CN103333237A - 一种固相片段法合成艾塞那肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种如式Ⅰ所示的艾塞那肽的固相合成制备方法，将Fmoc-树脂和脱保护剂混合，得到脱保护树脂后，将Fmoc-氨基酸和脱保护树脂缩合，得到Fmoc-氨基酸-树脂；重复上述脱Fmoc保护和将Fmoc-氨基酸同树脂上的多肽缩合的步骤，将氨基酸自C端向N端按顺序依次同树脂上的多肽缩合，形成多肽树脂，其特征在于，所述方法包括步骤：（1）分别形成如式Ⅱ和式Ⅲ所示的多肽树脂片段；（2）将式Ⅲ进行切割，得到侧链全保护的如式Ⅳ所示的多肽片段；（3）将如式Ⅳ所示的侧链全保护的多肽片段偶联至如式Ⅱ所示的多肽树脂片段上，并脱Fmoc，得到如式Ⅴ所示的多肽树脂；（4）依次偶联剩余的十个Fmoc-氨基酸，并脱Fmoc，得到如式Ⅵ所示的艾塞那肽-Rink Amide树脂；（5）将如式VI所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ⅰ所示的艾塞那肽。
Description
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，特别涉及固相片段法合成艾塞那肽。
背景技术
艾塞那肽是由39个氨基酸组成的多肽，其序列为：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。艾塞那肽的氨基酸顺序与人胰高糖素样肽-1(GLP-1)有53%的同源性，与GLP-1受体具有高度亲和力，也具有显著的降血糖作用，与GLP-1具有相同的生理功能。在血糖升高时刺激体内产生胰岛素，在饭后抑制胰高血糖素的分泌，减慢血液摄取营养的速度和减少食物摄入量。艾塞那肽为皮下注射针剂，用于二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍与磺酰脲类联合应用不能充分控制血糖的II型糖尿病患者。
目前艾塞那肽的合成方法有生物合成法与化学合成法两种，生物合成法主要是利用人工基因重组方式得到艾塞那肽全序列（如CN1635117、CN1693459）,该方法存在表达量不高，合成规模不大的缺点。化学合成法主要是利用多肽合成技术，将保护氨基酸逐个偶联成艾塞那肽。现有技术US6924264、US6902744、US7157555中，艾塞那肽的制备均采用传统的固相合成法。该方法由于肽比较长，存在某些氨基酸偶联反应不完全、合成周期长的特点。
因此，本领域迫切需要提供一种新的固相合成艾塞那肽的工艺。
发明内容
本发明旨在提供一种新的固相合成艾塞那肽的工艺。
本发明中提供了一种如式Ⅰ所示的艾塞那肽的固相合成制备方法，将Fmoc-树脂和脱保护剂混合，得到脱保护树脂后，将Fmoc-氨基酸和脱保护树脂缩合，得到Fmoc-氨基酸-树脂；重复上述脱Fmoc保护和将氨基酸同树脂上的多肽缩合的步骤，将氨基酸自C端向N端按顺序依次同树脂上的多肽缩合，形成多肽树脂，所述方法包括步骤：
（1）分别形成如式Ⅱ和式Ⅲ所示的多肽树脂片段；
（2）将式Ⅲ进行切割，得到侧链全保护的如式Ⅳ所示的多肽片段；
（3）将如式Ⅳ所示的侧链全保护的多肽片段偶联至如式Ⅱ所示的多肽树脂片段上，并脱Fmoc，得到如式Ⅴ所示的多肽树脂；
（4）依次偶联剩余的十个Fmoc-氨基酸，并脱Fmoc，得到如式Ⅵ所示的艾塞那肽-Rink Amide树脂；
（5）将如式VI所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ⅰ所示的艾塞那肽；
。
在另一优选例中，形成如式Ⅱ所示的多肽树脂片段时使用Fmoc-Rink AmideAM树脂。
在另一优选例中，形成如式Ⅲ所示的多肽树脂片段时使用CTC树脂。
在另一优选例中，步骤（2）中用于切割树脂上的侧链全保护肽的试剂选自0.1%-10%TFA的DCM溶液或TFE、HOAc及DCM的混合溶液。
在另一优选例中，所述的步骤（3）中将如式Ⅳ所示的侧链全保护的多肽片段偶联至如式Ⅱ所示的多肽树脂片段上的缩合剂选自下述的一种或一种以上的组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM。
在另一优选例中，脱除Fmoc的方法为用20%哌啶的DMF溶液，且该溶液含有0.5-10%的HOBt，脱除Fmoc2-4次，每次时间为5-30min。
在另一优选例中，步骤（5）中将如式VI所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离的试剂选自以下各组：
三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；
三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯甲醚的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；或
三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水、苯酚、苯甲硫醚的体积比为80-85：2-5：2-5：2-5：2-5，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚。
据此，本发明提供了一种新的固相合成艾塞那肽的工艺。
附图说明
图1是本发明制备艾塞那肽的合成工艺流程图。
图2是实施例6得到的艾塞那肽粗肽的HPLC图谱；其中各峰情况如下表所示：
图3是实施例6得到的艾塞那肽纯肽的LC-MS图谱。
具体实施方式
发明人经过深入研究和探索，发现了一种与传统的固相合成法不同的固相片断法合成艾塞那肽，其中的区别在于中间的十一个氨基酸是以全保护多肽片段的形式偶联，而不是逐个氨基酸的偶联。发明人选择的该全保护多肽片段包括了传统固相合成法中比较难偶联的几个氨基酸，因此使得合成的效率大大提高了的同时合成的周期也得以缩短。
在片段选择上，当片段选择太短，很难沉淀出固体，发明人通过片段法11+10+18，绕开了困难序列。
本文中所使用的化合物、化学基团和试剂等的表示方法均为所属领域公认的表示方法。为了方便查阅，以下将列出本文中所用到的缩略语及其具体名称：
如本文所用，“固相合成”或“多肽固相合成（solid phase peptidesynthesis）”是一种本领域熟知的多肽合成技术，包括但不限于下述方法：将一个氨基被保护的氨基酸共价连接（键合）在固相载体上；在去保护剂存在下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸接到固相载体上；然后氨基被封闭（保护）的第二个氨基酸的羧基通过活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应（缩合）形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去氨基的保护基，水解肽链和固相载体之间的酯键（切割），得到合成好的肽。
如本文所用，“去保护剂”或“脱保护剂”可以互换使用，都是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂可以使本领域熟知的，例如但不限于，Fmoc，Boc。
如本文所用，“缩合剂”、“活化剂”、或“缩合活化剂”可以互换使用，都是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，DIC、HATU、TBTU、DIPEA。
如本文所用，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。
如本文所用，“Rink Amide Linker”是一种多肽合成中用到的连接臂，结构如式Ⅲ所示，分子式为C32H29NO7，分子量为539.58，CAS号为145069-56-3
如本文所用，“艾塞那肽粗品”是指HPLC纯度在40%-75%的艾塞那肽产品。
具体地，本发明提供的艾塞那肽固相合成方法包括以下步骤：
第一步，分别固相制备肽树脂片段（式Ⅱ和式Ⅲ）；
第二步，将式Ⅲ进行切割，得到侧链全保护的多肽片段（式Ⅳ）；
第三步，将侧链全保护的多肽片段（式Ⅳ）偶联至肽树脂（式Ⅱ）上，并脱Fmoc，得到多肽树脂（式Ⅴ）；
第四步，通过固相合成的方法依次偶联剩余的十个保护氨基酸，并脱Fmoc，得到艾塞那肽-Rink Amide Resin（式Ⅵ）；
第五步，式Ⅵ所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ⅰ所示的艾塞那肽。
上述第一步中所述的如式Ⅱ所示的肽树脂片段的合成是通过将0.2-1.0mmol/g的Fmoc-Rink Amide AM resin脱保护，得到Rink Amide AMresin，然后和Fmoc-Ser(tBu)反应，得到Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM rein；利用固相合成的方法依次偶联带有保护基团的氨基酸：Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH，然后脱除Fmoc，得到侧链带保护基的肽树脂H-[22-39]-Rink Amide AM resin(式Ⅱ)。
上述第一步中所述的如式Ⅲ所示的肽树脂片段的合成是通过将Fmoc-Leu-OH和0.5-1.5mmol/g的CTC resin在DIPEA的作用下缩合后，再脱除Fmoc，得到H2N-Leu-CTC resin；然后用缩合剂依次偶联Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)OH，得到Fmoc-[11-21]-CTC resin(式Ⅲ)。
上述第二步中用于切割树脂上的侧链全保护肽的溶液为0.1%-10%TFA的DCM溶液或者TFE、HOAc及DCM的混合液；优选为1%TFA的DCM溶液。
上述第三步中将侧链全保护的多肽片段（式Ⅳ）偶联至肽树脂（式Ⅱ）上的缩合剂为下述缩合剂的一种或多种组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIEA、NMM，优选为HATU/HOBt/DIEA的组合。
上述第四步中依次偶联剩余的十个保护氨基酸为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，所用的缩合剂为下述缩合剂的一种或多种组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM，优选为DIC/HOBt的组合。
上述第五步中多肽树脂上的多肽和树脂分离的试剂为下列三组条件之一：①、三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；②、三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯甲醚的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；③、三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水、苯酚、苯甲硫醚的体积比为80-85：2-5：2-5：2-5：2-5，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚。
在本发明的一个优选实施例中，在完成了上述五步后用冰冻乙醚沉淀，得到粗肽，粗肽经过高效液相色谱纯化、冻干得到纯化的如式Ⅰ所示的艾塞那肽。
有关茚三酮显色法（Kaiser）、水合茚三酮试验（Ninhydrin test），及其监控方法可以参见文献VIRENDER K.SARIN,et al.“Quantitative Monitoringof Solid-Phase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction”ANALYTICALBIOCHEMISTRY117，147－157（1981）、E.KAISER,et al.“Color Test forDetection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis ofPeptides”SHORT COMMUNICATIONS595-598(Received October28,1969)、和THORKILD CHRISTENSEN“A Qualitative Test for Monitoring CouplingCompleteness in Solid Phase Peptide Synthesis Using Chloranil”ActaChemica Scandinavica B33(1979)763-766。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的艾塞那肽固相合成方法效率高，合成周期短。
2、本发明的艾塞那肽固相合成方法氨基酸偶联反应完全。
3、本发明的艾塞那肽固相合成方法缺损杂质明显减少，粗产物的HPLC纯度要明显高于逐步偶联法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明艾塞那肽纯度检测方法为：
艾塞那肽分析方法
流动相：A：水+0.1%三氟乙酸（TFA）
B：乙腈（ACN）+0.1%三氟乙酸（TFA）
柱子：XBridge C185μm4.6*250mm
柱温：25℃
检测波长：214nm
梯度洗脱方式：
| 时间(分钟) | A(%) | B(%) |
| 0 | 75 | 25 |
| 20 | 45 | 55 |
| 20.2 | 5 | 95 |
| 25 | 5 | 95 |
| 25.2 | 75 | 25 |
| 30 | 75 | 25 |
本发明艾塞那肽的纯化方法为：
流动相：A：水+0.1%三氟乙酸（TFA）
B：乙腈（ACN）+0.1%三氟乙酸（TFA）
柱子：Kromasil C1810μm30*250mm
梯度洗脱方式：
| 时间(分钟) | A(%) | B(%) |
| 0 | 75 | 25 |
| 60 | 45 | 55 |
| 60.2 | 5 | 95 |
| 80 | 5 | 95 |
实施例1
侧链带保护基的肽树脂H-[22-39]-Rink Amide AM resin
1：Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM resin的合成
(1)Fmoc-Rink Amide AM resin（天津南开和成科技有限公司生产，替代度为0.8mmol/g，10g）投入固相反应柱，用DMF洗两次，DMF溶胀30分钟。
⑵抽干溶液，以20%的哌啶的DMF溶液，室温下，去Fmoc两次，时间分别为10min和20min。
⑶抽干溶液，树脂用DMF洗六次。
⑷将Fmoc-Ser(tBu)-OH（9.20g）、HOBt(4.86g)用DMF(30mL)、DCM(30mL)溶解，加入DIPCDI(7.52ml)，于冰浴中预反应10分钟。
⑸将上述反应液加入固相反应釜中，机械搅拌，室温下反应3小时，茚三酮检测，树脂无色透明。
(6)抽干溶液，树脂用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，真空充分抽干，即得到Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM resin(13.03g)，测得替代度为0.59mmol/g。
2：H-[22-39]-Rink Amide AM resin的合成
⑴Fmoc-Ser(tBu)-Rink Amide AM resin13.03g投入固相反应釜中，用DMF洗三次，DMF溶胀20分钟。
⑵抽干溶液，以20%的哌啶的DMF溶液，加入2%（g/mL）的HOBt，室温下，去Fmoc两次，时间分别为10min和20min。
⑶抽干溶液，树脂用DMF洗五次，DCM洗涤两次，茚三酮检测呈阳性。
⑷将Fmoc-Pro-OH（8.10g）、HOBt(4.86g)，用DMF(60mL)溶解，加入DIPCDI(7.52ml)，于冰浴中预反应10分钟。
(5)上述反应液加入固相反应柱中，机械搅拌，室温下反应3小时，用茚三酮检测，树脂无色透明。
⑹抽干溶液，树脂用DMF洗三次。
(7)重复上述（2）至（6）的步骤，依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH，然后脱除Fmoc，得到侧链带保护基的肽树脂H-[22-39]-Rink Amide AM resin
实施例2
侧链带保护基的肽树脂Fmoc-[11-21]-CTC resin
1、Fmoc-Leu-CTC resin的合成
称取替代度为1.1mmol/g的CTC树脂30g，加到固相反应釜中，用DMF洗涤两次。称取Fmoc-Leu-OH17.49g，加入200mL的DMF溶解，再加入20.20mLDIPEA，搅拌5min后，加到固相反应釜中，反应2小时。抽干反应液，用DMF洗涤三次。加入60mL甲醇和180mL DMF及15mL的DIPEA的混合液，封闭30min。用DMF洗涤3次，DCM洗涤两次，甲醇洗涤两次，抽干。得到43.07g的Fmoc-Leu-CTC resin，经测量，替代度为0.75mmol/g。
2、Fmoc-[11-21]-CTC resin的合成
(1)43.07g的Fmoc-Leu-CTC resin投入固相反应釜中，用DMF洗三次，DMF溶胀20分钟
(2)抽干溶液，以20%的哌啶的DMF溶液，加入2%（g/mL）的HOBt，室温下，去Fmoc两次，时间分别为10min和20min。
(3)抽干溶液，树脂用DMF洗五次，DCM洗涤两次，茚三酮检测呈阳性。
(4)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH（62.87g）、HOBt(13.09g)，用DMF(18L)溶解，加入于DIPCDI(30.37ml)，冰浴中预反应10分钟。
(5)上述反应液加入固相反应柱中，机械搅拌，室温下反应3小时，用茚三酮检测，树脂无色透明。
(6)抽干溶液，树脂用DMF洗三次。
(7)重复上述（2）至（6）的步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，得到8935g Fmoc-[11-21]-CTC resin。
实施例3
把Fmoc-[11-21]-OH从Fmoc-[11-21]-CTC Resin上切割下来
往89.35g Fmoc-[11-21]-CTC resin中加入1%的TFA的DCM溶液200mL，搅拌反应2小时。反应结束后，过滤树脂，收集滤液，加入含20%的DIPEA/DCM溶液中和至pH值为7左右。旋转掉DCM，用水和乙醚洗涤沉淀，离心、干燥，得到54.26g Fmoc-[11-21]-OH。
实施例4
将Fmoc-[11-21]-OH偶联至H-[22-39]-Rink Amide AM resin上
将54.26g Fmoc-[11-21]-OH、HATU（9.97）、HOBt(6.84g)，用DMF(120mL)溶解，加入于DIPEA(8.36mL)，冰浴中预反应10分钟。把该反应液加入到装有H-[22-39]-Rink Amide AM resin的固相反应釜中，反应12小时。用茚三酮检测，树脂无色透明。抽干溶液，树脂用DMF洗三次，得到Fmoc-[11-39]-RinkAmide AM resin。
实施例5
将剩余的十个保护氨基酸偶联至Fmoc-[11-39]-Rink Amide AM resin
(1)往Fmoc-[11-39]-Rink Amide AM resin中加入含有2%（g/mL）的HOBt的20%的哌啶的DMF溶液，室温下，去Fmoc两次，时间分别为10min和20min。
(2)抽干溶液，树脂用DMF洗五次，DCM洗涤两次，茚三酮检测呈阳性。
(3)将Fmoc-Leu-OH（8.15g）、HOBt(4.86g)，用DMF(80mL)溶解，加入DIPCDI(7.52ml)，于冰浴中预反应10分钟
(4)上述反应液加入固相反应柱中，机械搅拌，室温下反应3小时，用茚三酮检测，树脂无色透明。
(5)抽干溶液，树脂用DMF洗三次。
(6)重复上述（1）至（5）的步骤，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)。
（7）加入2L/次的甲醇收缩树脂，一共收缩3次。抽干，真空干燥后得到侧链保护的艾塞那肽树脂共48.83g。
实施例6
艾塞那肽树脂的裂解
往装有48.83g艾塞那肽树脂的固相反应器中加入45L的裂解液，裂解液的比例为：TFA/EDT/TIS/H2O=90/5/3/2，先在0-5℃反应20min，然后升至室温再反应1.5h。反应结束，过滤掉树脂，滤液旋转至小于200mL后，加到1L冷冻的乙醚中。离心、用乙醚洗涤2次，真空干燥，得到艾塞那肽粗肽25.15g，纯度71.2%。粗品经过多次制备，得到HPLC纯度大于99%的艾塞那肽纯品，见图2和图3。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (7)
1.一种如式Ⅰ所示的艾塞那肽的固相合成制备方法，将Fmoc-树脂和脱保护剂混合，得到脱保护树脂后，将Fmoc-氨基酸和脱保护树脂缩合，得到Fmoc-氨基酸-树脂；重复上述脱Fmoc保护和将氨基酸同树脂上的多肽缩合的步骤，将氨基酸自C端向N端按顺序依次同树脂上的多肽缩合，形成多肽树脂，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）分别形成如式Ⅱ和式Ⅲ所示的多肽树脂片段；
（2）将式Ⅲ进行切割，得到侧链全保护的如式Ⅳ所示的多肽片段；
（3）将如式Ⅳ所示的侧链全保护的多肽片段偶联至如式Ⅱ所示的多肽树脂片段上，并脱Fmoc，得到如式Ⅴ所示的多肽树脂；
（4）依次偶联剩余的十个Fmoc-氨基酸，并脱Fmoc，得到如式Ⅵ所示的艾塞那肽-Rink Amide树脂；
（5）将如式VI所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ⅰ所示的艾塞那肽；
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，形成如式Ⅱ所示的多肽树脂片段时使用Fmoc-Rink Amide AM树脂。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，形成如式Ⅲ所示的多肽树脂片段时使用CTC树脂。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中用于切割树脂上的侧链全保护肽的试剂选自0.1%-10%TFA的DCM溶液或TFE、HOAc及DCM的混合溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）中将如式Ⅳ所示的侧链全保护的多肽片段偶联至如式Ⅱ所示的多肽树脂片段上的缩合剂选自下述的一种或一种以上的组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，脱除Fmoc的方法为用20%哌啶的DMF溶液，且该溶液含有0.5-10%的HOBt，脱除Fmoc2-4次，每次时间为5-30min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中将如式VI所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离的试剂选自以下各组：
三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；
三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯甲醚的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；或
三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水、苯酚、苯甲硫醚的体积比为80-85：2-5：2-5：2-5：2-5，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚。
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