CN111918872A - 长链肽的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供适合工业上大量合成的高效的长链肽的制造方法。本发明的长链肽的制造方法的特征在于，用磺酸将N末端被Boc基保护的原料肽片段的N末端进行脱保护，而且对C末端被ONBn基保护的原料肽片段的C末端选择性地进行脱保护，通过液相法将得到的N末端脱保护肽片段和C末端脱保护肽片段进行缩合。
Description
技术领域
本发明涉及长链肽的高效的制造方法。
背景技术
长链肽结构是近年来备受关注的肽医药品的主要结构。由于是有望在未来有所发展的领域，因此，虽然其高效的制造方法是市场希望的，但并不存在真正高效的方法。例如，作为代表性的肽制造方法，有固相合成法。在固相合成法中，使用担载于固相的氨基酸作为起始原料，通过将氨基酸一个一个地延伸的方法来合成长链肽。
[化学式1]
根据固相合成法，也可以合成包含100个以上氨基酸的长链肽。但是，为了在固相上进行全部反应，各反应的结束需要大量过量的试剂等，未必是高效的方法，至少不适合工业上的大量生产。
与此相对，根据在液相中进行全部反应的液相合成法，反应性高，与固相法相比，试剂量也可以大幅减少。但是，在基于液相合成法进行片段偶联时，需要制备将C末端保护基团和N末端保护基团分别选择性去除的片段，各片段的保护基团通常难以选择。例如，羟基、羧基的保护经常使用能够用氢化这样的稳和且简便的方法来去除的苄基，但是如果用苄基保护C末端和侧链羟基、侧链羧基，则无法通过氢化选择性地仅将C末端脱保护。
作为肽片段的C末端保护基团，在非专利文献1、2所记载的方法中，用4-硝基苄基酯基保护C末端，在90％乙酸中、于锌粉末的存在下进行了脱保护。但是，该锌粉末的量不是催化剂量，例如，相对于应将C末端脱保护的肽片段273mg，锌粉末的用量为100mg。因此，在工业上大量生产目标的肽的情况下，需要大量的锌粉末，而且也需要在反应后处理大量的乙酸，因此，该方法对环境的负担大，不适于工业上的大量生产。
另外，在非专利文献1、2所记载的方法中，用TFA(三氟乙酸)对被Boc(叔丁氧羰基)保护的N末端进行了脱保护。但是，该TFA在下一N末端脱保护肽片段与C末端脱保护肽片段的缩合反应中发生副反应，因此，在蒸发之后，通过利用正己烷的清洗和使用KOH颗粒的真空干燥，被完全去除。可以认为，在制造长链肽时，每次去除Boc基进行这样操作的方法并不是高效的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：TAKASHI ABIKO等、Chem.Pharm.Bull.,28(12),pp.3542-3548(1980)
非专利文献2：TAKASHI ABIKO等、Chem.Pharm.Bull.,29(5),pp.1390-1397(1981)
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，与固相合成法相比，可以认为长链肽的液相合成法适合工业上的大量合成，通常难以选择保护基团，而且有时需要在每次N末端脱保护时完全去除脱保护用试剂。
因此，本发明的目的在于提供适合工业上大量合成的长链肽的高效的制造方法。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究。其结果是发现，在长链肽的液相合成法中，如果用磺酸类将被Boc保护的肽片段的N末端脱保护、且预先用ONBn保护肽片段的C末端，则至少从N末端的脱保护起可以在同一体系内(一锅反应)进行与C末端脱保护肽片段的缩合反应，而且容易选择反应性侧链官能团的保护基团，从而完成了本发明。
将本发明示于以下。
[1]一种用于制造长链肽的方法，该方法包括：
工序A，使用磺酸类将下述式(I)所示化合物的N末端选择性地脱保护，得到下述式(II)所示的化合物，然后，添加碱性化合物将反应液中和，
Boc-(AA1)m-Pro1···(I)
H-(AA1)m-Pro1···(II)
式中，Boc表示作为N末端的保护基团的叔丁氧羰基，(AA1)m表示反应性侧链官能团被保护的肽链，m表示2以上且50以下的整数，Pro1表示C末端的保护基团；
工序B，将下述式(III)所示的化合物的C末端选择性地脱保护，得到下述式(IV)所示的化合物，
Boc-(AA2)n-ONBn···(III)
Boc-(AA2)n-OH···(IV)
式中，(AA2)n表示反应性侧链官能团被保护的肽链，n表示2以上且50以下的整数，NBn表示下述式(V)所示的硝基苄基，式(V)中，p、q及r独立地表示0或1，p+q+r表示1、2或3，
[化学式2]
工序C，向所述工序A的反应液添加上述式(IV)所示的化合物，使上述式(II)所示的化合物与上述式(IV)所示的化合物缩合，得到下述式(VI)所示的化合物，
Boc-(AA2)n-(AA1)m-Pro1···(VI)
式(VI)中，Boc、(AA2)n、n、(AA1)m、m、以及Pro1表示与上述相同的含义。
[2]根据上述[1]所述的方法，其中，在所述工序B中，使用金属和酸的组合、或连二亚硫酸类将C末端选择性地脱保护。
[3]根据上述[1]或[2]所述的方法，其中，作为所述磺酸类，使用选自甲磺酸、三氟甲磺酸、以及对甲苯磺酸中的1种以上磺酸。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，作为所述碱性化合物，使用有机胺化合物。
[5]根据上述[4]所述的方法，其中，作为所述有机胺化合物，使用三乙胺及二异丙基乙胺中的至少一者。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，使用Pro1为ONBn且所述工序C中得到的上述式(VI)所示的化合物作为所述工序B中的上述式(III)所示的化合物，重复多次所述工序A～C。
[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，使用Pro1为NH2或ONBn且所述工序C中得到的上述式(VI)所示的化合物作为所述工序A中的上述式(I)所示的化合物，重复多次所述工序A～C。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的方法，其进一步包括：
至少将上述式(VI)所示的化合物的反应性侧链官能团脱保护的工序。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，在所述工序C中使用溶剂，使用酰胺类溶剂作为该溶剂。
[10]根据上述[9]所述的方法，其中，作为所述酰胺类溶剂，使用选自二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、以及二丁基甲酰胺中的1种以上酰胺类溶剂。
[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，所述长链肽为艾塞那肽。
[12]根据上述[8]所述的方法，其中，使用具有下述氨基酸序列的肽片段，F1：Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
F2：Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
F3：Asn-Gly
F4：Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys
F5：Glu-Ala-Val-Arg-Leu
F6：Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu
F7：Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
F8：His-Gly-Glu-Gly
使用N末端被Boc保护且C末端被Pro1保护的所述肽片段Fs(s表示1以上且7以下的任意整数)作为上述式(I)所示的化合物，而且使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段Fs+1作为上述式(III)所示的化合物，使所述肽片段Fs与所述肽片段Fs+1缩合。
[13]根据上述[12]所述的方法，该方法包括：
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F1作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F2作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F9的工序，
F9：Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F3作为所述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F4作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F10的工序，
F10：Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly；
使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F7作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F8作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F11的工序，
F11：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu；
使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F10作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F5作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F12的工序，
F12：Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly；
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F9作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F12作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F13的工序，
F13：Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F13作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F6作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F14的工序，
F14：Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F14作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F11作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F15的工序，
F15：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；以及
将所述肽片段F15的N末端及反应性侧链官能团脱保护的工序。
发明的效果
对于本发明的长链肽的制造方法而言，由于全部反应在液相中进行，因此，与使用现有的固相合成法的制造方法相比，可以大幅减少使用的试剂量，能够高效率地制造长链肽。另外，关于现有的液相法中作为课题的适当的C末端保护基团的选择，通过采用能够在特异性条件下去除的C末端保护基团，可容易地选择反应性侧链官能团的保护基团。此外，通过使用特定的试剂作为N末端保护基团的脱保护用试剂，即使脱保护用试剂残留，也可以没有问题地进行N末端脱保护肽片段与C末端脱保护肽片段的缩合，因此，不需要完全去除脱保护用试剂这样的繁杂的操作。因此，本发明的方法特别适合长链肽的工业大量生产，在工业上极其有用。
具体实施方式
以下，按照工序对本发明方法进行详细说明。需要说明的是，以下将“式(X)所示的化合物”简称为“化合物(X)”。
工序A：N末端的脱保护工序
在本工序中，使用磺酸类将化合物(I)的N末端选择性地脱保护，得到化合物(II)，然后，添加碱性化合物将反应液中和。
Boc-(AA1)m-Pro1···(I)
H-(AA1)m-Pro1···(II)
[式中，Boc表示作为N末端的保护基团的叔丁氧羰基，(AA1)m表示反应性侧链官能团被保护的肽链，m表示2以上且50以下的整数，Pro1表示C末端的保护基团]
(AA1)m表示反应性侧链官能团被保护的肽链，具有以下的结构单元。需要说明的是，AA1表示氨基酸残基，多个AA1任选相互相同或不同。
[化学式3]
[式中，R表示氨基酸的侧链]
当然，在(AA1)m中，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Asn、Gln、Pro、Phe的侧链官能团等不具有反应性的侧链官能团不需要保护。这里，“反应性侧链官能团”是指氨基酸侧链包含的反应性高的官能团，具体可以列举：羟基、硫醇基、羧基、氨基、胍基、以及咪唑基。另外，在本公开中，Met的甲硫基、Asn及Gln的酰胺基不包含于反应性侧链官能团，但为了完全抑制副反应，也可以进行保护。具体而言，Met的侧链的硫醚基(-S-)可以形成亚砜，作为酰胺基的保护基团，可以列举：呫吨基、双-2,4-二甲氧基苄基、4,4’-二甲氧基二苯甲基等。另外，Cys的侧链硫醇基也可以氧化。在本公开中，有时将Met的侧链硫醚基和Asn及Gln的侧链酰胺基称为“准反应性侧链官能团”。
作为反应性侧链官能团的保护基团，优选为在用于将N末端脱保护的磺酸类所引起的酸性条件下不会被脱保护的保护基团。以下，作为侧链羟基的保护基团，可以列举：苄基(Bzl)、4-甲基苄基(4-MeBzl)、4-甲氧基苄基(4-MeOBzl)、2-溴苄氧基羰基(Br-Z)等；作为侧链硫醇基的保护基团，可以列举：苄基(Bzl)、4-甲基苄基(4-MeBzl)、4-甲氧基苄基(4-MeOBzl)、叔丁基(tBu)等；作为侧链羧基的保护基团，可以列举：苄氧基(OBzl)、环己氧基(O-cHex)等；作为侧链氨基的保护基团，可以列举：甲酰基、2,4,6-三甲基苯磺酰基(Mts)、苄氧羰基(Z)、硝基(NO2)、对甲苯磺酰基(Tos)、苄氧甲基(BOM)、2,4-二硝基苯基(Dnp)、2-氯苄氧羰基(Cl-Z)等；没有特别限制。
作为Ser和Thr的侧链保护基团，优选为Bn基；作为Lys的侧链保护基团，优选为2-Cl-Z基或Z基；作为Trp的侧链保护基团，优选为甲酰基；作为Glu和Asp的侧链保护基团，优选为Bn基；作为Arg的侧链保护基团，优选为Z基或NO2基；作为His的侧链保护基团，优选为BOM基；作为Tyr的侧链保护基团，优选为Bn基、Z基或2-Br-Z基。作为N末端氨基酸的侧链保护基团，也可以使用Boc基等能够用酸去除的保护基团。
m的上限没有特别限制，肽片段过大时，存在难以进行反应的隐患，因此，作为m，优选为100以下，更优选为50以下。另外，作为m，优选为2以上，更优选为3以上，进一步优选为4以上。
Pro1表示C末端的保护基团。作为C末端的保护基团，在Theodora W.Greene,PeterG.M.Wuts著Protectve Groups in Organic Chemistry(第4版、WILEY-INTERSCIENCE公司出版)533～646页所记载的保护基团中，优选为在用于将N末端脱保护的磺酸类引起的酸性条件下不会被脱保护的保护基团。作为被这样的保护基团保护的C末端，可以列举例如：甲酯、乙酯、苄酯、4-硝基苄酯、2-硝基苄酯、2,4-二硝基苄酯、4-甲氧基苄酯等酯类保护基团；酰胺、二甲基酰胺、吡咯烷基酰胺、哌啶基酰胺、邻硝酰苯胺(o-Nitroanilide)等酰胺类保护基团等。
需要说明的是，在使用通过工序A～C得到的化合物(VI)作为工序B的化合物(III)，并重复进行新的工序A～C的情况下，Pro1为选自4-硝基苄醇、2-硝基苄醇、2,4-二硝基苄醇、4,6-二硝基苄醇及2,4,6-三硝基苄醇中的1种以上的硝基苄醇基(ONBn)。
作为化合物(I)的N末端的保护基团，使用Boc，在本工序中，使用磺酸类将化合物(I)的N末端脱保护。被Boc保护的N末端的脱保护通常利用三氟乙酸来进行，但在使用了三氟乙酸的情况下，为了抑制副反应，需要完全去除三氟乙酸。从制造效率性的观点考虑，不优选这样的操作，特别是在工业上的大量合成中应该避免。与此相对，在使用磺酸类进行脱Boc化反应的情况下，不需要去除磺酸类，可以将反应液持续供于缩合工序，能够实现高效的制造。
作为待使用的磺酸类，可以列举例如：甲磺酸、三氟甲磺酸和/或对甲苯磺酸。它们可以以混合物的形式使用。从以残留于反应液的状态不分离化合物(II)而供于下一工序的偶联反应也不产生明显的副产物的观点考虑，特别优选为磺酸类。
磺酸类的用量没有特别限制，可以适当确定，例如，相对于化合物(I)，可以设为0.1mol当量以上、且400mol当量以下。作为该量，优选为0.5mol当量以上、且200mol当量以下。
在本工序中，为了改善反应液的液体性质、促进反应、抑制副反应，可以使用溶剂。溶剂可以适当选择，没有特别限制，可以列举例如：水；甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇等醇类溶剂；己烷、庚烷等脂族烃类溶剂；二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、氯苯等卤代烃类溶剂；四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二
烷、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚等醚类溶剂；乙酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酸甲酯等酯类溶剂；乙腈、丙腈、苯甲腈等腈类溶剂；丙酮、甲乙酮、苯乙酮等酮类溶剂；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二乙基甲酰胺、二丙基甲酰胺、二丁基甲酰胺等酰胺类溶剂；二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基丙撑脲等非质子性极性溶剂。优选为卤代烃类溶剂、醚类溶剂、酰胺类溶剂、非质子性极性溶剂，更优选为卤代烃类溶剂、醚类溶剂、酰胺类溶剂，更进一步优选为选自二氯甲烷、氯苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二丁基甲酰胺中的1种以上的溶剂。这些溶剂可以单独使用，也可以混合2种以上使用。在混合的情况下，其混合比没有特别限制。
溶剂的用量可以适当确定，例如，相对于1g化合物(I)，可以设为1mL以上、且300mL以下，优选为5mL以上、且100mL以下。
各试剂的添加顺序没有特别限制，例如，可以在化合物(I)和溶剂的混合物中添加磺酸类。化合物(I)相对于反应液总体的比例优选为0.2W/V％以上、且50W/V％以下，更优选为1W/V％以上、且20W/V％以下。
用于化合物(I)的N末端的脱保护的反应温度没有特别限制，从安全性的观点考虑，优选为待使用的溶剂的沸点以下。作为反应温度，例如，优选为-40℃以上、且160℃以下，更优选为-20℃以上、且100℃以下，更进一步优选为0℃以上、且60℃以下。
用于化合物(I)的N末端的脱保护的反应时间也没有特别限制，可以通过预实验来确定，或者设为利用HPLC、薄层色谱等确认化合物(I)消耗为止，例如，可以设为10分钟以上、且24小时以下。
在本工序中，将化合物(I)的N末端脱保护之后，添加碱性化合物对反应液进行中和。
碱性化合物并不特别限制于无机碱、有机碱等，从对于反应液的溶解性的观点考虑，优选使用有机碱。作为碱性化合物，可以列举例如：氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯等碱金属的氢氧化物；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等碱金属的碳酸盐；碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属的碳酸氢盐；甲醇锂、乙醇锂、异丙醇锂、叔丁醇锂、甲醇钠、乙醇钠、异丙醇钠、叔丁醇钠、甲醇钾、乙醇钾、异丙醇钾、叔丁醇钾等金属醇盐；氢化钠、氢化钾、氢化钙等金属氢化物；三甲胺、三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、N-甲基吡咯烷、N-甲基吗啉、1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯、吡啶、喹啉、咪唑等有机胺化合物。这些化合物可以单独使用，也可以组合使用2种以上。优选为有机胺化合物，更优选为三乙胺和/或二异丙基乙胺。
碱性化合物的用量可以适当调整。例如，可以设为添加碱性化合物后的反应液pH为6.5以上。该pH越高，越可以良好地进行随后的缩合反应，因此，作为该pH，优选为6.5以上，更优选为7.0以上。另一方面，pH越低，越可以抑制缩合反应中的差向异构化，因此，作为该pH，优选为10以下，更优选为8.0以下。
碱性化合物的添加方式没有特别限制，例如，可以将碱性化合物直接添加于完成了化合物(I)的N末端的脱保护反应的反应液，可以在将碱性化合物分散或溶解于溶剂之后添加分散液或溶液。作为该情况的溶剂，可以使用化合物(I)的N末端的脱保护反应的说明中示例出的溶剂，可以使用与该脱保护反应中使用的溶剂相同的溶剂，也可以使用不同的溶剂。
添加碱性化合物时的温度没有特别限制，可以适当确定，由于中和会产生反应热，因此优选在将反应液冷却之后添加碱性化合物。例如，优选将反应液冷却至-10℃以上、且20℃以下，然后添加碱性化合物。另外，优选在碱性化合物的添加中及添加后对反应液进行搅拌。
工序B：C末端的脱保护工序
在本工序中，将化合物(III)的C末端选择性地脱保护，得到化合物(IV)。需要说明的是，本工序优选与上述工序A另行进行。
Boc-(AA2)n-ONBn···(III)
Boc-(AA2)n-OH···(IV)
[式中，(AA2)n表示反应性侧链官能团被保护的肽链，n表示2以上且50以下的整数，NBn表示下述式(V)所示的硝基苄基(式中，p、q及r独立地表示0或1，p+q+r表示1、2或3)]
[化学式4]
式(III)及式(IV)中的(AA2)n不需要与(AA1)m相同，但可直接适用上述工序A中的(AA1)m的说明，作为n，优选为100以下，更优选为50以下，另外，优选为2以上，更优选为3以上，进一步优选为4以上。
NBn具体为选自4-硝基苄基、2-硝基苄基、2,4-二硝基苄基、4,6-二硝基苄基及2,4,6-三硝基苄基中的1种以上的硝基苄基。包含C末端在内，为了保护肽中的羟基、羧基，可以使用能够利用氢化反应而容易去除的苄基类保护基团。但是，在C末端的保护中使用通常的苄基类保护基团时，有时无法对C末端进行选择性的脱保护。因此，在本发明中，可以通过用ONBn将C末端保护，从而对C末端进行选择性的脱保护。
具体而言，在(AA2)n中不存在反应性侧链官能团的情况、反应性侧链官能团仅被除苄基类保护基团以外的保护基团保护的情况下，化合物(III)的C末端的NBn可以利用通常的氢化反应容易地去除。另外，在反应性侧链官能团的保护基团中不包含通常的苄基类保护基团的情况下，可以在温和的还原条件下选择性地仅将C末端的NBn去除。具体而言，由于NBn中的苯环上的硝基容易被还原，因此，可以在保持通常的苄基类保护基团的状态下仅对NBn的硝基进行还原。在NBn中的硝基被还原时，NBn通过随后的电子转移而被去除，能够仅对C末端进行脱保护。
在保持通常的苄基类保护基团的状态下仅对NBn的硝基进行还原的条件可以适当选择，例如，可以使用作为温和的还原剂的连二亚硫酸类。具体而言，可以将连二亚硫酸类和溶剂一起添加于化合物(III)，或者将连二亚硫酸类添加于化合物(III)的溶液或分散液，或者将连二亚硫酸类的溶液或分散液添加于化合物(III)的溶液或分散液。作为连二亚硫酸类，可以举出连二亚硫酸钠。或者，也可以利用使用了金属和酸的组合的还原反应来选择性地去除NBn。作为可以用于还原反应的金属，可以列举：Fe、Zn及Sn，作为酸，可以列举：氯化铵、乙酸、盐酸及酸性缓冲液。
连二亚硫酸类的用量只要在能够将化合物(III)的C末端选择性地脱保护的范围适当调整即可，例如，相对于化合物(III)，可以使用1mol当量以上、且30mol当量以下的连二亚硫酸类。作为该量，优选为20mol当量以下，另外，优选为3mol当量以上，更优选为5mol当量以上。需要说明的是，在本发明中，“mol当量”是指对象化合物相对于作为基准的化合物1mol的mol数。
作为本工序中使用的溶剂，可以使用化合物(I)的N末端的脱保护反应的说明中示例出的溶剂，可以使用与该脱保护反应中使用的溶剂相同的溶剂，也可以使用不同的溶剂。其中，优选为酰胺类溶剂或亚砜类溶剂与水的混合溶剂，更优选为选自二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基甲酰胺及二甲基亚砜(DMSO)中的1种以上有机溶剂与水的混合溶剂。
本工序的反应温度没有特别限制，从安全性的观点考虑，优选为待使用的溶剂的沸点以下。另外，从抑制杂质的生成和反应速度的观点考虑，优选适当地设定温度。作为反应温度，例如，优选为20℃以上、且150℃以下，更优选为30℃以上、且100℃以下，进一步优选为50℃以上、且90℃以下。
本工序的反应时间也没有特别限制，可以通过预实验确定，或者设为利用HPLC、薄层色谱等确认化合物(III)消耗为止，例如，可以设为30分钟以上、且24小时以下。
在本工序的反应结束后，可以进行通常的后处理。例如，可以将反应液冷却至室温，添加不良溶剂而使化合物(IV)析出，过滤收集，并用不良溶剂进行清洗，然后干燥。
工序C：缩合工序
在本工序中，向上述工序A的反应液添加化合物(IV)，将化合物(II)与化合物(IV)缩合而得到化合物(VI)。可以向上述工序A的反应液添加上述工序B的反应液、纯化或粗纯化的化合物(IV)，优选将纯化或粗制的化合物(IV)添加于上述工序A的反应液。即，在同一体系内(一锅反应)进行至少上述工序A和本工序C。
Boc-(AA2)n-(AA1)m-Pro1···(VI)
[式中，Boc、(AA2)n、n、(AA1)m、m及Pro1表示与上述相同的含义]
本工序中的化合物(II)和化合物(IV)的用量可以适当调整。例如，相对于化合物(II)，可以设为0.4mol当量以上、且5mol当量以下，优选为0.8mol当量以上、且2mol当量以下，更优选为0.9mol当量以上、且1.5mol当量以下。
本工序中使化合物(II)与化合物(IV)缩合的方法没有特别限定，例如，可以在羟胺化合物等活性添加剂的存在下使用碳二亚胺化合物或脱水缩合剂。
作为羟胺化合物，可以列举例如：1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-偶氮苯并三唑(HOAt)、3-羟基-4-氧-3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)、1-羟基-6-氯苯并三唑(6-Cl-HOBt)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基哌啶等。优选为1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-偶氮苯并三唑(HOAt)、以及3-羟基-4-氧-3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)，进一步优选为3-羟基-4-氧-3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)。
羟胺化合物的用量可以适当调整，例如，相对于化合物(III)，可以设为0.1mol当量以上、且10mol当量以下，优选为0.5mol当量以上、且5mol当量以下。
作为碳二亚胺化合物，可以列举例如：二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)等。从后处理的容易性、获得的容易性的观点考虑，优选为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
作为脱水缩合剂，可以列举例如：1H-苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)
六氟磷酸盐(BOP)、1H-苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基
六氟磷酸盐(PyBOP)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、O-[(乙氧羰基)氰基亚甲氨基]-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HOTU)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳
六氟磷酸盐(COMU)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉
氯化物(DMT-MM)等。优选为O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、或(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳
六氟磷酸盐(COMU)，进一步优选为O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)。
碳二亚胺化合物和脱水缩合剂的用量可以适当调整，没有特别限制，例如，相对于化合物(III)，可以设为0.1mol当量以上、且10mol当量以下，优选为0.5mol当量以上、且5mol当量以下。
在本工序中，可以使用溶剂，作为溶剂，可以使用与上述工序A的说明中示例出的溶剂相同的溶剂。其中，在本工序中原料的溶解性低的情况下，为了使原料溶解而促进反应，优选在溶剂中包含酰胺类溶剂，优选包含选自二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、以及二丁基甲酰胺中的1种以上酰胺类溶剂。需要说明的是，在本工序中使用包含酰胺类溶剂的溶剂时，在上述工序A和工序B中使用了酰胺类溶剂作为溶剂的至少一部分的情况下，只要继续实施本工序即可，在上述工序A和工序B中没有使用酰胺类溶剂的情况下，只要在本工序中添加酰胺类溶剂即可。在使用酰胺类溶剂作为本工序的溶剂的一部分的情况下，优选将酰胺类溶剂占本工序中的全部溶剂的比例设为2v/v％以上，更优选为30v/v％以上，进一步优选为70v/v％以上。需要说明的是，所述比例是混合前的酰胺类溶剂相对于混合前的各溶剂的总容量的比例。
本工序的反应温度、反应时间没有特别限制，可以适当调整，例如，反应温度可以设为待使用的反应溶剂的沸点以下，从抑制副反应的观点考虑，优选为50℃以下，也可以在常温下进行反应。反应温度的下限没有特别限制，从使反应良好地进行的观点考虑，优选为-10℃以上。反应时间没有特别限制，可以通过预实验来确定，或者设为利用HPLC、薄层色谱等确认化合物(II)或化合物(IV)消耗为止，例如，可以设为1分钟以上、且48小时以下。
本工序的反应结束后，可以进行通常的后处理。例如，可以用水、饱和食盐水、饱和碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液等对反应液进行清洗后，用无水硫酸钠、无水硫酸镁干燥有机相，进行浓缩。可以进一步通过柱色谱、晶析操作等对化合物(VI)进行纯化。
本工序中得到的化合物(VI)可以作为上述工序B的化合物(III)使用，重复上述工序A～C，将肽链延长。在该情况下，作为化合物(VI)的C末端保护基团Pro1，与化合物(III)同样地使用ONBn。
或者，本工序中得到的化合物(VI)可以作为上述工序A的化合物(I)使用，重复上述工序A～C，将肽链延长。在该情况下，化合物(VI)的C末端保护基团Pro1可以适当选择。例如，在后述的制造艾塞那肽的情况下，由于艾塞那肽本身的C末端为-CONH2，因此，使Pro1为NH2时，可以高效地制造艾塞那肽。另外，在使用化合物(VI)作为更靠N末端侧的肽链的情况下，Pro1可以为ONBn。
工序D：脱保护工序
在本工序中，通过至少对化合物(VI)的反应性侧链官能团进行脱保护，得到目标的肽。当然，在化合物(VI)的AA2及AA1不具有反应性侧链官能团的情况、具有准反应性侧链官能团但未被保护的情况下，不需要进行本工序。另外，根据需要，可以对N末端及C末端的至少一者进行脱保护。作为各保护基团的脱保护条件，可以采用公知条件。
本工序的反应结束后，可以进行通常的后处理。例如，可以在将反应液浓缩后，利用柱色谱等对目标的肽进行纯化。
根据以上说明的本发明方法，可以高效地制造有用的长链肽。例如，可以将本发明方法应用于作为2型糖尿病药而在世界中广泛使用的作为GLP-1受体激动剂的艾塞那肽的制造。艾塞那肽具有His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)的氨基酸序列，C末端羧基被酰胺化。
在通过本发明方法制造长链肽的情况下，例如，可以以不容易发生差向异构化的方式设计在适当的位置切断长链肽而成的肽片段，用本发明方法或现有方法制造各肽片段，用本发明方法将各肽片段进行缩合。该情况下，在相邻的肽片段中，使用更靠C末端侧的肽片段作为化合物(I)，使用更靠N末端侧的肽片段作为化合物(III)。在肽片段具有反应性侧链官能团的情况下，作为该反应性侧链官能团的保护基团，选择在N末端和/或C末端的选择性脱保护条件、即Boc和/或NBn的去除条件下不被去除的保护基团。
例如，在通过本发明方法制造艾塞那肽的情况下，可以设计从C末端朝向N末端具有下述氨基酸序列的肽片段F1～F8(片段1～8)，通过本发明方法对各肽片段进行缩合。
F1：Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
F2：Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
F3：Asn-Gly
F4：Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys
F5：Glu-Ala-Val-Arg-Leu
F6：Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu
F7：Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
F8：His-Gly-Glu-Gly
在上述肽片段中，对于与艾塞那肽的C末端部分相当的肽片段F1的C末端而言，艾塞那肽的C末端被酰胺化，酰胺基比较稳定，因此优选用NH2进行保护。其它肽片段F2～F7在任意阶段均会与更靠C末端侧的肽片段进行缩合，因此优选使用ONBn作为肽片段F2～F8的C末端的保护基团。
更具体而言，使用肽片段F1作为化合物(I)，使用肽片段F2作为化合物(III)进行缩合，得到具有下述氨基酸序列的肽片段F9，
F9：Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
使用肽片段F3作为化合物(I)，使用肽片段F4作为化合物(III)进行缩合，得到具有下述氨基酸序列的肽片段F10，
F10：Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
使用肽片段F7作为化合物(I)，使用肽片段F8作为化合物(III)进行缩合，得到具有下述氨基酸序列的肽片段F11，
F11：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
使用肽片段F10作为化合物(I)，使用肽片段F5作为化合物(III)进行缩合，得到具有下述氨基酸序列的肽片段F12，
F12：Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly
使用肽片段F9作为化合物(I)，使用肽片段F12作为化合物(III)进行缩合，得到具有下述氨基酸序列的肽片段F13，
F13：Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
使用肽片段F13作为化合物(I)，使用肽片段F作为化合物(III)进行缩合，得到具有下述氨基酸序列的肽片段F14，
F14：Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
使用肽片段F14作为化合物(I)，使用肽片段F11作为化合物(III)进行缩合，得到具有下述氨基酸序列的肽片段F15。
F15：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
使用NH2作为上述肽片段F1的C末端的保护基团，利用通常方法将作为上述肽片段F15的N末端的保护基团的Boc和反应性侧链官能团进行脱保护，由此得到艾塞那肽。
本申请基于2018年3月29日提出申请的日本专利申请第2018-65298号要求优先权。将2018年3月29日提出申请的日本专利申请第2018-65298号的说明书的全部内容通过参考援引至本申请。
实施例
以下，列举实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不受下述实施例的限制，在能够符合上述/下述的主旨的范围当然可以适当进行变更而实施，它们均包含于本发明的技术范围内。
实施例1：从片段F1和片段F2制造片段F9
(1)Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-OH的制造
向Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-O(4-NBn)(0.82g，1.0mmol)添加Na2S2O4(0.86g，5.0mmol)、DMA(5mL)及水(0.5mL)，在90℃下搅拌了2小时。向反应溶液添加乙酸乙酯(8mL)和水(8mL)，进行分液和提取，得到了Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-OH作为片段F2。
(2)Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2的制造
向Boc-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(0.69g，1.1mmol)添加二氯甲烷(5mL)和甲磺酸(0.58g，6.0mmol)，在室温下搅拌了1.5小时。对反应溶液进行冰冷，添加三乙胺(0.62g，6.1mmol)，在室温下搅拌10分钟，然后将该反应液添加于上述实施例1(1)中得到的Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-OH的二氯甲烷溶液(6mL)。接着，添加HOBt·H2O(0.23g，1.5mmol)，最后添加EDC盐酸盐(0.29g，1.5mmol)，在室温下搅拌了16小时。接下来，使反应停止，通过提取，得到了Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(0.93mmol，纯度95.0％)作为片段F9。
实施例2：从片段F3和片段F4制造片段F10
(1)Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-OH的制造
向Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-O(4-NBn)(1.0g，0.94mmol)添加DMA(6g)、Na2S2O4(0.82g，4.7mmol)及水(0.6g)，在90℃下搅拌了2小时。然后，冷却至20℃，添加5％硫酸氢钾水溶液(40g)。滤取析出固体并进行减压干燥，由此得到了0.87g的Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-OH作为片段F4。
(2)Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)的制造
向Boc-Asn-Gly-O(4-NBn)(3.5g，8.3mmol)添加二氯甲烷(160mL)和甲磺酸(5.4g，56mmol)，搅拌了3小时。将反应溶液冰冷，添加三乙胺(5.8g，57mmol)并搅拌5分钟，由此将N末端脱保护。
向H-Asn-Gly-O(4-NBn)溶液添加上述实施例2(1)中得到的Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-OH(8.5g，7.0mmol)和HOOBt(2.0g，13mmol)，最后用3小时添加EDC盐酸盐(2.0g，10mmol)的水溶液(5.8mL)。在20℃下搅拌4小时后，添加水(160g)，滤取析出物，由此得到了Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)(9.7g，6.3mmol)作为片段F10。
实施例3：从片段F7和片段F8制造片段F11
(1)Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-OH的制造
向Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-O(4-NBn)(5.0g，5.9mmol)添加DMA(15g)、Na2S2O4(5.2g，30mmol)及水(1.1g)，在100℃下搅拌了3小时。冷却至10℃后，添加水(30g)和二氯甲烷(30g)，进行分液和提取，得到了Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-OH作为片段F8。
(2)Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-O(4-NBn)的制造
向Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-O(4-NBn)(6.3g，4.9mmol)添加二氯甲烷(11g)和甲磺酸(2.4g，25mmol)，搅拌了2小时。将反应溶液冰冷，添加三乙胺(2.6g，25mmol)并搅拌15分钟后，依次添加上述实施例3(1)中得到的Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-OH溶液(42g，5.9mmol)、HOBt·H2O(1.1g，7.4mmol)、EDC盐酸盐(1.4g，7.4mmol)。在0℃下搅拌18小时后，添加了5％碳酸钠水溶液(60g)。通过滤取析出的固体，得到了Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-O(4-NBn)(8.6g，4.6mmol，纯度93.5％)作为片段F11。
实施例4：从片段F5和片段F10制造片段F12
(1)Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OH的制造
向Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-O(4-NBn)(8.5g，7.2mmol)添加DMA(60mL)、Na2S2O4(6.2g，36mmol)及水(6mL)，在90℃下搅拌了4小时。然后，添加水(60mL)，冷却至室温，添加乙酸乙酯(60mL)，在室温下搅拌了2小时。滤取析出的固体，并用水和乙酸乙酯进行清洗，由此获得了Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OH(7.5g，7.2mmol，纯度：96.5％)作为片段F5。
(2)Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)的制造
向上述实施例2中得到的Boc-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)(9.5g，6.2mmol)添加二氯甲烷(105mL)和甲磺酸(3.0g，31mmol)，搅拌了1小时。将反应溶液冰冷，添加三乙胺(2.8g，28mmol)并搅拌了5分钟。进一步添加DMA(146g)，升温至20℃。
向上述反应液添加上述实施例4(1)中得到的Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OH(6.5g，6.2mmol)及HOOBt(1.5g，9.3mmol)，最后用5小时添加了EDC盐酸盐(1.8g，9.3mmol)的DMA溶液(311mL)。在20℃下搅拌13小时，然后在30℃下搅拌了17小时。进一步添加HOOBt(0.25g，1.6mmol)、EDC盐酸盐(0.30g，1.6mmol)、Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-OH(0.97g，0.94mmol)、以及三乙胺(0.22g，2.2mmol)，搅拌了15小时。然后，添加水(570mL)，将一部分在40℃下减压浓缩后，再添加水(285mL)。冷却至0℃，并滤取析出物，由此得到了Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)(15.7g)作为片段F12。
实施例5：从片段F9和片段F12制造片段F13
(1)Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-OH的制造
向上述实施例4中得到的Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-O(4-NBn)(15g，6.1mmol)添加DMA(90g)，加热至55℃。接着，添加水(9.0g)和Na2S2O4(5.3g，30mmol)，加热至90℃。在90℃下搅拌2小时后，添加水(90g)，滤取析出物，得到了Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-OH(13.4g，5.8mmol)作为片段F12。
(2)Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2的制造
向上述实施例1中得到的Boc-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(7.1g，5.8mmol)的二氯甲烷溶液(96g)添加甲磺酸(3.7g，39mmol)，搅拌了3小时。将反应溶液冰冷，添加三乙胺(4.2g，41mmol)，搅拌了5分钟。进一步添加DMA(106g)后，减压馏去二氯甲烷。
接着，添加上述实施例5(1)中得到的Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-OH(11.2g，4.8mmol)、DMA(106g)及HOOBt(1.6g，9.7mmol)，最后添加EDC盐酸盐(1.9g，9.7mmol)，搅拌了2小时。进一步每隔1小时添加EDC盐酸盐(0.46g，2.4mmol)和三乙胺(0.24g，2.4mmol)共3次，搅拌1小时，然后添加三乙胺(0.49g，4.8mmol)，搅拌了13小时。添加水(106g)并滤取析出物，由此得到了Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(13.3g，3.9mmol)作为片段F13。
实施例6：从片段F13和片段F6制造片段F14
(1)Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH的制造
向Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-O(4-NBn)(1.0g、0.69mmol)添加DMA(6.0g)、水(0.6g)及Na2S2O4(1.2g，6.9mmol)，在90℃下搅拌4小时。接着，添加水(60g)并滤取析出的固体，由此得到了Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH(0.89g，0.68mmol，纯度94.6％)作为片段F6。
(2)Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2的制造
向上述实施例5中得到的Boc-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(13g，3.8mmol)添加二氯甲烷(104g)。接着，添加甲磺酸(7.3g，76mmol)，搅拌了2小时。将反应溶液冰冷，添加三乙胺(8.3g，82mmol)，搅拌了5分钟。添加DMA(169g)，并添加上述实施例6(1)中得到的Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH(3.9g，3.0mmol)及HOOBt(1.2g，7.6mmol)。接着，每隔30分钟添加EDC盐酸盐(0.36g，1.9mmol)共4次，搅拌1小时后，添加Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH(2.0g，1.5mmol)，搅拌了2小时。再次添加三乙胺(0.19g，1.9mmol)及EDC盐酸盐(0.36g，1.9mmol)，搅拌了13小时。添加水(273g)并减压浓缩后，再次添加水(104g)，滤取析出的固体，由此得到了Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(16.1g)作为片段F14。
实施例7：从片段F14和片段F11制造片段F15
(1)Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH的制造
向上述实施例3中得到的Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-O(4-NBn)(11mmol)添加DMSO(81g)，升温至45℃。添加Na2S2O4(5.6g，32mmol)，在65℃下搅拌7小时后，再次添加Na2S2O4(1.9g，11mmol)，搅拌了3小时。添加水(0.58g)及Na2S2O4(2.8g，16mmol)，搅拌1小时后，在70℃下搅拌了3小时。冷却至20℃后，添加水(302g)，滤取析出物，由此得到了Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH(20g)作为片段F11。
(2)Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2的制造
向上述实施例6中得到的Boc-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(15g，3.2mmol)添加二氯甲烷(177g)。接着，添加甲磺酸(9.3g，96mmol)，搅拌了2小时。将反应溶液冰冷，添加三乙胺(10g，103mmol)，搅拌了5分钟。添加DMA(177g)，并进一步添加上述实施例7(1)中得到的Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH(6.1g，3.5mmol)及HOOBt(1.1g，6.4mmol)。接着，添加EDC盐酸盐(1.2g，6.4mmol)，搅拌了4小时。进一步添加Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH(0.56g，0.32mmol)，搅拌3小时，然后对反应溶液进行减压浓缩。向残渣添加水(354g)，冷却至10℃后，滤取析出的固体，由此得到了Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(19.3g)作为片段F15。
实施例8：艾塞那肽的制造
向上述实施例7中得到的Boc-His(BOM)-Gly-Glu(OBzl)-Gly-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Ser(Bzl)-Lys(Cl-Z)-Gln-Met(O)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Val-Arg(Z)2-Leu-Phe-Ile-Glu(OBzl)-Trp(CHO)-Leu-Lys(Cl-Z)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(Bzl)-NH2(1.0g，0.2mmol)添加二氯甲烷(15g)。接着，添加甲磺酸(1.2g，13mmol)，搅拌了1小时。将反应溶液冰冷后，加入DMF(10g)进行减压浓缩。接下来，在氢气体氛围中，使用Pd/C实施氢化反应，然后加入哌啶，获得了艾塞那肽。
Claims (13)
1.一种用于制造长链肽的方法，该方法包括：
工序A，使用磺酸类将下述式(I)所示的化合物的N末端选择性地脱保护，得到下述式(II)所示的化合物，然后，添加碱性化合物将反应液中和，
Boc-(AA1)m-Pro1···(I)
H-(AA1)m-Pro1···(II)
式中，Boc表示作为N末端的保护基团的叔丁氧羰基，(AA1)m表示反应性侧链官能团被保护的肽链，m表示2以上且50以下的整数，Pro1表示C末端的保护基团；
工序B，将下述式(III)所示的化合物的C末端选择性地脱保护，得到下述式(IV)所示的化合物，
Boc-(AA2)n-ONBn···(III)
Boc-(AA2)n-OH···(IV)
式中，(AA2)n表示反应性侧链官能团被保护的肽链，n表示2以上且50以下的整数，NBn表示下述式(V)所示的硝基苄基，式(V)中，p、q及r独立地表示0或1，p+q+r表示1、2或3，
工序C，向所述工序A的反应液添加上述式(IV)所示的化合物，使上述式(II)所示的化合物与上述式(IV)所示的化合物缩合，得到下述式(VI)所示的化合物，
Boc-(AA2)n-(AA1)m-Pro1···(VI)
式(VI)中，Boc、(AA2)n、n、(AA1)m、m、以及Pro1表示与上述相同的含义。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序B中，使用金属和酸的组合、或连二亚硫酸类将C末端选择性地脱保护。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，作为所述磺酸类，使用选自甲磺酸、三氟甲磺酸、以及对甲苯磺酸中的1种以上磺酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，作为所述碱性化合物，使用有机胺化合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，作为所述有机胺化合物，使用三乙胺及二异丙基乙胺中的至少一者。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，使用Pro1为ONBn且所述工序C中得到的上述式(VI)所示的化合物作为所述工序B中的上述式(III)所示的化合物，重复多次所述工序A～C。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，使用Pro1为NH2或ONBn且所述工序C中得到的上述式(VI)所示的化合物作为所述工序A中的上述式(I)所示的化合物，重复多次所述工序A～C。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其进一步包括：
至少将上述式(VI)所示的化合物的反应性侧链官能团脱保护的工序。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，在所述工序C中使用溶剂，使用酰胺类溶剂作为该溶剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，作为所述酰胺类溶剂，使用选自二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、以及二丁基甲酰胺中的1种以上酰胺类溶剂。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述长链肽为艾塞那肽。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，使用具有下述氨基酸序列的肽片段，
F1：Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
F2：Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
F3：Asn-Gly
F4：Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys
F5：Glu-Ala-Val-Arg-Leu
F6：Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu
F7：Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu
F8：His-Gly-Glu-Gly
使用N末端被Boc保护且C末端被Pro1保护的所述肽片段Fs作为上述式(I)所示的化合物，而且使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段Fs+1作为上述式(III)所示的化合物，使所述肽片段Fs与所述肽片段Fs+1缩合，其中，s表示1以上且7以下的任意整数。
13.根据权利要求12所述的方法，该方法包括：
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F1作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F2作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F9的工序，
F9：Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F3作为所述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F4作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F10的工序，
F10：Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly；
使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F7作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F8作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F11的工序，
F11：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu；
使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F10作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F5作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F12的工序，
F12：Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly；
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F9作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F12作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F13的工序，
F13：Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F13作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F6作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F14的工序，
F14：Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
使用N末端被Boc保护且C末端被NH2保护的所述肽片段F14作为上述式(I)所示的化合物，使用N末端被Boc保护且C末端被ONBn保护的所述肽片段F11作为上述式(III)所示的化合物，制造具有下述氨基酸序列的肽片段F15的工序，
F15：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；以及
将所述肽片段F15的N末端及反应性侧链官能团脱保护的工序。
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