なベンジル系保護基が含まれている場合には、穏和な還元条件でＣ末端のＮＢｎのみを選択的に除去できる。詳しくは、ＮＢｎ中のベンゼン環上ニトロ基は容易に還元されるため、一般的なベンジル系保護基を維持したままＮＢｎのニトロ基のみを還元することができる。ＮＢｎ中のニトロ基が還元されると、続く電子移動によりＮＢｎが除去され、Ｃ末端のみの脱保護が可能になる。
　一般的なベンジル系保護基を維持したままＮＢｎのニトロ基のみを還元する条件は適宜選択すればよいが、例えば穏和な還元剤である亜ジチオン酸類を用いることができる。具体的には、化合物（ＩＩＩ）に溶媒と共に亜ジチオン酸類を添加したり、化合物（ＩＩＩ）の溶液または分散液に亜ジチオン酸類を添加したり、化合物（ＩＩＩ）の溶液または分散液に亜ジチオン酸類の溶液または分散液を添加すればよい。亜ジチオン酸類としては、亜ジチオン酸ナトリウムを挙げることができる。或いは、金属と酸との組み合わせを用いた還元反応を利用し、ＮＢｎを選択的に除去することも可能である。還元反応に用いることができる金属としては、Ｆｅ、ＺｎおよびＳｎを挙げることができ、酸としては、塩化アンモニウム、酢酸、塩酸および酸性緩衝液を挙げることができる。
　亜ジチオン酸類の使用量は、化合物（ＩＩＩ）のＣ末端を選択的に脱保護できる範囲で適宜調整すればよいが、例えば、化合物（ＩＩＩ）に対して１ｍｏｌ当量以上、３０ｍｏｌ当量以下の亜ジチオン酸類を用いることができる。当該量としては、２０ｍｏｌ当量以下が好ましく、また、３ｍｏｌ当量以上が好ましく、５ｍｏｌ当量以上がより好ましい。なお、本発明において「ｍｏｌ当量」とは、基準になる化合物１ｍｏｌに対する対象化合物のｍｏｌ数をいう。
　本工程で用いる溶媒としては、化合物（Ｉ）のＮ末端の脱保護反応の説明で例示した溶媒を用いることができ、当該脱保護反応で用いた溶媒と同一の溶媒を用いてもよいし、異なる溶媒を用いてもよい。但し、アミド系溶媒またはスルホキシド系溶媒と水の混合溶媒が好ましく、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から必須的になる群より選択される１以上の有機溶媒と水の混合溶媒がより好ましい。
　本工程の反応温度は特に制限されないが、安全性の観点から使用する溶媒の沸点以下が望ましい。また、不純物の生成抑制と反応速度の観点から適切に温度を設定することが好ましい。反応温度としては、例えば２０℃以上、１５０℃以下が好ましく、３０℃以上、１００℃以下がより好ましく、５０℃以上、９０℃以下がより更に好ましい。
　本工程の反応時間も特に制限されず、予備実験により決定したり、ＨＰＬＣや薄層クロマトグラフィなどで化合物（ＩＩＩ）の消費が確認されるまでとすることもできるが、例えば、３０分以上、２４時間以下とすることができる。
　本工程での反応終了後は、一般的な後処理を行ってもよい。例えば、反応液を室温まで冷却し、貧溶媒を添加して化合物（ＩＶ）を析出させ、濾集し、貧溶媒で洗浄した後、乾燥すればよい。
　工程Ｃ：　縮合工程
　本工程では、上記工程Ａの反応液に、化合物（ＩＶ）を添加し、化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＶ）とを縮合して化合物（ＶＩ）を得る。上記工程Ａの反応液へは、上記工程Ｂの反応液や、精製または粗精製した化合物（ＩＶ）を添加すればよいが、精製または粗生成した化合物（ＩＶ）を上記工程Ａの反応液へ添加することが好ましい。即ち、少なくとも上記工程Ａと本工程Ｃは同一系内（ワンポット）で行う。
　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（ＶＩ）
［式中、Ｂｏｃ、（ＡＡ2）n、ｎ、（ＡＡ1）m、ｍ、およびＰｒｏ1は、上記と同義を示す］
　本工程における化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＶ）の使用量は、適宜調整すればよい。例えば、化合物（ＩＩ）に対して０．４ｍｏｌ当量以上、５ｍｏｌ当量以下とすることができ、０．８ｍｏｌ当量以上、２ｍｏｌ当量以下が好ましく、０．９ｍｏｌ当量以上、１．５ｍｏｌ当量以下がより好ましい。
　本工程で化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＶ）とを縮合させる方法は特に限定されないが、例えば、ヒドロキシアミン化合物などの活性化添加剤存在下、カルボジイミド化合物または脱水縮合剤を用いるとよい。
　ヒドロキシアミン化合物としては例えば、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、２－オキシム－シアノグリオキシル酸エチル（Ｏｘｙｍａ）、１－ヒドロキシ－６－クロロ－ベンゾトリアゾール（６－Ｃｌ－ＨＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド、Ｎ－ヒドロキシピペリジンなどが挙げられる。好ましくは１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、および３－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）であり、更に好ましくは３－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）である。
　ヒドロキシアミン化合物の使用量は適宜調整すればよいが、例えば、化合物（ＩＩＩ）に対して０．１ｍｏｌ当量以上、１０ｍｏｌ当量以下とすることができ、０．５ｍｏｌ当量以上、５ｍｏｌ当量以下が好ましい。
　カルボジイミド化合物としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などが挙げられる。好ましくは、後処理の容易さや入手のし易さの観点から１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。
　脱水縮合剤としては、例えば、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリス－ジメチルアミノホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリス－ピロリジノホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチルエナミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＯＴＵ）、（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルフォリニウム　クロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）などが挙げられる。好ましくはＯ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、又は（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）であり、更に好ましくはＯ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）である。
　カルボジイミド化合物と脱水縮合剤の使用量は適宜調整すればよく特に制限されないが、例えば、化合物（ＩＩＩ）に対して０．１ｍｏｌ当量以上、１０ｍｏｌ当量以下とすることができ、０．５ｍｏｌ当量以上、５ｍｏｌ当量以下が好ましい。
　本工程では溶媒を用いてもよく、溶媒としては上記工程Ａの説明で例示したものと同様のものを用いることができる。但し、本工程において原料の溶解性が低い場合には、原料を溶解させて反応を促進する目的で溶媒中にアミド系溶媒が含まれていることが好ましく、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上のアミド系溶媒が含まれていることが好ましい。なお、本工程でアミド系溶媒が含まれる溶媒を用いるには、上記工程Ａと工程Ｂで溶媒の少なくとも一部としてアミド系溶媒を用いた場合には継続して本工程を実施すればよいし、上記工程Ａと工程Ｂでアミド系溶媒を用いなかった場合には、本工程でアミド系溶媒を添加すればよい。本工程の溶媒の一部としてアミド系溶媒を用いる場合には、本工程における溶媒全体に占めるアミド系溶媒の割合を２ｖ／ｖ％以上にすることが好ましく、３０ｖ／ｖ％以上がより好ましく、７０ｖ／ｖ％以上がより更に好ましい。なお、かかる割合は、混合前の各溶媒の合計容量に対する混合前のアミド系溶媒の割合をいう。
　本工程の反応温度や反応時間は特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば反応温度は使用する反応溶媒の沸点以下とすることができ、副反応抑制の観点から、好ましくは５０℃以下であり、常温で反応を行うことも可能である。反応温度の下限は特に制限されないが、反応を良好に進行させる観点から－１０℃以上が好ましい。反応時間は特に制限されず、予備実験により決定したり、ＨＰＬＣや薄層クロマトグラフィなどで化合物（ＩＩ）または化合物（ＩＶ）の消費が確認されるまでとすることもできるが、例えば、１分以上、４８時間以下とすることができる。
　本工程での反応終了後は、一般的な後処理を行ってもよい。例えば、水、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液などで反応液を洗浄後、有機相を無水硫酸ナトリウムや無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮してもよい。更にカラムクロマトグラフィや晶析操作などによって化合物（ＶＩ）を精製してもよい。
　本工程で得られた化合物（ＶＩ）は、上記工程Ｂの化合物（ＩＩＩ）として用いて上記工程Ａ～Ｃを繰り返し、ペプチド鎖を伸長してもよい。その場合には、化合物（ＶＩ）のＣ末端保護基Ｐｒｏ1として、化合物（ＩＩＩ）と同様にＯＮＢｎを用いる。
　或いは、本工程で得られた化合物（ＶＩ）は、上記工程Ａの化合物（Ｉ）として用いて上記工程Ａ～Ｃを繰り返し、ペプチド鎖を伸長してもよい。その場合には、化合物（ＶＩ）のＣ末端保護基Ｐｒｏ1は適宜選択すればよい。例えば後記のエキセナチドを製造する場合には、エキセナチド自体のＣ末端が－ＣＯＮＨ2であるので、Ｐｒｏ1はＮＨ2とすれば、エキセナチドを効率的に製造することができる。また、化合物（ＶＩ）をよりＮ末端側のペプチド鎖として用いる場合には、Ｐｒｏ1はＯＮＢｎとしてもよい。
　工程Ｄ：　脱保護工程
　本工程では、少なくとも化合物（ＶＩ）の反応性側鎖官能基を脱保護することにより、目的のペプチドを得る。勿論、化合物（ＶＩ）のＡＡ2およびＡＡ1が反応性側鎖官能基を有さない場合や、準反応性側鎖官能基を有するが保護されていない場合には、本工程を行う必要は無い。また、必要に応じて、Ｎ末端およびＣ末端の少なくとも一方を脱保護してもよい。各保護基の脱保護条件としては、公知条件を採用すればよい。
　本工程での反応終了後は、一般的な後処理を行ってもよい。例えば、反応液を濃縮後、カラムクロマトグラフィなどで目的のペプチドを精製してもよい。
　以上で説明した本発明方法によれば、有用な長鎖ペプチドを効率的に製造することができる、例えば本発明方法を、２型糖尿病薬として世界中で広く使用されているＧＬＰ－１受容体作動薬であるエキセナチドの製造に適用することができる。エキセナチドは、Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を有し、Ｃ末端カルボキシ基がアミド化されている。
　本発明方法で長鎖ペプチドを製造する場合には、例えばエピメリ化が起こり難いよう長鎖ペプチドを適切な位置で切断したペプチド断片をデザインし、各ペプチド断片を本発明方法または従来方法で製造し、各ペプチド断片を本発明方法で縮合していけばよい。その場合、隣り合うペプチド断片のうち、よりＣ末端側のペプチド断片を化合物（Ｉ）として用い、よりＮ末端側のペプチド断片を化合物（ＩＩＩ）として用いる。ペプチド断片が反応性側鎖官能基を有する場合には、当該反応性側鎖官能基の保護基として、Ｎ末端および／またはＣ末端の選択的脱保護条件、即ちＢｏｃおよび／またはＮＢｎの除去条件で除去されないものを選択する。
　例えばエキセナチドを本発明方法で製造する場合には、Ｃ末端からＮ末端に向かって下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ1～Ｆ8（フラグメント１～８）をデザインし、各ペプチド断片を本発明方法で縮合していけばよい。
　Ｆ1：　Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　Ｆ2：　Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ
　Ｆ3：　Ａｓｎ－Ｇｌｙ
　Ｆ4：　Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ
　Ｆ5：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ
　Ｆ6：　Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ
　Ｆ7：　Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ
　Ｆ8：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ
　上記ペプチド断片中、エキセナチドのＣ末端部分に相当するペプチド断片Ｆ1のＣ末端は、エキセナチドのＣ末端がアミド化されており、アミド基は比較的安定であることから、ＮＨ2で保護することが好ましい。その他のペプチド断片Ｆ2～Ｆ7は、何れかの段階でよりＣ末端側のペプチド断片と縮合することになるので、ペプチド断片Ｆ2～Ｆ8のＣ末端の保護基としてはＯＮＢｎを用いることが好ましい。
　より具体的には、ペプチド断片Ｆ1を化合物（Ｉ）として用い、ペプチド断片Ｆ2を化合物（ＩＩＩ）として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ9を得、
　Ｆ9：　Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　ペプチド断片Ｆ3を化合物（Ｉ）として用い、ペプチド断片Ｆ4を化合物（ＩＩＩ）として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ10を得、
　Ｆ10：　Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ
　ペプチド断片Ｆ7を化合物（Ｉ）として用い、ペプチド断片Ｆ8を化合物（ＩＩＩ）として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ11を得、
　Ｆ11：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ
　ペプチド断片Ｆ10を化合物（Ｉ）として用い、ペプチド断片Ｆ5を化合物（ＩＩＩ）として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ12を得、
　Ｆ12：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ
　ペプチド断片Ｆ9を化合物（Ｉ）として用い、ペプチド断片Ｆ12を化合物（ＩＩＩ）として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ13を得、
　Ｆ13：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　ペプチド断片Ｆ13を化合物（Ｉ）として用い、ペプチド断片Ｆを化合物（ＩＩＩ）として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ14を得、
　Ｆ14：　Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　ペプチド断片Ｆ14を化合物（Ｉ）として用い、ペプチド断片Ｆ11を化合物（ＩＩＩ）として用いて縮合し、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ15を得る。
　Ｆ15：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　上記ペプチド断片Ｆ1のＣ末端の保護基としてＮＨ2を用い、上記ペプチド断片Ｆ15のＮ末端の保護基であるＢｏｃと反応性側鎖官能基を常法により脱保護することにより、エキセナチドが得られる。
　本願は、２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８－６５２９８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８－６５２９８号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１：　フラグメントＦ1とフラグメントＦ2からのフラグメントＦ9の製造
　（１）Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨの製造
　Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（０．８２ｇ，１．０ｍｍｏｌ）に、Ｎａ2Ｓ2Ｏ4（０．８６ｇ，５．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡ（５ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）を添加し、９０℃で２時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチル（８ｍＬ）と水（８ｍＬ）を添加して分液と抽出を行い、フラグメントＦ2としてＢｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨを得た。
　（２）Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2の製造
　Ｂｏｃ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2（０．６９ｇ，１．１ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（５ｍＬ）とメタンスルホン酸（０．５８ｇ，６．０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン（０．６２ｇ，６．１ｍｍｏｌ）を添加し室温で１０分撹拌した後、該反応液を上記実施例１（１）で得られたＢｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨのジクロロメタン溶液（６ｍＬ）に添加した。続けてＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（０．２３ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を添加し、最後にＥＤＣ塩酸塩（０．２９ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。次いで反応を停止させ、抽出によりフラグメントＦ9としてＢｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2を得た（０．９３ｍｍｏｌ，純度９５．０％）。
　実施例２：　フラグメントＦ3とフラグメントＦ4からのフラグメントＦ10の製造
　（１）Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－ＯＨの製造
　Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｏ（４－ＮＢｎ）（１．０ｇ，０．９４ｍｍｏｌ）に、ＤＭＡ（６ｇ）、Ｎａ2Ｓ2Ｏ4（０．８２ｇ，４．７ｍｍｏｌ）および水（０．６ｇ）を添加し、９０℃で２時間撹拌した。その後、２０℃まで冷却し、５％硫酸水素カリウム水溶液（４０ｇ）を添加した。析出固体を濾取し、減圧乾燥することで、フラグメントＦ4として０．８７ｇのＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－ＯＨを得た。
　（２）Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）の製造
　Ｂｏｃ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（３．５ｇ，８．３ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１６０ｍＬ）とメタンスルホン酸（５．４ｇ，５６ｍｍｏｌ）を添加し、３時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン（５．８ｇ，５７ｍｍｏｌ）を添加して５分間撹拌することにより、Ｎ末端を脱保護した。
　Ｈ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）溶液に、上記実施例２（１）で得られたＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－ＯＨ（８．５ｇ，７．０ｍｍｏｌ）とＨＯＯＢｔ（２．０ｇ，１３ｍｍｏｌ）を添加し、最後にＥＤＣ塩酸塩（２．０ｇ，１０ｍｍｏｌ）の水溶液（５．８ｍＬ）を３時間かけて添加した。２０℃で４時間撹拌後、水（１６０ｇ）を添加して析出物を濾取することで、フラグメントＦ10としてＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）を得た（９．７ｇ，６．３ｍｍｏｌ）。
　実施例３：　フラグメントＦ7とフラグメントＦ8からのフラグメントＦ11の製造
　（１）Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨの製造
　Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（５．０ｇ，５．９ｍｍｏｌ）に、ＤＭＡ（１５ｇ）、Ｎａ2Ｓ2Ｏ4（５．２ｇ，３０ｍｍｏｌ）および水（１．１ｇ）を添加し、１００℃で３時間撹拌した。１０℃まで冷却後、水（３０ｇ）とジクロロメタン（３０ｇ）を添加して分液と抽出を行い、フラグメントＦ8としてＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨを得た。
　（２）Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－Ｏ（４－ＮＢｎ）の製造
　Ｂｏｃ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（６．３ｇ，４．９ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１１ｇ）とメタンスルホン酸（２．４ｇ，２５ｍｍｏｌ）を添加し、２時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン（２．６ｇ，２５ｍｍｏｌ）を添加して１５分間撹拌した後、上記実施例３（１）で得られたＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨ溶液（４２ｇ，５．９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（１．１ｇ，７．４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ塩酸塩（１．４ｇ，７．４ｍｍｏｌ）をこの順で添加した。０℃で１８時間撹拌後、５％炭酸ナトリウム水溶液（６０ｇ）を添加した。析出した固体を濾取することで、フラグメントＦ11としてＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－Ｏ（４－ＮＢｎ）を取得した（８．６ｇ，４．６ｍｍｏｌ，純度９３．５％）。
　実施例４：　フラグメントＦ5とフラグメントＦ10からのフラグメントＦ12の製造
　（１）Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－ＯＨの製造
　Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（８．５ｇ，７．２ｍｍｏｌ）に、ＤＭＡ（６０ｍＬ）、Ｎａ2Ｓ2Ｏ4（６．２ｇ，３６ｍｍｏｌ）および水（６ｍＬ）を添加し、９０℃で４時間撹拌した。その後、水（６０ｍＬ）を添加して室温まで冷却し、酢酸エチル（６０ｍＬ）を添加して、室温で２時間撹拌した。析出した固体を濾取し、水と酢酸エチルで洗浄することにより、フラグメントＦ5としてＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－ＯＨを取得した（７．５ｇ，７．２ｍｍｏｌ，純度：９６．５％）。
　（２）Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）の製造
　上記実施例２で得られたＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（９．５ｇ，６．２ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１０５ｍＬ）とメタンスルホン酸（３．０ｇ，３１ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン（２．８ｇ，２８ｍｍｏｌ）を添加して５分間撹拌した。更にＤＭＡ（１４６ｇ）を添加して２０℃まで昇温した。
　上記反応液に、上記実施例４（１）で得られたＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－ＯＨ（６．５ｇ，６．２ｍｍｏｌ）およびＨＯＯＢｔ（１．５ｇ，９．３ｍｍｏｌ）を添加し、最後にＥＤＣ塩酸塩（１．８ｇ，９．３ｍｍｏｌ）のＤＭＡ溶液（３１１ｍＬ）を５時間かけて添加した。２０℃で１３時間撹拌後、３０℃で１７時間撹拌した。更に、ＨＯＯＢｔ（０．２５ｇ，１．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ塩酸塩（０．３０ｇ，１．６ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－ＯＨ（０．９７ｇ，０．９４ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（０．２２ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を添加し、１５時間撹拌した。その後、水（５７０ｍＬ）を添加し、一部を４０℃で減圧濃縮した後に、水（２８５ｍＬ）を再び添加した。０℃に冷却し、析出物を濾取することで、フラグメントＦ12としてＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）を得た（１５．７ｇ）。
　実施例５：　フラグメントＦ9とフラグメントＦ12からのフラグメントＦ13の製造
　（１）Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－ＯＨの製造
　上記実施例４で得られたＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（１５ｇ，６．１ｍｍｏｌ）にＤＭＡ（９０ｇ）を添加し、５５℃まで加温した。続けて水（９．０ｇ）とＮａ2Ｓ2Ｏ4（５．３ｇ，３０ｍｍｏｌ）を添加し、９０℃になるまで加熱した。９０℃で２時間撹拌後、水（９０ｇ）を添加して析出物を濾取することにより、フラグメントＦ12としてＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－ＯＨを得た（１３．４ｇ，５．８ｍｍｏｌ）。
　（２）Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2の製造
　上記実施例１で得られたＢｏｃ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2（７．１ｇ，５．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（９６ｇ）にメタンスルホン酸（３．７ｇ，３９ｍｍｏｌ）を添加し、３時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン（４．２ｇ，４１ｍｍｏｌ）を添加し、５分間撹拌した。更にＤＭＡ（１０６ｇ）を添加した後、ジクロロメタンを減圧留去した。
　次いで、上記実施例５（１）で得られたＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１１．２ｇ，４．８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡ（１０６ｇ）およびＨＯＯＢｔ（１．６ｇ，９．７ｍｍｏｌ）を添加し、最後にＥＤＣ塩酸塩（１．９ｇ，９．７ｍｍｏｌ）を添加し、２時間撹拌した。更にＥＤＣ塩酸塩（０．４６ｇ，２．４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．２４ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を１時間おきに３度添加し、１時間撹拌した後に、トリエチルアミン（０．４９ｇ，４．８ｍｍｏｌ）を添加し、１３時間撹拌した。水（１０６ｇ）を添加して析出物を濾取することで、フラグメントＦ13としてＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2を得た（１３．３ｇ，３．９ｍｍｏｌ）。
　実施例６：　フラグメントＦ13とフラグメントＦ6からのフラグメントＦ14の製造
　（１）Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－ＯＨの製造
　Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｏ（４－ＮＢｎ）（１．０ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）に、ＤＭＡ（６．０ｇ）、水（０．６ｇ）およびＮａ2Ｓ2Ｏ4（１．２ｇ，６．９ｍｍｏｌ）を添加し、９０℃で４時間撹拌した。続けて水（６０ｇ）を添加して析出した固体を濾取することで、フラグメントＦ6としてＢｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－ＯＨを得た（０．８９ｇ，０．６８ｍｍｏｌ，純度９４．６％）。
　（２）Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2の製造
　上記実施例５で得られたＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2（１３ｇ，３．８ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１０４ｇ）を添加した。続けて、メタンスルホン酸（７．３ｇ，７６ｍｍｏｌ）を添加し、２時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン（８．３ｇ，８２ｍｍｏｌ）を添加して５分間撹拌した。ＤＭＡ（１６９ｇ）を添加し、上記実施例６（１）で得られたＢｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－ＯＨ（３．９ｇ，３．０ｍｍｏｌ）およびＨＯＯＢｔ（１．２ｇ，７．６ｍｍｏｌ）を添加した。続けて３０分ごとにＥＤＣ塩酸塩（０．３６ｇ，１．９ｍｍｏｌ）を４回添加し、１時間撹拌した後、Ｂｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－ＯＨ（２．０ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を添加し、２時間撹拌した。再びトリエチルアミン（０．１９ｇ，１．９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ塩酸塩（０．３６ｇ，１．９ｍｍｏｌ）を添加し、１３時間撹拌した。水（２７３ｇ）を添加して減圧濃縮した後、再び水（１０４ｇ）を添加して析出した固体を濾取することで、フラグメントＦ14としてＢｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2を得た（１６．１ｇ）。
　実施例７：　フラグメントＦ14とフラグメントＦ11からのフラグメントＦ15の製造
　（１）Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－ＯＨの製造
　上記実施例３で得られたＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－Ｏ（４－ＮＢｎ）（１１ｍｍｏｌ）にＤＭＳＯ（８１ｇ）を添加し、４５℃に昇温した。Ｎａ2Ｓ2Ｏ4（５．６ｇ，３２ｍｍｏｌ）を添加し、６５℃で７時間撹拌後、再びＮａ2Ｓ2Ｏ4（１．９ｇ，１１ｍｍｏｌ）を添加し、３時間撹拌した。水（０．５８ｇ）およびＮａ2Ｓ2Ｏ4（２．８ｇ，１６ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌後、７０℃で３時間撹拌した。２０℃まで冷却後、水（３０２ｇ）を添加して析出物を濾取することで、フラグメントＦ11としてＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－ＯＨを得た（２０ｇ）。
　（２）Ｂｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2の製造
　上記実施例６で得られたＢｏｃ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2（１５ｇ，３．２ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１７７ｇ）を添加した。続けて、メタンスルホン酸（９．３ｇ，９６ｍｍｏｌ）を添加し、２時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、トリエチルアミン（１０ｇ，１０３ｍｍｏｌ）を添加し、５分間撹拌した。ＤＭＡ（１７７ｇ）を添加し、更に上記実施例７（１）で得られたＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（６．１ｇ，３．５ｍｍｏｌ）およびＨＯＯＢｔ（１．１ｇ，６．４ｍｍｏｌ）を添加した。続けてＥＤＣ塩酸塩（１．２ｇ，６．４ｍｍｏｌ）を添加し、４時間撹拌した。更にＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（０．５６ｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を添加し、３時間撹拌し、続けて反応溶液を減圧濃縮した。残渣に水（３５４ｇ）を添加し、１０℃に冷却した後、析出した固体を濾取することにより、フラグメントＦ15としてＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2を得た（１９．３ｇ）。
　実施例８：　エキセナチドの製造
　上記実施例７で得られたＢｏｃ－Ｈｉｓ（ＢＯＭ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ（Ｏ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（Ｚ）2－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ｔｒｐ（ＣＨＯ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｃｌ－Ｚ）－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）－ＮＨ2（１．０ｇ，０．２ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（１５ｇ）を添加した。続けて、メタンスルホン酸（１．２ｇ，１３ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。反応溶液を氷冷後、ＤＭＦ（１０ｇ）を加えて減圧濃縮した。次に水素雰囲気下、Ｐｄ／Ｃを用いて水素添加反応を実施後、ピペリジンを加えてエキセナチドを取得した。

Claims (13)

  1. 　長鎖ペプチドを製造するための方法であって、
    　スルホン酸類を用いて下記式（Ｉ）で表される化合物のＮ末端を選択的に脱保護して下記式（ＩＩ）で表される化合物を得た後、塩基性化合物を添加して反応液を中和する工程Ａ、
    　　Ｂｏｃ－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（Ｉ）
    　　Ｈ－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（ＩＩ）
    ［式中、ＢｏｃはＮ末端の保護基であるｔ－ブトキシカルボニル基を示し、（ＡＡ1）mは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、ｍは２以上５０以下の整数を示し、Ｐｒｏ1はＣ末端の保護基を示す］
    　下記式（ＩＩＩ）で表される化合物のＣ末端を選択的に脱保護して下記式（ＩＶ）で表される化合物を得る工程Ｂ、
    　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－ＯＮＢｎ　　・・・　　（ＩＩＩ）
    　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－ＯＨ　　・・・　　（ＩＶ）
    ［式中、（ＡＡ2）nは反応性側鎖官能基が保護されているペプチド鎖を示し、ｎは２以上５０以下の整数を示し、ＮＢｎは下記式（Ｖ）で表されるニトロベンジル基（式中、ｐ、ｑおよびｒは独立して０または１を示し、ｐ＋ｑ＋ｒは１、２または３を示す）を示す］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　および、上記工程Ａの反応液に、上記式（ＩＶ）で表される化合物を添加し、上記式（ＩＩ）で表される化合物と上記式（ＩＶ）で表される化合物とを縮合して下記式（ＶＩ）で表される化合物を得る工程Ｃを含むことを特徴とする方法。
    　　Ｂｏｃ－（ＡＡ2）n－（ＡＡ1）m－Ｐｒｏ1　　・・・　　（ＶＩ）
    ［式中、Ｂｏｃ、（ＡＡ2）n、ｎ、（ＡＡ1）m、ｍ、およびＰｒｏ1は、上記と同義を示す］
  2. 　上記工程Ｂにおいて、金属と酸との組み合わせ、または亜ジチオン酸類を用いてＣ末端を選択的に脱保護する請求項１に記載の方法。
  3. 　上記スルホン酸類として、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸から必須的になる群より選択される１以上のスルホン酸を用いる請求項１または２に記載の方法。
  4. 　上記塩基性化合物として有機アミン化合物を用いる請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　上記有機アミン化合物として、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンの少なくとも一方を用いる請求項４に記載の方法。
  6. 　Ｐｒｏ1がＯＮＢｎであり上記工程Ｃで得られる上記式（ＶＩ）で表される化合物を上記工程Ｂにおける上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用い、上記工程Ａ～Ｃを複数回繰り返す請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　Ｐｒｏ1がＮＨ2またはＯＮＢｎであり上記工程Ｃで得られる上記式（ＶＩ）で表される化合物を上記工程Ａにおける上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、上記工程Ａ～Ｃを複数回繰り返す請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　更に、少なくとも上記式（ＶＩ）で表される化合物の反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　上記工程Ｃで溶媒を用い、当該溶媒としてアミド系溶媒を用いる請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　上記アミド系溶媒として、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、およびジブチルホルムアミドから必須的になる群より選択される１以上のアミド系溶媒を用いる請求項９に記載の方法。
  11. 　上記長鎖ペプチドがエキセナチドである請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　下記アミノ酸配列を有するペプチド断片を用い、
    　Ｆ1：　Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
    　Ｆ2：　Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ
    　Ｆ3：　Ａｓｎ－Ｇｌｙ
    　Ｆ4：　Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ
    　Ｆ5：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ
    　Ｆ6：　Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ
    　Ｆ7：　Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ
    　Ｆ8：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ
    　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＰｒｏ1で保護されている上記ペプチド断片Ｆs（ｓは１以上、７以下のいずれかの整数を示す）を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、且つ、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆs+1を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用い、上記ペプチド断片Ｆsと上記ペプチド断片Ｆs+1とを縮合する請求項８に記載の方法。
  13. 　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ1を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ2を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ9を製造する工程、
    　Ｆ9：　Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
    　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ3を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ4を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ10を製造する工程、
    　Ｆ10：　Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ
    　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ7を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ8を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ11を製造する工程、
    　Ｆ11：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ
    　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ10を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ5を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ12を製造する工程、
    　Ｆ12：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ
    　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ9を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ12を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ13を製造する工程、
    　Ｆ13：　Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
    　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ13を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ6を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ14を製造する工程、
    　Ｆ14：　Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
    　Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＮＨ2で保護されている上記ペプチド断片Ｆ14を上記式（Ｉ）で表される化合物として用い、Ｎ末端がＢｏｃで保護され且つＣ末端がＯＮＢｎで保護されている上記ペプチド断片Ｆ11を上記式（ＩＩＩ）で表される化合物として用いて、下記アミノ酸配列を有するペプチド断片Ｆ15を製造する工程、
    　Ｆ15：　Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
    　および、上記ペプチド断片Ｆ15のＮ末端および反応性側鎖官能基を脱保護する工程を含む請求項１２に記載の方法。
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